賀梅娟 楊若瀕 楊晉翔 安 靜

(北京市豐臺(tái)區(qū)盧溝橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，北京 100165)

實(shí) 驗(yàn) 研 究

益氣化瘀解毒法對(duì)慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠DNA甲基化酶3b基因的影響※

賀梅娟 楊若瀕 楊晉翔1安 靜1

(北京市豐臺(tái)區(qū)盧溝橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，北京 100165)

目的 觀察益氣化瘀解毒法對(duì)慢性萎縮性胃炎伴異型增生模型大鼠DNA甲基化酶3b(DNMT3b)基因的影響。方法 將60只SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為造模組50只、空白組10只。造模成功后將造模組剩余的33只大鼠隨機(jī)分為模型組、維酶素組、消痞顆粒組，每組11只。模型組予0.9%氯化鈉注射液，維酶素組予維酶素懸濁液，消痞顆粒組予消痞顆粒中藥制備藥液，各組均每日灌胃1次，連續(xù)治療12周后檢測(cè)各組大鼠DNMT3b蛋白表達(dá)量。結(jié)果 維酶素組、模型組DNMT3b蛋白表達(dá)量較空白組均明顯升高(P<0.01)；消痞顆粒組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。維酶素組、消痞顆粒組DNMT3b蛋白表達(dá)量較模型組降低(P<0.01)；消痞顆粒組低于維酶素組(P<0.01)。結(jié)論 中醫(yī)益氣化瘀解毒法可以逆轉(zhuǎn)胃黏膜異型增生，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)DNMT3b而實(shí)現(xiàn)的。

益氣祛瘀；解毒；胃炎,萎縮性；增生；大鼠,Wistar；基因；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均居第3位[1]。異型增生、腸化生以及導(dǎo)致二者出現(xiàn)的慢性萎縮性胃炎是胃癌較為常見(jiàn)的早期病變。現(xiàn)階段世界范圍內(nèi)對(duì)胃癌尚無(wú)有效治療手段，因此加強(qiáng)對(duì)胃癌的防御有重大意義，該方面的研究逐漸引起了許多專家與學(xué)者的關(guān)注。最新研究表明，胃癌成因較復(fù)雜，并不是由單一因素所引起，有研究表明，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的高甲基化狀態(tài)可導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2-3]，而抑癌基因CpG島高甲基化與DNA甲基化酶(DNMT)的高表達(dá)密切相關(guān)，DNMT3b是DNMT之一，其失活或突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。本研究通過(guò)建立慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠模型,觀察益氣化瘀解毒法對(duì)DNMT3b的影響,為臨床防治胃癌前病變,降低胃癌的發(fā)病率提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 共選取SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，4周齡，體質(zhì)量約100 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥物 消痞顆粒(藥物組成：黨參、炙百合、烏藥、香櫞、丹參、三七粉、莪術(shù)、蒲公英、白花蛇舌草),由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院制劑室制成含生藥9 g/g的沖劑,使用時(shí)配制成濃度為0.36 g/mL的藥液;維酶素片(河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13023904,批號(hào)20090506)，碾成粉末狀，配制成濃度為0.15 g/mL的懸濁液,濾去糖衣沉渣備用;N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，產(chǎn)品編號(hào)M0527)，用去離子水配制成1 g/L的母液,存放于4 ℃冰箱備用，使用時(shí)用SPF級(jí)動(dòng)物飲用水稀釋為120 μg/mL的溶液,整個(gè)過(guò)程均需避光操作保存;雷尼替丁飼料,鹽酸雷尼替丁膠囊(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H13022873，批號(hào)：100902256)，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司制成含0.03%雷尼替丁的顆粒狀SPF級(jí)大鼠飼料;氨水由西隴化工有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：1503232，每日用SPF級(jí)動(dòng)物飲用水配制成0.05%的溶液。

1.1.3 儀器 Allgre 21R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；MK3酶標(biāo)儀(Thermo公司)；VE180小型高通量電泳槽(上海天能公司)；VE186轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能公司)；PowerPac HC高電流電源(美國(guó)伯樂(lè)公司)；酸堿度測(cè)試儀(德國(guó)Sartorius公司)；振蕩機(jī)(其林貝爾公司)；勻漿機(jī)(瑞士Fluka公司)。

1.1.4 試劑 BCA蛋白定量試劑盒(北京康為公司)；Protein ladder(北京博邁德生物)；PVDF膜(0.45 μm，Millipore公司)；一抗DNMT3b為兔單克隆抗體(Abcam公司，貨號(hào):ab16049)；二抗為辣根酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Jackson公司，貨號(hào):111-035-003)。

1.2 分組及造模 將60只大鼠隨機(jī)分為2組，空白組10只，造模組50只。空白組大鼠給予普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。造模組大鼠予分籠喂養(yǎng)，每日飲用濃度為0.05%的氨水，氨水溶液須每日更新1次；采用0.03%的雷尼替丁飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，同時(shí)每日予120 μg/mL的MNNG灌胃，每只5 mL/kg，一直持續(xù)到第32周。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中于第20、24、26、28、30、32周末從造模組當(dāng)中的大鼠中隨機(jī)抽取2只大鼠，在完成造模之后，將存活的33只(造模期間死亡5只)大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、維酶素組、消痞顆粒組，每組11只，均以普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。模型組大鼠在普通喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予0.9%氯化鈉注射液3 mL/kg灌胃，維酶素組大鼠在普通喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予維酶素懸濁液2 mL/kg灌胃，消痞顆粒組大鼠在普通喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予消痞顆粒藥液3 mL/kg灌胃，灌胃每日1次，持續(xù)12周。在第44周末，本實(shí)驗(yàn)所有大鼠以戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉注射，進(jìn)行全胃摘除，在摘除完成之后，需快速將胃沿大彎處切開(kāi)，并用低溫0.9%氯化鈉注射液對(duì)胃的內(nèi)容物進(jìn)行清洗，將胃竇部黏膜封存，存儲(chǔ)在液氮當(dāng)中，并保持其溫度≤-80 ℃。大鼠摘胃后均處死。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 將胃黏膜組織從液氮中取出，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進(jìn)行快速研磨，然后裝入預(yù)冷的EP管中，預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑(磷酸化蛋白需要同時(shí)加入磷酸酶抑制劑)。組織按照10%勻漿，即10 mg組織加入100 μL RIPA裂解液，充分裂解。冰上孵育20 min后，13 000 r/min，4 ℃，離心20 min。取上清，分裝-80 ℃保存。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)樣品數(shù)量，試劑A∶B=50∶1配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定；完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μL稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL；將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，并用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足20 μL；將待測(cè)樣品滴加至樣品孔中，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min；測(cè)定A570 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并計(jì)算蛋白濃度。分別取60 μg總蛋白與上樣液混合，上樣前煮沸5 min，將蛋白加入點(diǎn)樣孔，電泳初始電壓90 V，溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至120 V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)泳出分離膠的下緣。濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流，0.45 μm孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間150 min，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，PVDF膜取出標(biāo)記膜的方向。將膜完全浸沒(méi)于5%牛血清三羥甲基氨基甲烷緩沖液(BSA-TBST)中，水平搖床孵育1 h。5%BSA-TBST稀釋一抗，1∶1 000，4 ℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日，TBST洗3次，每次10 min。5%BSA-TBST稀釋二抗，1∶10 000，室溫孵育45 min。TBST洗膜3次，每次10 min。加入顯影液，暗室顯色，掃描膠片，用Genpro32軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行灰度分析，經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

各組DNMT3b蛋白表達(dá)量比較見(jiàn)表1、圖1。

組 別nDNMT3b蛋白表達(dá)量空白組100.169±0.013模型組110.246±0.014*維酶素組110.240±0.019*△消痞顆粒組110.164±0.010△#

與空白組比較，*P<0.01;與模型組比較，△P<0.01；與維酶素組比較，#P<0.01

1為空白組；2為模型組；3為維酶素組；4為消痞顆粒組

由表1、圖1可見(jiàn)，維酶素組、模型組DNMT3b蛋白表達(dá)量較空白組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；消痞顆粒組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。維酶素組、消痞顆粒組DNMT3b蛋白表達(dá)量較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；消痞顆粒組低于維酶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因異常的累積過(guò)程，其中抑癌基因CpG島高甲基化是重要致病因素之一,在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[5-6]。DNA甲基化是由DNMT催化完成的，DNMT是參與DNA甲基化修飾的重要功能蛋白，其作用是在S-腺苷酰-L-甲硫氨酸提供甲基的條件下，催化DNA分子胞嘧啶5號(hào)碳原子結(jié)合上甲基團(tuán)，形成5-甲基胞嘧啶,生成甲基化DNA[7]。一般認(rèn)為哺乳動(dòng)物的DNMT有4種，DNMT1在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化，DNMT3則催化CpG從頭甲基化，DNMT3包括2個(gè)從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a、DNMT3b和1個(gè)調(diào)節(jié)蛋白DNMT3L；另有一種為DNMT2，主要為tRNA的甲基轉(zhuǎn)移酶，具有微弱的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性[7]。大量研究表明，DNMT3b高表達(dá)與乳腺癌、肝癌、白血病等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8-10]。在最近幾年關(guān)于胃癌的成因研究當(dāng)中，抑癌基因的甲基化研究一直較為火熱，最新的研究進(jìn)展表明，在不同的基因啟動(dòng)區(qū)中，DNMT3b異常表達(dá)與甲基化之間都存在著較大的聯(lián)系[11-12]。

慢性萎縮性胃炎屬中醫(yī)學(xué)痞滿、痞證范疇，本虛標(biāo)實(shí)貫穿于本病的始終，本虛為脾胃氣虛和(或)陰虛，標(biāo)實(shí)為瘀血邪毒。邪毒有廣義和狹義的概念，廣義邪毒是指痰濕、濕熱、熱毒、食積、氣滯等，狹義邪毒僅指熱毒。以益氣化瘀解毒法組方而成的消痞顆粒，方中黨參補(bǔ)中益氣，生津和胃，為君藥；百合養(yǎng)陰潤(rùn)肺，止咳祛痰，清心安神，為臣藥；烏藥宣暢氣機(jī)，溫散寒邪，行氣止痛；香櫞理氣寬中，和胃化濕；丹參活血，血脈流暢，通則不痛，為治胃病的良藥；三七化瘀止血，活血定痛；莪術(shù)行氣破血，消積止痛；蒲公英清熱解毒，消癰散結(jié)；白花蛇舌草清熱利濕，解毒抗癌?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用[13]；丹參可促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)再生，從而使異型增生減輕或消失[14]；三七具有改善微循環(huán)、消炎及預(yù)防腫瘤等作用[15-16]；莪術(shù)可誘發(fā)或促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫排斥反應(yīng)[17]；白花蛇舌草能夠調(diào)節(jié)免疫，增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能，從而起到抑制炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的作用，因此具有明顯的抗菌消炎、抗腫瘤作用[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠DNMT3b蛋白相對(duì)于空白組明顯升高，充分說(shuō)明DNMT3b的高表達(dá)明顯存在于異型增生胃黏膜組織當(dāng)中。本研究結(jié)果還顯示以益氣化瘀解毒法組方的消痞顆?？上抡{(diào)DNMT3b的表達(dá)，這種作用與模型組和維酶素組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明消痞顆粒可有效下調(diào)DNMT3b蛋白的表達(dá)。綜上所述，以益氣化瘀解毒法組方的消痞顆粒逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎伴胃黏膜異型增生可能的作用機(jī)制為下調(diào)DNMT3b的表達(dá)。

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(本文編輯：李珊珊)

Effects of Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy on DNMT3b gene in chronic atrophic gastritis rats with dysplasia

HEMeijuan*,YANGRuobin,YANGJinxiang,etal.

*DepartmentofTraditionalChineseMedicine,LugouqiaoCommunityHealthServiceCenterofFengtaiDistrictinBeijingCity,Beijing100165

Objective To observe the clinical effects of Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy on DNA methylationase 3b (DNMT3b) in chronic atrophic gastritis rats with dysplasia. Methods 60 SPF healthy male Wistar rats were randomly divided into modeling group (n=50) and blank group (n=10). After successful modeling, the remaining rats (n=33) in modeling group were randomly divided into model group, vitacoenzyme group, Xiaopi granule group, 11 rats in each group. The model group was treated by 0.9% sodium chloride injection, the vitacoenzyme group was treated by vitacoenzyme suspensions and the Xiaopi granule group was treated by Xiaotuqi granule liquid. The rats in each group were intragastric administration one time per day for 12 weeks, and then the protein expression of DNMT3b was measured. Results The protein expressions of DNMT3b in vitacoenzyme and model group were significantly higher than that in blank group (P<0.01), and there was no significant difference between the Xiaopi granule group and the blank group (P>0.05). The protein expression of DNMT3b in vitacoenzyme group and Xiaopi granule group was obvious decreased as compared with that in model group (P<0.01), which in Xiaopi granule group was lower than that in vitacoenzyme group (P<0.01). Conclusion Qi-tonifying and blood stasis-removing and detoxification therapy can reverse the dysplasia of gastric mucosa, its mechanism may be achieved by down-regulation of DNMT3b.

Qi-tonifying and blood stasis-removing; Detoxification；Gastritis; Atrophic; Dysplasia; Rat; Wistar; Gene; Animal experiment

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.024

※ 項(xiàng)目來(lái)源：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81173232)

賀梅娟(1980—)，女，主治醫(yī)師，博士。研究方向：脾胃病中醫(yī)藥防治。

R573.32；R9-33

A

1002-2619(2017)03-0411-04

2016-07-25)

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院消化科，北京 100029