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        茶樹(shù)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子CsPPT2基因的克隆和分析

        2017-04-22 04:44:10紀(jì)志芳甘玉迪陳常頌楊鼎俊孫康黎星輝陳暄
        茶葉科學(xué) 2017年2期
        關(guān)鍵詞:丙酮酸白化擬南芥

        紀(jì)志芳,甘玉迪,陳常頌,楊鼎俊,孫康,黎星輝,陳暄*

        1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所, 江蘇 南京 210095;2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,福建 福安 355015

        茶樹(shù)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子CsPPT2基因的克隆和分析

        紀(jì)志芳1,甘玉迪1,陳常頌2,楊鼎俊1,孫康1,黎星輝1,陳暄1*

        1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所, 江蘇 南京 210095;2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,福建 福安 355015

        以茶樹(shù)(Camellia sinensis)白葉1號(hào)為材料,應(yīng)用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得茶樹(shù)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子家族一個(gè)基因 CsPPT2的 cDNA序列,并與茶樹(shù)體內(nèi)另一個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子家族的基因CsPPT1在不同時(shí)期和不同部位的表達(dá)進(jìn)行比較。CsPPT2的cDNA全長(zhǎng)1 469 bp,其中開(kāi)放閱讀框(ORF)為1 218 bp,編碼 406個(gè)氨基酸。通過(guò)生物學(xué)信息分析表明,CSPPT2蛋白分子量為 44.6 kD,理論等電點(diǎn)為9.90,CsPPT2有6個(gè)跨膜區(qū),屬于疏水性葉綠體跨膜蛋白。聚類分析顯示,茶樹(shù)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子家族分為2個(gè)亞組,而CsPPT1與CsPPT2屬于不同亞組。熒光定量結(jié)果分析表明,兩個(gè)基因可能在茶樹(shù)體內(nèi)功能不同,CsPPT2在所考察的組織中均有表達(dá),且在根和成熟葉片中表達(dá)量遠(yuǎn)大于CsPPT1;CsPPT1在莖和復(fù)綠前的幼嫩芽葉中表達(dá)量高于 CsPPT2。在白化期起始時(shí) CsPPT2有短暫的升高,但伴隨白化受到較大的抑制,表明CsPPT2的表達(dá)抑制可能是白葉1號(hào)低兒茶素高氨基酸品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素。

        茶樹(shù);白葉1號(hào);磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子;CsPPT2;表達(dá)分析

        磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(PPT)作為植物初級(jí)代謝和次級(jí)代謝體系的重要樞紐[1],其生理功能是在C3植物中將PEP從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體內(nèi),通過(guò)莽草酸代謝途徑生成各類芳香族氨基酸或合成蛋白質(zhì),或作為植物體內(nèi)其他許多次級(jí)代謝物質(zhì)的底物來(lái)源[2-3]。理論上,PPT基因突變是致死的,但在擬南芥 cue1( Chlorophyll a/b binding protein gene underexpressed 1)[4-5]突變體的研究中發(fā)現(xiàn)是AtPPT1發(fā)生了突變,表現(xiàn)為葉片白化。進(jìn)一步的研究表明,擬南芥 cue1突變體未致死的原因在于擬南芥體內(nèi)除了突變的AtPPT1之外還存在著第2個(gè)PPT基因AtPPT2[6],而維持突變體生存的原因是兩個(gè)基因在植物體內(nèi)的表達(dá)部位不相同,有一定的互補(bǔ)作用[7]。另有研究表明,PPT在不同植物器官中起著不同的作用,在葉片葉綠體以及一些生長(zhǎng)的種子中PPT是作為輸入者將 PEP轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)體中,而根中是作為溢流閥調(diào)節(jié) PEP在根中的積累量[8]。目前,在擬南芥、油菜、水稻中均對(duì)PPT1基因的功能進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)PPT1基因在油菜籽粒的油份等物質(zhì)中積累[9],對(duì)擬南芥[7]和水稻[10]的葉色調(diào)控有一定的作用,而其他PPT基因除擬南芥外則鮮有研究。

        白葉1號(hào)(安吉白茶)是一種自然突變體,因其春季新梢葉色的可逆性白化及白化期新梢較高的游離氨基酸含量而受到廣泛關(guān)注和利用[11-12]。根據(jù)白葉1號(hào)階段性白化過(guò)程中葉片顏色的變化可將白葉 1號(hào)新梢生育過(guò)程細(xì)分為5個(gè)典型的生育階段:返白前,白化初期,白化中期,白化盛期,復(fù)綠初期。白葉1號(hào)在每年春季新梢萌發(fā)時(shí)期,芽頭呈微綠色,當(dāng)葉片展開(kāi)后很快白化成乳白色,白化現(xiàn)象在新梢一芽二葉期前后最為明顯,在春茶后期葉片顏色又逐步轉(zhuǎn)綠,直至完全復(fù)綠[13]。研究表明CsPPT基因相關(guān)功能對(duì)于探究白葉 1號(hào)白化期間兒茶素含量上升的機(jī)理具有重要參考價(jià)值,其中CsPPT1具有為莽草酸途徑提供PEP的作用[14]。本研究從家族內(nèi)另一個(gè)基因入手,克隆得到茶樹(shù)一個(gè)新的磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子基因CsPPT2,并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)信息分析,同時(shí)與CsPPT1進(jìn)行了不同組織、白化過(guò)程不同時(shí)期表達(dá)的比較分析,為深入研究該基因在白葉 1號(hào)白化過(guò)程中莽草酸途徑中各種次生代謝物含量的變化機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        本研究所用茶樹(shù)品種白葉 1號(hào)采自南京仕必瑞生物科技有限公司,選擇茶樹(shù)白化的5個(gè)階段(返白前、白化初期、白化中期、白化盛期、復(fù)綠初期)的一芽二葉,另于2016年9月3日分別取一年生白葉1號(hào)茶樹(shù)的根、嫩莖、葉和葉脈,所取樣品立即放于液氮中冷凍,隨后儲(chǔ)存在–70℃冰箱保存待用。

        EASYspin PlusRNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物,E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit D2500-02購(gòu)自O(shè)MEGA。pEASY-T1 Simple克隆載體、pEASY-Blunt Zero克隆載體、Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于南京百斯凱科技有限公司。Marker、PrimeSTAR ?HS DNA Polymerase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit、Wizard DNA Clean-Up System(Promega)試劑盒、SYBRPremix Ex-Taq試劑盒等均購(gòu)于TaKaRa公司,引物合成及測(cè)序由南京金斯瑞公司完成。

        1.2 RNA的提取與cDNA的合成

        使用EASYspin PlusRNA提取試劑盒提取茶樹(shù)不同時(shí)間段和不同組織的 RNA,利用微量紫外檢測(cè)儀NanoDrop測(cè)定RNA濃度。用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

        1.3 CsPPT2基因的克隆

        根據(jù)NCBI GenBank中登錄的其他物種,如葡萄、蓖麻、草莓、大豆、黃瓜等的PPT2基因的序列設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)所需的引物(表 1)。以茶樹(shù)芽頭 cDNA為模板進(jìn)行基因中間片段PCR擴(kuò)增,普通 PCR程序?yàn)椋?4℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。擴(kuò)增體系為:ddH2O 11.9 μL,10× r-Taq Buffer (Mg2+free) 2 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 1.6 μL,MgCl2(25 mmol·L-1) 1.2 μL,上、下游引物各1 μL,Temple 1 μL,5 U·μL-1r-Taq 0.3 μL。3′-RACE 和5′-RACE擴(kuò)增同上述方法,拼接出茶樹(shù)PPT2全長(zhǎng)序列。最后再設(shè)計(jì)特異引物,采用PrimeSTAR ?HS DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增出基因全長(zhǎng)。瓊脂糖凝膠電泳分離 PCR產(chǎn)物后回收目的條帶。PCR 產(chǎn)物連接到pEASY-T1 Simple克隆載體并轉(zhuǎn)入Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行克隆鑒定和序列測(cè)序。

        1.4 CsPPT2基因生物信息學(xué)分析

        利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST進(jìn)行同源比對(duì)分析,用ORF Finder分析開(kāi)放閱讀框;使用 MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行聚類分析;使用 ProtParam tool(http://web.expasy.org/ protparam)計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn);利用 DNAMAN進(jìn)行蛋白質(zhì)親/疏水性分析;通過(guò) TMHMM(http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析;采用NetPhos Sever3.0(http://www.cbs. dtu.dk/services/NetPhos)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)與分析;在線軟件TargetP 1.1 Serve(http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

        表1 CsPPT2克隆引物Table 1 Primer sequences for the amplification ofCsPPT2

        1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)與基因表達(dá)分析

        使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將反轉(zhuǎn)錄后,以茶樹(shù)β-actin基因(Accession No. HQ420251)作為看家基因[15],利用IQTM5 multicolor real time PCR detection system(Bio-rad,USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),PCR程序?yàn)椋?5℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。20 μL體系為:ddH2O 8.2 μL,SYBR ExTaqⅡ 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 1 μL。采用法分析結(jié)果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,利用鄧肯式新復(fù)極差法做顯著性分析。

        2 結(jié)果與分析

        圖1 茶樹(shù)CsPPT2基因的克隆Fig. 1 Amplification ofCsPPT2gene fromCamellia sinensis

        2.1 CsPPT2基因的克隆

        以茶樹(shù)芽頭cDNA為模板克隆CsPPT2基因:中間片段長(zhǎng)度為638 bp(圖1-A),BlastX比對(duì)證明該片段與其他物種的PPT基因具有較高的相似性,以此片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)基因特異性引物(表 1)獲得 992 bp的 3′端序列(圖1-B)和 475 bp的 5′端序列(圖 1-C);經(jīng)DNAMAN 拼接后預(yù)測(cè)全長(zhǎng) cDNA的開(kāi)放閱讀框(ORF),根據(jù)該序列設(shè)計(jì)ORF擴(kuò)增引物獲得長(zhǎng) 1 218 bp的片段。ORF產(chǎn)物測(cè)序后與拼接結(jié)果比對(duì),確認(rèn)獲得了 1 469 bp的茶樹(shù)CsPPT2基因的cDNA全長(zhǎng)序列(圖1-D),編碼406個(gè)氨基酸(圖2)。

        2.2 CsPPT1和CsPPT2氨基酸比較分析

        對(duì)比CsPPT1和CsPPT2基因氨基酸序列,結(jié)果如圖3,二者相似性為62.04%,但2個(gè)基因的結(jié)構(gòu)域位置相似。

        2.3 CsPPT2基因氨基酸序列的聚類分析

        將茶樹(shù)CsPPT2基因氨基酸序列與GenBank中登錄的其他物種PPT基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),利用MEGA5中的最大似然法制作CsPPT2與其他物種PPT基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),進(jìn)行聚類分析(圖4)發(fā)現(xiàn),整個(gè)PPT家族大致可以分為2類,PPT1、PPT2。CsPPT1和CsPPT2分別屬于不同的亞組。其中CsPPT1與單子葉植物玉米、水稻和粟的親緣關(guān)系更近,CsPPT2與雙子葉植物芝麻和番茄親緣關(guān)系較近。與擬南芥中情況不同的是,在茶樹(shù)中,與 C4植物的PPT基因親緣關(guān)系更近的是CsPPT1。

        2.4 CsPPT2基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

        2.4.1CsPPT2基因氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

        CsPPT2基因?qū)?yīng)的氨基酸序列分析結(jié)果表明,茶樹(shù)CsPPT2基因編碼的氨基酸數(shù)目為406個(gè)(圖 2),分子量為 44 627.44,理論等電點(diǎn)為 9.90。負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為(Asp+Glu)16個(gè),正電荷殘基數(shù)為(Arg+Lsy)34個(gè)。不穩(wěn)定系數(shù)為39.16,屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為105.89,總平均親水性為0.453。

        2.4.2CsPPT2基因跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

        圖2 CsPPT2基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig. 2 Deduced nucleotide and amino acid sequences ofCsPPT2gene

        圖3 CsPPT1與CsPPT2基因氨基酸序列比對(duì)Fig. 3 Alignment of amino acid sequences ofCsPPT1andCsPPT2

        圖4 CsPPT2的聚類分析Fig. 4 Phylogenetic tree ofCsPPT2

        采用TMHMM分析發(fā)現(xiàn),CsPPT2共有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖 5),預(yù)測(cè)位置分別在105~122、132~154、167~189、227~249、279~301、372~394。推測(cè)該蛋白可能為跨膜蛋白。茶樹(shù)CsPPT2蛋白氨基酸N端和C端均處于細(xì)胞膜內(nèi)部。與CsPPT1不同的是,CsPPT1有7個(gè)跨膜區(qū)域。

        2.4.3CsPPT2基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

        利用 TargetP 1.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)CsPPT2蛋白的亞細(xì)胞定位情況如表 2。顯示葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位的可能性最大,得分為0.986 ,而作為線粒體靶向肽和信號(hào)肽定位的可能性很小,得分僅為0.021和0.003。

        2.4.4CsPPT2基因親/疏水性分析

        利用 Protscal在線預(yù)測(cè)軟件繪制茶樹(shù)CsPPT2的親/疏水性序列圖譜(圖6),發(fā)現(xiàn),茶樹(shù)CsPPT2親水性氨基酸少于疏水性氨基酸,根據(jù)正值越大疏水性越大的規(guī)律判斷,茶樹(shù)CsPPT2蛋白屬于疏水性蛋白。

        2.4.5CsPPT2磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

        磷酸化修飾預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)整個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈中分值大于 0.5的氨基酸位點(diǎn)共有 42個(gè),且非均勻分布在整個(gè)多肽鏈中,其中 27個(gè)絲氨酸殘基(Ser)可能發(fā)生磷酸化,分別位于肽鏈的第9、17、35、40、41、42、44、48、52、54、57、60、66、85、96、165、178、187、194、238、250、266、307、309、316、369、378個(gè)位點(diǎn);13個(gè)蘇氨酸殘基(Thr)可能發(fā)生磷酸化,分別位于肽鏈的第 12、65、93、135、137、145、158、163、178、184、198、220、375個(gè)位點(diǎn);1個(gè)酪氨酸殘基(Tyr)可能發(fā)生磷酸化,位于肽鏈的第4個(gè)位點(diǎn)(圖7)。

        2.5 CsPPT1和CsPPT2基因相對(duì)表達(dá)量比較分析

        分別提取一年生白葉1號(hào)茶苗不同部位,包括根、嫩莖、葉、葉脈白葉 1號(hào)在白化前期、白化期和白化后期一芽二葉葉片的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR分析(圖8)。CsPPT2在茶樹(shù)的根、莖、葉、葉脈中均有表達(dá),表達(dá)量由高到低依次為:根、葉、嫩莖和葉脈,其中,在根中表達(dá)量最多。

        圖5 CsPPT2的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 5 The predictedCsPPT2transmemberence domains

        表2 CsPPT2的亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)Table 2 The subcellular localization prediction ofCsPPT2

        圖6 CsPPT2疏水性預(yù)測(cè)Fig. 6 Predicted hydrophobic properties ofCsPPT2

        圖7 CsPPT2磷酸化預(yù)測(cè)Fig.7 Phosphorylation prediction ofCsPPT2

        將CsPPT1和CsPPT2不同部位的基因表達(dá)量進(jìn)行比較分析可以看到,兩個(gè)基因在根、莖、葉和葉脈中都有表達(dá),CsPPT2在根和葉中表達(dá)顯著高于CsPPT1,尤其在根部其表達(dá)量可達(dá)CsPPT1表達(dá)量的 40倍,而CsPPT1則在莖中表達(dá)多于CsPPT2(圖8)。

        在白化過(guò)程的不同時(shí)期,CsPPT1的表達(dá)量均高于CsPPT2,而且,結(jié)果顯示白化開(kāi)始后CsPPT1呈下降的趨勢(shì),CsPPT2也在白化中期急劇下降(圖9)。

        圖8 CsPPT1和CsPPT2在茶樹(shù)不同組織的表達(dá)量Fig. 8 The expression profiles ofCsPPT1 andCsPPT2in different tissues

        圖9 CsPPT1和CsPPT2在茶樹(shù)新梢不同生育階段的表達(dá)量Fig. 9 The expression profiles ofCsPPT1 andCsPPT2in different stages

        3 結(jié)論與討論

        磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)作為植物初生和次生代謝重要的平衡點(diǎn),但在 C3植物,如豌豆、菠菜、擬南芥、花菜等[16-19]的葉綠體和絕大多數(shù)非綠質(zhì)體內(nèi)沒(méi)有從糖酵解完全合成PEP所需要的所有酶,所以并不具備合成PEP的能力。因此,葉綠體內(nèi)的PEP只能通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(PPT)從細(xì)胞質(zhì)獲取[20],所以,PPT在C3植物中起著初級(jí)和次級(jí)代謝途徑的橋梁作用[1],PPT功能對(duì)植物的重要性由此可見(jiàn)。

        在擬南芥中,有兩個(gè)功能性的PPT基因,分別是AtPPT1和AtPPT2,而AtPPT1的突變會(huì)導(dǎo)致一系列的表型如葉片白化、氨基酸含量上升及莽草酸途徑產(chǎn)物減少等現(xiàn)象[2,21],這與白葉1號(hào)白化期表型基本一致。與擬南芥不同的是,通過(guò)對(duì)白葉1號(hào)不同組織實(shí)時(shí)熒光定量發(fā)現(xiàn),CsPPT2在所考察的組織中均有表達(dá),且根和成熟葉片中大量表達(dá),CsPPT1相對(duì)于CsPPT2表達(dá)量均低,但在嫩莖中和嫩葉中表達(dá)量高于CsPPT2,這說(shuō)明CsPPT2可能在茶樹(shù)中發(fā)揮著主要的作用。在擬南芥中AtPPT1主要在葉和根的維管組織中表達(dá),AtPPT2在幾乎所有的葉片中表達(dá),而不在根部表達(dá)[6];而CsPPT2在茶樹(shù)根和葉中卻大量表達(dá),這表明在茶樹(shù)體內(nèi)主要由CsPPT2完成PEP的轉(zhuǎn)運(yùn)等生理功能,所以當(dāng)CsPPT2表達(dá)發(fā)生變化會(huì)引起茶樹(shù)體內(nèi)莽草酸途徑的變化,從而對(duì)白葉1號(hào)的品質(zhì)產(chǎn)生影響。與CsPPT1僅在幼嫩組織中表達(dá)不同,CsPPT2在白化期開(kāi)始表達(dá)量略有上升而后卻劇烈下降,結(jié)合CsPPT2在成熟葉片中較大的表達(dá)量可以看出,在茶樹(shù)新梢萌芽過(guò)程中,CsPPT1首先發(fā)揮作用,但隨著葉片的成長(zhǎng)發(fā)育,其功能由CsPPT2取代,本應(yīng)隨著葉片的成熟表達(dá)量逐步上升,CsPPT2的表達(dá)在白化過(guò)程中受到了較強(qiáng)的抑制,也就是白化過(guò)程首先延緩CsPPT2的正常表達(dá),影響了茶樹(shù)葉片中 PEP的正常運(yùn)輸,導(dǎo)致莽草酸合成途徑受到抑制,使得新梢中兒茶素含量降低;不能進(jìn)入葉綠體的 PEP在胞質(zhì)中積累導(dǎo)致胞質(zhì)中丙酮酸含量上升,刺激TCA循環(huán),使得谷氨酸積累,導(dǎo)致茶氨酸合成途徑增強(qiáng),含量上升,最終形成白葉1號(hào)低兒茶素高氨基酸的品質(zhì)。

        [1]Fischer K, Kammerer B, Gutensohn M, et al. A new class of plastidic phosphate translocators: a putative link between primary and secondary metabolism by the phosphoenolpyruvate/phosphate antiporter [J]. Plant Cell, 1997, 9: 453-462.

        [2]Voll L, Husler R E, Hecker R, et al. The phenotype of the Arabidopsis cue1 mutant is not simply caused by a general restriction of the shikimate pathway [J]. Plant Journal, 2003, 36: 301-317.

        [3]Kerbarh O, Bulloch E M M, Payne R J, et al. Mechanistic and inhibition studies of chorismate-utilizing enzymes [J]. Biochemical Society Transactions, 2005, 33: 763-766.

        [4]Li H, Culligan K, Dixon RA, et al. Expression of the functional mature chloroplast triose phosphate translocator in yeast internal membranes and purification of the histidine-tagged proteion by a single metalaffinity chromatography step [J]. Proc Natl Acad Sci, 1993, 90: 2155-2159.

        [5]Streatfield SJ, Weber A, Kinsman EA, et al. The phosphoenolpyruvate/phosphater translocator is required for phenolic metabolism, plastid cell development and plastid-dependent nuclear gene expression [J]. Plant Cell, 1999, 11: 1609-1621.

        [6]Knappe S, Flugge UI, Fischer K. Analysis of the plastidic phosphate translocator gene family in Arabidopsis and identification of new phosphate translocator-homologous transporters, classified by their putative substrate-binding site [J]. 2003, 131(3): 1178-1190.

        [7]Knappe S, L? ttgert T, Schneider A, et al. Characterization of two functional phosphoenolpyruvate/phosphate translocator (PPT) genes in Arabidopsis–AtPPT1 may be involved in the provision of signals for correct mesophyll development [J]. The Plant Journal, 2003, 36(3): 411-420.

        [8]Staehr P, L? ttgert T, Christmann A, et al. Reticulate leaves and stunted roots are independent phenotypes pointing at opposite roles of the phosphoenolpyruvate/phosphate translocator defective in cue1 in the plastids of both organs [J]. Front Plant Sci, 2014, 5: 126.

        [9]楊坤, 吳學(xué)龍, 郎春秀, 等. 甘藍(lán)型油菜 PEP轉(zhuǎn)運(yùn)子BnPPT1基因的克隆、序列分析和表達(dá)模式[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 23(1): 1-7.

        [10]吳學(xué)龍. PPT1基因調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究及葉脈特異表達(dá)增強(qiáng)子的分離應(yīng)用[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2013: 12-131.

        [11]成浩, 李素芳, 陳明, 等. 安吉白茶特異性狀的生理生化本質(zhì)[J]. 茶葉科學(xué), 1999, 19(2): 87-92.

        [12]李素芳, 成浩, 虞富蓮, 等. 安吉白茶階段性返白過(guò)程中氨基酸的變化[J]. 茶葉科學(xué), 1996, 16(2): 153-154.

        [13]李素芳, 陳樹(shù)堯, 成浩. 茶樹(shù)階段性返白現(xiàn)象的初步研究[J]. 中國(guó)茶葉, 1994, 16(2): 26-27.

        [14]趙真, 陳暄, 王明樂(lè), 等. 茶樹(shù)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)子基因CsPPT的克隆與表達(dá)分析[J]. 茶葉科學(xué), 2015, 35(5): 491-500.

        [15]孫美蓮, 王云生, 楊冬青, 等. 茶樹(shù)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 植物學(xué)報(bào), 2010, 45(5): 579-587.

        [16]Bagge P, Larsson C. Biosynthesis of aromatic amino acids by highly purified spinach chloroplasts-Compartmentation and regulation of the reactions [J]. Physiol Plantarum, 1986, 68(4): 641-647.

        [17]Van Der Straeten D, Rodrigues-Pousada RA, Goodman HM, et al. Plant enolase: Gene structure, expression and evolution [J]. Plant Cell, 1991, 3: 719-735.

        [18]Journet EP, Douce R. Enzymic capacities of purified cauliflower bud plastids for lipidsynthesis and carbohydrate metabolism [J]. Plant Physiol, 1985, 79: 458-467.

        [19]Schulze-Siebert D, Heineke D, Scharf H, et al. Pyruvate-derived amino acids in spinach chloroplasts: Synthesis and regulation during photosynthetic carbon metabolism [J]. Plant Physiol, 1984, 76: 465-471.

        [20]Prabhaka V, L? ttgert T, Gigolashvili T, et al. Molecular and functional characterization of the plastid-localized Phosphoenolpyruvate enolase (ENO1) from Arabidopsis thaliana [J]. FEBSLet, 2009, 583: 983-991.

        [21]Li HM, Culligan K, Dixon RA, et al. CUE1: a mesophyll cell-specific positive regulator of light-controlled gene expression in Arabidopsis [J]. Plant Cell, 1995, 7: 1599-1610.

        Cloning and Expression Analysis of Phosphoenolpyruvate Transporter Gene CsPPT2 in Tea Plant(Camellia sinensis)

        JI Zhifang1, GAN Yudi1, CHEN Changsong2, YANG Dingjun1, SUN Kang1, LI Xinghui1, CHEN Xuan1*

        1. Tea Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu′an 355015, China

        A full length cDNA sequence of phosphoenolpyruvate transporter gene (CsPPT2) was obtained from tea plant(Camellia sinensis) cultivar ‘Baiye 1’ by polymerase chain reaction (PCR) and rapid amplification of cDNA ends PCR(RACE-PCR). The nucleotide sequence length of this gene was 1469 bp, containing a complete open reading frame (1218 bp) encoding 406 amino acids. Bioinformatic analysis showed that the predicted molecular weight of the protein was 44.6 kD, and the theoretic isoelectric point was 9.90. CsPPT2 has 6 trans-membrane regions, which may belong to the hydrophobic chloroplast trans-membrane protein. Phylogenetic tree analysis showed the phosphoenolpyruvate transporter family in tea plant could be divided into two subgroups, with CsPPT1 and CsPPT2 belonged to different subgroups. The expression of CsPPT1 and CsPPT2 were compared in different periods and plant organs. It showed that CsPPT2 was expressed in all tested tissues, with higher expression level in roots and mature leaves than those of CsPPT1. But the expression level of CsPPT1 in young shoots was higher than CsPPT2. CsPPT2 was transiently elevated at the beginning of the albino, but inhibited during the development ofalbino, indicates that the inhibition of the expression of CsPPT2 may act as a key factor for low-catechins and high-amino acids in ‘Baiye 1’.

        Camellia sinensis, Baiye 1, phosphoenolpyruvate transporter, CsPPT2, expression analysis

        S571.1;Q52

        A

        1000-369X(2017)02-149-11

        2017-02-14

        2017-02-22

        現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-23)、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金(31570691)、江蘇省科技支撐計(jì)劃(BE2009313-1)

        紀(jì)志芳,女,碩士研究生,主要從事茶樹(shù)遺傳育種和茶葉生化研究。*通訊作者:chenxuan@njau.edu.cn

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