馬存強，周斌星，王洪振，王潘

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 昆明大樸茶業(yè)有限公司，云南 昆明 650224；3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036

普洱茶渥堆發(fā)酵中可降解咖啡堿真菌菌株的篩選和鑒定

馬存強1,2，周斌星1,3*，王洪振1，王潘1

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 昆明大樸茶業(yè)有限公司，云南 昆明 650224；3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036

為了在普洱茶渥堆發(fā)酵中篩選出可降解咖啡堿的菌株，采用咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基從不同階段普洱茶發(fā)酵樣中篩選目標菌株，結(jié)合菌落特征、分生孢子結(jié)構(gòu)以及 18 S rDNA序列對目標菌株進行鑒定。并將目標菌株接種至茶葉內(nèi)進行單菌種發(fā)酵，通過高效液相色譜法（HPLC）測定咖啡堿、茶堿、可可堿、3-甲基黃嘌呤等嘌呤堿含量。結(jié)果表明，在普洱茶發(fā)酵樣中篩選出一株有效降解咖啡堿的菌株，此菌株在 48 h內(nèi)對咖啡堿的降解率為87.7%。經(jīng)鑒定為聚多曲霉（Aspergillus sydowii），序列相似性為99.8%。在聚多曲霉茶葉單菌種發(fā)酵中，咖啡堿含量急劇下降，在發(fā)酵結(jié)束時僅占干物質(zhì)重的(0.414±0.077)%；茶堿質(zhì)量分數(shù)大幅度上升，由最初的不足0.1%上升至(2.129±0.246)%，成為主要的嘌呤堿；可可堿含量無顯著變化（P＜0.05）；3-甲基黃嘌呤有大幅度增加，增幅達130%。本文首次從發(fā)酵茶葉中篩選出可降解咖啡堿的菌株，探究了微生物發(fā)酵中咖啡堿的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，為低咖啡堿普洱茶的開發(fā)提供了菌種。

聚多曲霉；咖啡堿；茶堿；普洱茶；渥堆發(fā)酵

咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）是茶葉中主要的嘌呤堿和重要的呈味物質(zhì)?？Х葔A含量相對穩(wěn)定，僅受到采摘季節(jié)[1]和茶樹品種[2]等因素的影響。在綠茶、紅茶、烏龍茶等茶葉加工過程中，咖啡堿均無顯著變化[3-4]。

黑茶是中國特有的微生物主導(dǎo)下的后發(fā)酵茶類[5]。普洱茶作為黑茶的一種，在中國西南地區(qū)已有數(shù)百年歷史。渥堆發(fā)酵（后發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵）是普洱茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序。在渥堆發(fā)酵過程中，咖啡堿呈增加或減少的變化趨勢[6-9]。前人通過茶葉單菌種發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，在頂頭孢霉菌（Cephalosporium acremonium）茶葉發(fā)酵中，咖啡堿升高 60%～70%，在煙曲霉菌 （ Aspergillus fumigatus） 和 乳 酸 菌（lactobacillus）茶葉發(fā)酵中，咖啡堿含量無顯著變化[10]。然而，在酵母菌（Saccharomycetes sp.）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）茶葉發(fā)酵中，咖啡堿含量有小幅下降[10-11]。由此可見，微生物對咖啡堿等嘌呤堿含量有明確作用[12]。本文以普洱茶渥堆發(fā)酵樣為材料，旨在篩選鑒定出可降解咖啡堿的有效菌株，并將目標菌株接種至茶葉中進行單菌種發(fā)酵，探究咖啡堿的降解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，為低咖啡堿普洱茶的開發(fā)提供菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱茶渥堆發(fā)酵樣、云南大葉種曬青毛茶均由昆明大樸茶業(yè)有限公司提供。

咖啡堿（≥99%）、可可堿（≥99%）、茶堿（≥99%）、3-甲基黃嘌呤（≥99%）等標準品（美國sigma公司）。DNA Marker、PCR擴增引物、IST1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3′)和IST4（5′-TCCTCCGCTTATTGATAG C-3′）（日本TaKaRa公司）。

咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基[13]：Na2HPO40.12 g·L-1、K2HPO41.3 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1、CaCl20.3 g·L-1、咖啡堿1.2 g·L-1，pH 5.5，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（安捷倫 1200）、BH-2 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、PCR擴增儀（Bio-Rad）、DNA自動測序儀（ABI Prism 3730）。

1.3 降解咖啡堿菌株的初篩、復(fù)篩

參照文獻[13]，無菌操作稱取1 g不同階段渥堆茶樣，加入50 mL無菌咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基的接種瓶，搖勻，30℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，培養(yǎng)48～72 h。培養(yǎng)液于3 000×g離心30 min，取1 mL上清液，與9 mL無菌生理鹽水混合均勻后，依次稀釋級數(shù)為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，采取涂布法接種至PDA培養(yǎng)基，每個稀釋度3個平行，2次重復(fù)，27℃倒置培養(yǎng)。菌落長出后，挑取單菌落在PDA培養(yǎng)基平板上劃線分離純化。挑取單菌落鏡檢無雜菌后，將純化的菌株分別接種到咖啡堿篩選液體培養(yǎng)基中，30℃，180 r·min-1，搖床培養(yǎng) 48 h，比較其OD600nm菌體生長量，初步篩選出可利用咖啡堿的菌株。

將初篩得到的各菌株分別接種于種子培養(yǎng)基中，30℃，180 r·min-1培養(yǎng)12 h，調(diào)整種子液的菌數(shù)為108CFU·mL-1，以2%的接種量接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r·min-1培養(yǎng)48 h，并以不接種的空白組作為對照。發(fā)酵前后培養(yǎng)液在3 000×g離心30 min，取上清液采用HPLC法，對發(fā)酵前后咖啡堿的含量進行測定和比較。計算各菌株的咖啡堿降解率，篩選出咖啡堿降解能力最強的菌株。

1.4 菌株的鑒定

菌落及菌株形態(tài)觀察：無菌操作接種在PDA和察氏培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。分子鑒定方法如下：DNA提?。耗繕司攴謩e接種至PDA培養(yǎng)基以及察氏固態(tài)培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)觀察菌落生長狀況，并用高倍顯微鏡觀察菌株形態(tài)特征。將目標菌株接種至察氏（CYA）液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集菌絲體，－80℃冷凍干燥后采取真菌 DNA提取試劑盒法提取DNA。

PCR擴增：ITS序列通過引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和IST4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行擴增。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min；54℃退火1 min；72℃延伸1.5 min；共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。程序結(jié)束后進入10℃狀態(tài)。

rDNA序列分析：對PCR產(chǎn)物通過DNA自動測序儀進行測序，將所獲序列提交到NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫進行同源序列搜索，并調(diào)出相關(guān)菌株ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列，用 ClustalX1.8軟件進行多序列比對，通過MEGA4軟件選用Kimura2-parameter距離模型計算進化距離，用Nerghbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次隨機抽樣計算Bootstrap值以評估系統(tǒng)發(fā)育的置信度。

1.5 目標菌株茶葉發(fā)酵

稱取20 g曬青毛茶與12.25 mL蒸餾水混合，1×105Pa滅菌后，每培養(yǎng)瓶接種1 mL目標菌株的種子菌懸液（108CFU·mL-1），并以接種1 mL無菌水的發(fā)酵組作為對照。接種瓶均放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)（30℃，85%）進行培養(yǎng)。參照普洱茶渥堆發(fā)酵方法，每5 d取樣1次，測定茶樣中咖啡堿、可可堿、茶堿、3-甲基黃嘌呤等嘌呤堿含量。

1.6 測定方法

咖啡堿、可可堿、茶堿等嘌呤堿含量測定采取HPLC法。

上樣液制備：稱取3 g磨碎試樣于500 mL錐形瓶中，加沸蒸餾水 450 mL，立即移入沸水浴，浸提45 min（每隔l0 min搖動1次）。浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，并定容至500 mL。茶湯經(jīng) 0.45 μm水系膜過濾后進樣，進樣量為10 μL。用于降咖啡堿菌株篩選的液態(tài)篩選培養(yǎng)基用去離子水稀釋5倍過濾后，直接用HPLC測定咖啡堿保留量，并按照咖啡堿降解率計算公式：Y=[(a–b)/a]×100%計算咖啡堿的降解率。式中：a為初始咖啡堿質(zhì)量濃度（g·L-1）；b為剩余咖啡堿質(zhì)量濃度（g·L-1）；y為咖啡堿降解率（%）。

色譜條件[14]為：流動相為乙腈和 0.2%乙酸水溶液的混合液，A相為乙腈，B相為0.2%乙酸水溶液，梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，色譜柱：安捷倫反相Cl8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長為280 nm；柱溫為30℃。洗脫程序為：0 min，A相：8%，B相：92%；50 min，A相：31%，B相：69%。采取梯度洗脫。后運行10 min后進下一樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 可降解咖啡堿菌株的初篩結(jié)果

通過初篩得到 11個菌株能在以咖啡堿為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基上生長良好（表1）。根據(jù) OD600nm的測定，PE-5菌株、PE-3菌株和PE-8菌株的生長速度較快，說明這3個菌株利用代謝咖啡堿的能力較強。

2.2 可降解咖啡堿菌株的復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的 11個菌株接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，以2%的接種量接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，重復(fù)2次。取發(fā)酵前后培養(yǎng)液的上清液用HPLC法測定咖啡堿的量，以計算各菌株的咖啡堿降解率。發(fā)現(xiàn)PE-5菌株對咖啡堿的降解能力最強，在 48 h內(nèi)可降解1.05 g·L-1咖啡堿，降解率達 87.7%（表 2）。對比表1和表2可知菌株的咖啡堿降解量基本與 OD600nm值成正比，即菌液的 OD600nm值越高，微生物代謝越旺盛，對咖啡堿降解量越大，咖啡堿的降解率越高。反之亦然。最終篩選出PE-5菌株，根據(jù)菌落特征、細胞形態(tài)和 18 S rDNA序列，對其進行進一步的鑒定。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

PE-5在PDA培養(yǎng)基以及察氏培養(yǎng)基上的菌落特征如圖1所示。菌落在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d時，菌落直徑達2.9 cm，菌落中央凸起，絮粉狀，橄欖綠，邊緣為乳白色整齊；菌落背面乳黃色。在察氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d時，菌落直徑2.3 cm，質(zhì)地為絲絨狀至絮狀，致密，邊緣整齊；顏色呈淺土黃色，中間淡肉桂色；有紅色滲出液；菌落背面呈淡黃至肉桂紅，稍有放射狀溝紋，色素擴散于基質(zhì)中。

表1 可降解咖啡堿菌株的初篩結(jié)果Table 1 Results of preliminary screening for the caffeine-degradation strains

表2 可降解咖啡堿菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 2 Results of repeated screening for caffeine-degradation strains

PE-5菌株在電子顯微鏡下的分生孢子結(jié)構(gòu)如圖2所示。菌絲不規(guī)則地分枝、有隔膜，分生孢子頭呈球形至輻射形，直徑為 52～125 μm，小分生孢子頭似青霉狀，呈疏松柱形或散亂；分生孢子梗直接生于基質(zhì)或生于氣生菌絲，壁較厚、光滑；頂囊較小，近球形或稍呈橢圓形，表面幾乎全部可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，即?；?、瓶梗。有的小分生孢子頭僅分生孢梗莖頂端稍膨大后生出產(chǎn)孢細胞，有時還可見氣生菌絲上直接生有瓶梗；分生孢子為球形或近球形，直徑2.5～3.5 μm，壁明顯粗糙，具小刺。

PE-5菌株的18 S rDNA序列在NCBI使用Blast比對，表明PE-5與Aspergillus sydowiiNRRL250同源性最高，為 99.8%?；贗TS1-5.8S-ITS2 rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建PE-5的系統(tǒng)進化樹（圖3）。結(jié)合目標菌株菌落特征、分生孢子結(jié)構(gòu)，可以確定 PE-5為Aspergillus sydowiiNRRL250（GenBank登錄號為EF652450），屬于曲霉屬真菌。

2.4 HPLC法可靠性分析結(jié)果

咖啡堿、可可堿、茶堿、3-甲基黃嘌呤等嘌呤堿的保留時間、線性范圍、標準曲線方程、相關(guān)性系數(shù)、檢測限（LOD）、定量限（LOQ）見表3。由此可知，該方法可用于茶樣中嘌呤堿含量的測定。

圖1 PE-5在培養(yǎng)基上的菌落特征Fig. 1 Colony morphology of PE-5 on culture medium

圖2 PE-5在電子顯微鏡下的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of PE-5 under transmission electron microscope

2.5 聚多曲霉茶葉發(fā)酵中咖啡堿等嘌呤生物堿含量變化

咖啡堿、可可堿、茶堿是茶葉中主要的嘌呤堿。在一般茶葉中，咖啡堿含量占茶葉干重的2%～5%；可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤）為0.2%～0.4%；茶堿（1,3-二甲基黃嘌呤）為0.008%～0.02%[15]。在茶樹[Camellia sinesis（L.）O. Kuntze]生理中，可可堿是咖啡堿合成的直接前體物質(zhì)[16]；茶堿和 3-甲基黃嘌呤是咖啡堿的主要降解產(chǎn)物[17]。另外，在茶樹[Camellia sinesis（L.）O. Kuntze]與咖啡樹（CoffeaarabicaL.）的咖啡堿降解代謝中，茶堿是主要限速步驟。然而，在微生物發(fā)酵中咖啡堿的降解代謝產(chǎn)物與降解途徑尚不清楚。本實驗以篩選鑒定出的聚多曲霉為試驗菌種，通過茶葉單菌種發(fā)酵探究微生物作用下的咖啡堿降解代謝產(chǎn)物。

圖3 目標菌株的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of the target strains

表3 不同嘌呤堿的檢測限、定量限、線性范圍、相關(guān)性系數(shù)Table 3 Limit of detection, limit of quantification, linear range and correlation coefficient of purine alkaloids

咖啡堿含量的變化趨勢如圖4（A）所示，在滅菌處理的對照組中，咖啡堿基本穩(wěn)定，無顯著變化；在接種發(fā)酵組中，咖啡堿質(zhì)量分數(shù)急劇下降，從最初的(3.531±0.0733)%下降至(0.593±0.0518)%，發(fā)酵結(jié)束時，咖啡堿質(zhì)量分數(shù)僅為 0.414%。整體上，在聚多曲霉茶葉發(fā)酵中，咖啡堿的降解率為 88.76%。茶堿含量變化見圖4-B。在無菌處理的對照組中，茶堿質(zhì)量分數(shù)基本維持在0.01%以下；在接種發(fā)酵組中，茶堿大幅度升高，從最初的不足0.01%增加至(2.129±0.246)%，并成為主要的嘌呤堿。由圖4-C可知，可可堿含量相對穩(wěn)定，發(fā)酵前后無顯著性變化。由圖4-D可知，3-甲基黃嘌呤在接種發(fā)酵中有大幅度增加，由最初的(0.658±0.08)%增加至(1.513±0.24)%，增加幅度為130%。由此可知，聚多曲霉能大幅度降低咖啡堿含量，對茶堿、3-甲基黃嘌呤也有明顯影響。

圖4 普洱茶發(fā)酵過程中咖啡堿（A）、茶堿（B）、可可堿（C）、3-甲基黃嘌呤（D）含量變化Fig. 4 The dynamic changes of caffeine(A), theophylline (B), theobromine(C) and 3-methylxanthine(D) diversification in pu-erh tea during solid-state fermentation

3 討論與結(jié)論

雖然在茶園和咖啡園的土壤[18-20]中已經(jīng)篩選出多株具有降解咖啡堿的有效菌株，但在固態(tài)發(fā)酵茶樣中分離鑒定降解咖啡堿的菌株從未見報道。本文以不同階段的普洱茶發(fā)酵樣為材料，通過咖啡堿液體篩選培養(yǎng)基的初篩與復(fù)篩，分離鑒定出一株可降解咖啡堿的有效菌株。鑒定為聚多曲霉（Aspergillus sydowii），相似性高達99.8%。在咖啡堿質(zhì)量濃度為1.2 g·L-1的篩選培養(yǎng)基中，該菌株48 h內(nèi)對咖啡堿的降解率為87.7%。

在前人研究中，聚多曲霉能分泌產(chǎn)生多種具有抗癌活性的吲哚生物堿和雜氧蒽酮[21-22]，為重要的醫(yī)藥微生物。為探究該菌株對咖啡堿等嘌呤堿的影響，本文將聚多曲霉接種至茶葉中進行單菌種發(fā)酵，并以無菌處理作為對照。在接種發(fā)酵中，咖啡堿含量急劇下降，發(fā)酵結(jié)束時咖啡堿的降解率為 88.76%，含量僅占干物質(zhì)重的 0.414%左右，符合國際低咖啡堿茶咖啡堿質(zhì)量分數(shù)低于1%的基本要求。因此聚多曲霉或可用于低咖啡堿普洱茶的開發(fā)。另外，在接種發(fā)酵過程中，茶堿含量大幅度上升，發(fā)酵結(jié)束時質(zhì)量分數(shù)為(2.129±0.246)%，成為發(fā)酵樣中的主要嘌呤堿。3-甲基黃嘌呤含量也有大幅度增加。

普洱茶是以地理標志保護范圍內(nèi)的云南大葉種[Camellia sinensis Var. assamica (Mast.) Kitamura]曬青毛茶為原料，利用一定工藝制成的具有獨特品質(zhì)特征的茶葉[23]。現(xiàn)代研究證實，普洱茶具有減少腰部脂肪堆積、抗氧化、抗癌以及降低動脈硬化風(fēng)險等功效[24-26]。利用特定微生物接種發(fā)酵開發(fā)具有某種功能性成分的普洱茶成為當務(wù)之急。本文通過對普洱茶發(fā)酵過程中特定微生物的篩選，鑒定出一株降咖啡堿的優(yōu)勢菌株，為低咖啡堿普洱茶產(chǎn)品的開發(fā)提供了菌種。

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Screen and Identification of Fungi Strain Degrading Caffeine in Pu-erh Tea during Solid-state Fermentation

MA Cunqiang1,2, ZHOU Binxing1,3*, WANG Hongzhen1, WANG Pan1

1. LongRun Pu-erh Tea College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Kunming Dapu Tea Industry co., Kunming 650224, China; 3. College of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China

To identify fungi strain involved in caffeine degradation in Pu-erh tea, caffeine liquid medium was used to screen target strain in Pu-erh tea of different stages during solid-state fermentation. The candidate strains were then analyzed for colony morphology, morphological characteristics and 18 S rDNA. The target strain was inoculated into tea for fermentation. Caffeine, theophylline, theobromine and 3-methylxanthine were determined by HPLC during the fermentation process. Results showed that the most effective strain was isolated from Pu-erh tea during solid-state fermentation, which could degrade 87.70% caffeine within 48 hours and was identified as Aspergillus sydowii with similarity of 99.8%. During the inoculated fermentation with Aspergillus sydowii, caffeine declined sharply and only 0.414%±0.077% (w/w) was reserved. Theophylline increased significantly from less than 0.1% (w/w) to 2.129% ±0.246% (w/w) and became the major purine alkaloid. Theobromine was relatively stable without significant change (P＜0.05). The 3-Methylxanthine content had an obvious increase by 130%. The fungi stain was firstly isolated and identified to be involved in caffeine degradation, which confirmed fungus will facilitate the production of decaffeinated Pu-erh tea. In addition, caffeine biotransformation products were developed.

Aspergillus sydowii, caffeine, theophylline, Pu-erh tea, solid-state fermentation

TS272.5+4；Q946.88

A

1000-369X（2017）02-211-09

2017-02-10

2017-02-15

紫鵑茶樹調(diào)控花色苷生物合成的MBW轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體研究（C161104）、中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）

馬存強，男，碩士研究生，主要從事茶葉加工與綜合利用研究。*通訊作者：bxzhou01@126.com