吳文亮，林勇，劉仲華，黃建安，龍志榮，滕翠琴，馬士成，邱瑞瑾，曹中環(huán)

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4. 梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543003；5. 梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 梧州543003；6. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125

六堡茶急性和亞急性毒性安全性評(píng)價(jià)研究

吳文亮1,2,3,6，林勇1,2,3*，劉仲華1,2,3，黃建安1,2,3，龍志榮4,5，滕翠琴4,5，馬士成4,5，邱瑞瑾4,5，曹中環(huán)4,5

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4. 梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543003；5. 梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 梧州543003；6. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125

六堡茶產(chǎn)制歷史悠久，是廣西特色名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，但其安全性研究不夠。為了探明六堡茶飲用的安全性，本實(shí)驗(yàn)以廣西梧州六堡茶為原料，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分析六堡茶常規(guī)理化成分；并按照食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序，進(jìn)行較系統(tǒng)的六堡茶急性毒性和亞急性毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：六堡茶理化指標(biāo)符合廣西地方標(biāo)準(zhǔn)，且3個(gè)批次有較好的重復(fù)性；在小鼠急性毒性試驗(yàn)中，采用bliss法計(jì)算得出六堡茶半數(shù)致死劑量（LD50）為9.38 g·kg-1，95%的可信限為8.43～10.44 g·kg-1，大于5 g·kg-1的經(jīng)口急性毒性標(biāo)準(zhǔn)；采用大鼠30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，期間動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育良好，六堡茶 3個(gè)劑量組（0.47 g·kg-1·d-1、0.94 g·kg-1·d-1、1.88 g·kg-1·d-1）的動(dòng)物體質(zhì)量、血常規(guī)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、臟器指數(shù)與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。因此從食品毒理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，六堡茶屬于無(wú)毒級(jí)食品，符合食品安全性要求。

六堡茶；急性毒性；亞急性毒性；半致死劑量

六堡茶作為黑茶家族的重要成員，是廣西特色名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，因原產(chǎn)于廣西梧州市蒼梧縣六堡鎮(zhèn)而得名，至今已有一千五百多年的歷史，遠(yuǎn)銷(xiāo)日本、東南亞各國(guó)及粵港澳地區(qū)，是廣西傳統(tǒng)的出口產(chǎn)品[1]。近年來(lái)，隨著黑茶的熱銷(xiāo)，使得同屬黑茶類(lèi)的六堡茶倍受消費(fèi)者青睞，六堡茶消費(fèi)市場(chǎng)不斷升溫，現(xiàn)在也日漸為內(nèi)地其他地方消費(fèi)者認(rèn)可；品牌價(jià)值不斷提升，目前年產(chǎn)量已超1萬(wàn)t，產(chǎn)值達(dá)10億元以上，2016年6月《2016中國(guó)茶葉區(qū)域公用品牌價(jià)值排行榜》發(fā)布，六堡茶品牌價(jià)值 15.79億元，居中國(guó)茶葉區(qū)域品牌價(jià)值第28位、黑茶類(lèi)第3位、廣西茶類(lèi)第1位。

根據(jù)世界貿(mào)易組織（WTO）的有關(guān)協(xié)定要求和食品法典委員會(huì)（CAC）的有關(guān)準(zhǔn)則，食品安全性評(píng)價(jià)是食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定的重要依據(jù)[2]。同時(shí)，應(yīng)用食品毒理學(xué)的方法對(duì)食品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，可為我們正確認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)食品新資源提供可靠的技術(shù)保障。六堡茶作為我國(guó)傳統(tǒng)飲品，已有較久的安全飲用歷史，從某種意義上講，可基本認(rèn)為飲用六堡茶的主導(dǎo)產(chǎn)品是安全的，但六堡茶生產(chǎn)中存在一系列微生物參與的渥堆工序，增加了成品茶代謝產(chǎn)物及生化成分的復(fù)雜性和鑒定難度。因此對(duì)六堡茶進(jìn)行有效的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)是保證六堡茶質(zhì)量安全，保障出口（衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際接軌），促進(jìn)茶葉消費(fèi)和產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的必由之路。

從目前的黑茶安全性研究來(lái)看，僅見(jiàn)對(duì)云南普洱茶和湖南安化黑茶進(jìn)行過(guò)較為系統(tǒng)的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)[2-6]。而作為黑茶大家族中的一個(gè)很重要成員——廣西六堡茶的安全性評(píng)價(jià)研究涉及較少，尤其是特別重要的六堡茶急性及亞急性毒性安全性評(píng)價(jià)研究缺乏相關(guān)確切的試驗(yàn)數(shù)據(jù)[7]。這樣必然會(huì)影響到六堡茶及整個(gè)黑茶產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展?；诖?，本研究以六堡茶質(zhì)量安全特性為出發(fā)點(diǎn)，參照食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序[8-9]，開(kāi)展六堡茶的急性及亞急性毒理學(xué)試驗(yàn)并對(duì)質(zhì)量安全問(wèn)題進(jìn)行理論分析，為促進(jìn)六堡茶及黑茶消費(fèi)熱的興起提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 茶葉原料

六堡茶（三鶴牌，批號(hào)：0128、0211、0401）由廣西壯族自治區(qū)梧州茶廠提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種（KM）小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量 18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-003。

SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量60～80g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-004。

基礎(chǔ)飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分：粗蛋白24.3%，粗脂肪7.5%，粗纖維3.5%，粗灰粉8.6%，鈣1.16%，磷0.7%，含水量7.5%。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

LC10AT-VP Plus高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本 Shimadzu公司），TBA-40FR型全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝公司），血液細(xì)胞分析儀（美國(guó)貝克曼公司），MODULYOD-230冷凍干燥機(jī)（廣州三元科技有限公司），EASYpureⅡ純水儀（杭州普瑞科技有限公司），SK3300LH超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司），ABl04-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），灌胃器等。1.1.4 試驗(yàn)試劑

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase，AST)、血糖（Glucose，Glu）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒均購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司（批號(hào)：20160622）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樣干粉制備

取六堡茶樣品100 g，用沸水3次浸提（每次的料液比為 1∶10，浸提時(shí)間分別為 20 min），紗布過(guò)濾，合并3次浸提茶湯，減壓濃縮至 100 mL，再將濃縮的茶湯于－20℃預(yù)凍12 h，放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥后收集、稱(chēng)重、密封包裝，－20℃保存。

1.2.2 茶樣常規(guī)成分測(cè)定

水浸出物的測(cè)定按GB/T 8302—2002《茶水浸出物測(cè)定》方法，水分的測(cè)定按 GB/T 8304—2002《茶 水分測(cè)定》方法，茶多酚的測(cè)定按GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》，咖啡堿的測(cè)定按GB/T 8312—2002《茶 咖啡堿測(cè)定》方法，氨基酸的測(cè)定按GB/T 8314—2002《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》方法。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)：①預(yù)測(cè)試動(dòng)物全死和不死劑量：參照文獻(xiàn)[2]的方法，取體質(zhì)量18～22 g健康昆明小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，用蒸餾水溶解茶樣干粉配置1個(gè)高濃度的茶樣劑量（0.3 g·mL-1），再稀釋設(shè)置組距3～10倍的多個(gè)劑量組，以4只小鼠為1組，對(duì)各組試驗(yàn)小鼠采用經(jīng)口灌胃，每次灌胃劑量20 mL·kg-1；對(duì)高劑量組采取1日內(nèi)2或3次灌胃，每次間隔4 h。常規(guī)觀察飼養(yǎng) 7 d，記錄各組動(dòng)物死亡和中毒癥狀，測(cè)試出茶樣的全死和不死劑量。②茶樣LD50的測(cè)定：根據(jù)上述預(yù)測(cè)試結(jié)果，參照文獻(xiàn)方法[3,10]對(duì)茶樣分別在全死與無(wú)死劑量間按 0.8等比設(shè) 4～6個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組用18～22 g小鼠10只，雌雄各半，另設(shè)純水對(duì)照組。試驗(yàn)時(shí)，小鼠禁食給水 12 h后，以 20 mL·kg-1的灌胃劑量對(duì)每只小鼠灌胃一定濃度的茶湯。對(duì)于高劑量組，可以采取1日內(nèi)多次灌胃，每次間隔4 h。對(duì)灌胃后小鼠活動(dòng)狀況、死亡時(shí)間、體質(zhì)量及取食狀況進(jìn)行觀察記錄，并對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢。檢查各組織和臟器的體積、顏色、質(zhì)地等有無(wú)異常，如有異常及時(shí)取材，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。觀察 14 d后用Bliss法對(duì)各茶樣劑量組的動(dòng)物死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)氣溫20～25℃，濕度70%～90%，光照12 h·d-1。

亞急性毒性試驗(yàn)：①大鼠30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：取4周齡健康SD大鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后，隨機(jī)分4個(gè)組（空白對(duì)照組、六堡茶低劑量組、中劑量組、高劑量組），每組20只，雌雄各半，分籠喂養(yǎng)。按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》的毒理學(xué)檢驗(yàn)方法的要求[8]，茶 湯劑量分 別為 470 mg·kg-1·d-1、 940 mg·kg-1·d-1、1 880 mg·kg-1·d-1（1/20 LD50、1/10 LD50、1/5 LD50），每天灌服1次，連續(xù)30 d，每周稱(chēng)體質(zhì)量一次，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，灌胃蒸餾水。②指標(biāo)觀察與檢測(cè)：每天觀察大鼠的行為、活動(dòng)、飲食、睡眠、毛色、糞便等的變化。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，大鼠禁食過(guò)夜后，稱(chēng)體質(zhì)量，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，眼眶取血2份，一份血樣抗凝處理用動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)目（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)目（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、平均血小板體積（MPV）、淋巴細(xì)胞比值（Lymph）、單核細(xì)胞比例（Mon）、粒細(xì)胞比例（Gran）、等；另一份血樣分離血清用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、血糖（Glu）。然后處死和解剖大鼠，進(jìn)行大體觀察，取肝、心、脾、肺、腎、睪丸稱(chēng)重，并計(jì)算臟器指數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析用SPSS 10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果

食品毒理學(xué)為開(kāi)發(fā)食品新資源提供可靠的技術(shù)保障，化學(xué)分析法是食品毒理學(xué)評(píng)價(jià)的重要手段，為正確認(rèn)識(shí)和安全使用食品及添加劑提供有效的技術(shù)支持。六堡茶生化成分的分析研究已有報(bào)道，茶葉的常規(guī)成分測(cè)定是對(duì)實(shí)驗(yàn)茶樣的情況作簡(jiǎn)要判斷。本試驗(yàn)選檢幾個(gè)主要測(cè)試項(xiàng)目，以對(duì)所試茶樣的情況作簡(jiǎn)要界定。結(jié)果如表1所示，3個(gè)批次六堡茶樣品的常規(guī)成分中水浸出物、水分、茶多酚、咖啡堿和氨基酸總量平均含量分別 為 (36.79±1.56)% 、 (10.13±0.78)% 、(11.54±1.06)%、(3.21±0.24)%和(1.63±0.12)%，符合六堡茶的廣西地方標(biāo)準(zhǔn)，表明所選茶樣的常規(guī)成分具有較好的代表性。

表1 六堡茶常規(guī)成分測(cè)定結(jié)果Table 1 Measured results of conventional composition in Liupao tea %

2.2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 經(jīng)口灌胃后一般觀察及急性毒性結(jié)果

由預(yù)試得出小鼠灌胃給予不同劑量茶樣后產(chǎn)生 0～100%死亡率的劑量大致是：6～15 g·kg-1，故以15 g·kg-1作為本試驗(yàn)的最高劑量，按 0.8等比設(shè)置 6個(gè)茶湯劑量進(jìn)行六堡茶急性毒性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果如表 2所示，在灌胃茶湯劑量為6.1 g·kg-1及以下時(shí)，小鼠全部存活無(wú)死亡現(xiàn)象，且表現(xiàn)較為活躍，活動(dòng)增加，對(duì)刺激較為敏感，均未見(jiàn)有明顯毒性反應(yīng)現(xiàn)象。從7.7 g·kg-1劑量開(kāi)始，小鼠出現(xiàn)死亡，大多數(shù)死亡時(shí)間都是在灌胃后 4 h以后，中毒反應(yīng)基本于灌胃后20 min左右出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為活動(dòng)減少、震顫、豎尾、呼吸減慢、驚厥等，且其程度隨著劑量增加而增加，深度中毒者于灌胃后30 min開(kāi)始死亡；在茶湯劑量為 12 g·kg-1的實(shí)驗(yàn)組中只有 1只小鼠存活，且存活小鼠灌胃后10 min即表現(xiàn)活動(dòng)減少、閉眼、強(qiáng)直震顫、取食減少等，次日才開(kāi)始恢復(fù)睜眼取食、活動(dòng)增加；而在劑量為 15 g·kg-1的實(shí)驗(yàn)組中小鼠全部死亡。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)器官異?，F(xiàn)象；對(duì)照急性毒性試驗(yàn)觀察的動(dòng)物反應(yīng)指標(biāo)[11]表明，中毒部位可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。

2.2.2 急性毒性統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

六堡茶的急性毒性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表 3所示。急性毒性試驗(yàn)中半致死劑量（LD50）的計(jì)算有多種方法[12]，本試驗(yàn)采用Bliss法對(duì)茶樣的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其結(jié)果如下：計(jì)算得出六堡茶的半致死劑量 LD50為9.38 g·kg-1，由于試驗(yàn)誤差的不確定性，其LD50有95%的可能性在8.43～10.44 g·kg-1之間，回歸方程為y=－6.845+12.182Log(x)。根據(jù)1977年 WHO頒布的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[12]以及國(guó)家頒布分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，六堡茶的經(jīng)口急性毒性的 LD50大于 5 g·kg-1，因此，六堡茶樣可以判定為 2級(jí)（實(shí)際無(wú)毒）。

表2 急性毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況Table 2 The animal death of acute toxicity experiment

表3 急性毒性實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis of acute toxicity experiments

2.2.3 對(duì)各組小鼠體質(zhì)量的影響

在急性毒性實(shí)驗(yàn)灌胃后對(duì)存活的小鼠進(jìn)行稱(chēng)重觀察，計(jì)算其平均體質(zhì)量和偏差值。結(jié)果如表4所示，六堡茶灌胃處理后，各劑量組存活小鼠在1～3 d內(nèi)體質(zhì)量增加緩慢。與對(duì)照組相比，基本上呈顯著性差異（P＜0.05）。灌胃5 d和7 d以后，小鼠體質(zhì)量增速有所加快，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系；與對(duì)照組比較，低劑量組（4.9 g·kg-1和6.1 g·kg-1）小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異，高劑量組（7.7～12 g·kg-1）基本呈現(xiàn)了顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。這些結(jié)果表明低劑量六堡茶湯灌胃對(duì)小鼠體質(zhì)量影響較小，接近于半致死劑量的六堡茶湯灌胃對(duì)小鼠體質(zhì)量影響較大，可能由于六堡茶濃度過(guò)高引起中毒而造成機(jī)體損傷。

2.2.4 半致死劑量與內(nèi)含成分含量的關(guān)系

為了探討六堡茶可能的致死原因，我們初步分析了六堡茶半致死劑量與主要內(nèi)含成分茶多酚和咖啡堿含量的關(guān)系。陸益等[13]的研究表明，茶多酚的 LD50為 2 640 mg·kg-1；根據(jù)我國(guó)食品添加劑手冊(cè)記載：咖啡堿對(duì)小鼠的LD50為 127～248 mg·kg-1[14]。本研究結(jié)果如表5所示，六堡茶 LD50灌胃劑量時(shí)茶多酚和咖啡堿含量分別為1082 mg·kg-1和301 mg·kg-1，已大于咖啡堿的 LD50，同時(shí)也接近茶多酚的LD50的一半。由此可以推斷，小鼠死亡的原因可能與過(guò)高濃度的咖啡堿甚至茶多酚中毒有關(guān)。

表4 各組動(dòng)物平均體質(zhì)量情況Table 4 Weight of animals in each group

表5 六堡茶半致死劑量時(shí)的茶多酚和咖啡堿含量Table 5 Contents of tea polyphones and caffeine in Liupao tea of LD50

表6 六堡茶水提物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Table 6 Effect of Liupao tea extract on the body weight of rats g

表6 六堡茶水提物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Table 6 Effect of Liupao tea extract on the body weight of rats g

注：試驗(yàn)總天數(shù)為30 d，第4周的天數(shù)為9 d。Note: The total number of days for the test is 30 days. The number of days for fourth week was set to 9 days.

性別Sex組別Groups初重Initial weight第1周First week第2周Second week第3周Third week第4周Fourth week♂空白對(duì)照組 69.5±6.6 113.5±12.3 161.3±10.9 198.5±16.3 239.2±15.4六堡茶低組 69.8±8.3 110.8±10.2 158.5±18.4 194.5±21.4 235.7±18.0六堡茶中組 70.1±5.4 114.3±14.6 160.2±20.3 196.5±15.8 232.5±15.9六堡茶高組 68.7±7.5 111.6±9.1 156.2±15.7 189.7±22.1 228.9±17.3♀空白對(duì)照組 67.9±7.2 104.7±10.8 143.6±16.5 168.9±15.9 197.1±13.8六堡茶低組 66.1±6.7 103.9±8.5 145.2±14.8 170.3±17.6 196.5±12.7六堡茶中組 65.3±5.8 104.4±15.1 141.9±13.4 164.6±14.7 190.8±16.4六堡茶高組 67.5±6.2 101.8±14.6 143.0±17.6 165.5±20.5 191.0±18.8

2.3 亞急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 動(dòng)物一般表現(xiàn)

在連續(xù)30 d的灌胃過(guò)程中，與對(duì)照組比，各給藥組動(dòng)物只在初灌六堡茶水提物后活動(dòng)略減少，未見(jiàn)飲食、睡眠、毛色、糞便、自主活動(dòng)等方面的明顯異常，表明連續(xù) 30 d給大鼠灌服六堡茶水提物，對(duì)大鼠一般狀況無(wú)明顯影響。

2.3.2 六堡茶對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 6。以 470、940和 1 880 mg·kg-1·d-13個(gè)劑量的六堡茶樣給大鼠灌胃30 d，實(shí)驗(yàn)期間，各劑量組雌雄大鼠每周的體質(zhì)量與對(duì)照組比較，體質(zhì)量有減輕的趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明長(zhǎng)期灌胃六堡茶水提物對(duì)大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

2.3.3 對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響

以不同劑量的六堡茶水提物給大鼠灌胃30 d后，將每組大鼠活體取血進(jìn)行血象檢查。表7顯示，與對(duì)照組相比，各劑量組雌雄大鼠的紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、平均血小板體積（MPV）均無(wú)顯著差異（P＞0.05），且都在正常范圍之內(nèi)。表8也指出，灌胃六堡茶水提物對(duì)雌雄大鼠的白細(xì)胞總數(shù)（WBC）及其分類(lèi)（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）影響不顯著（P＞0.05）。這些結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)期飲用六堡茶對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)無(wú)明顯不良影響。

2.3.4 對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)的影響

以3個(gè)劑量的六堡茶給大鼠灌胃30 d后，將大鼠處死解剖，取肝、腎、脾、肺、睪丸、卵巢，稱(chēng)重并計(jì)算臟器指數(shù)（表 9）。與空白對(duì)照組比較，六堡茶各劑量組大鼠的臟器指數(shù)差異性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明長(zhǎng)期飲用六堡茶對(duì)大鼠臟器指數(shù)無(wú)影響。

2.3.5 對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)及肝功能的影響

如表10所示，以3個(gè)劑量的六堡茶給大鼠灌胃 30 d后，將所有老鼠活體取血進(jìn)行血液生化指標(biāo)及肝功能檢查。與正常組相比，六堡茶各劑量組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、血糖（GLU）水平基本沒(méi)有明顯的差異（P＞0.05），但 TG和TC的水平有降低的趨勢(shì)。這些結(jié)果說(shuō)明六堡茶對(duì)大鼠代謝和肝腎功能無(wú)明顯不良影響，且能促進(jìn)脂質(zhì)的代謝。

3 討論

目前六堡茶安全性研究還不夠細(xì)致深入，尤其是急性和亞急性毒性試驗(yàn)涉及較少，但它是安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，最能直觀體現(xiàn)出六堡茶的毒性大小。

表7 六堡茶水提物對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響Table 7 Effect of Liupao tea extract on the haematological index of rats

表7 六堡茶水提物對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響Table 7 Effect of Liupao tea extract on the haematological index of rats

性別Sex組別Groups紅細(xì)胞總數(shù)RBC/×1012·L-1紅細(xì)胞壓積HCT/%平均紅細(xì)胞體積MCV/f L紅細(xì)胞分布寬度變異系RDW/%平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度MCHC/g·L-1平均血小板體積MPV/f L♂空白對(duì)照組 6.9±0.5 41.3±1.7 62.9±3.5 12.2±1.4 338.2±8.6 6.5±1.1六堡茶低組 6.6±0.7 42.4±2.8 63.3±4.1 10.9±1.5 337.4±6.3 6.2±0.9六堡茶中組 6.8±0.5 39.8±2.5 61.8±2.9 11.6±0.8 343.6±7.0 5.8±0.4六堡茶高組 6.4±0.8 38.5±6.9 62.1±3.8 11.4±1.0 339.1±7.2 5.9±0.5♀空白對(duì)照組 7.1±0.2 40.7±4.2 64.1±2.5 12.8±0.8 330.2±7.5 6.2±0.7六堡茶低組 7.2±0.5 39.6±2.7 62.4±4.2 12.3±0.6 327.7±8.1 6.3±1.0六堡茶中組 7.0±0.4 41.1±3.8 61.8±1.8 11.9±1.2 326.8±4.6 5.9±0.8六堡茶高組 6.9±0.2 39.2±3.6 61.4±3.1 11.8±1.4 333.2±9.0 5.6±1.2

表8 六堡茶水提物對(duì)大鼠白細(xì)胞的影響Table 8 Effect of Liupao tea extract on the white blood cell of rats

表8 六堡茶水提物對(duì)大鼠白細(xì)胞的影響Table 8 Effect of Liupao tea extract on the white blood cell of rats

性別Sex組別Groups白細(xì)胞數(shù)目WBC/×109·L-1白細(xì)胞分類(lèi)Classification of white blood cell/%淋巴細(xì)胞 Lymph 單核細(xì)胞 Mon 中性粒細(xì)胞 Gran♂空白對(duì)照組 10.4±3.2 73.8±3.4 5.1±0.9 21.1±2.9六堡茶低組 10.1±4.7 74.1±5.2 4.6±0.7 21.3±5.2六堡茶中組 11.6±3.8 73.6±1.3 4.4±0.8 22.0±4.3六堡茶高組 12.7±3.5 73.3±2.6 4.5±0.5 22.2±3.2♀空白對(duì)照組 9.8±4.1 73.5±4.1 5.5±0.5 21.0±4.5六堡茶低組 10.4±3.6 72.3±6.3 5.6±0.6 22.1±3.7六堡茶中組 9.6±3.2 73.0±3.8 5.1±0.4 21.9±3.8六堡茶高組 11.3±2.9 72.7±4.0 4.9±0.9 22.4±5.0

表9 六堡茶對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)的影響Table 9 Effect of liupao tea on the main organ index of rats %

表9 六堡茶對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)的影響Table 9 Effect of liupao tea on the main organ index of rats %

性別Sex組別Groups肝Liver腎Kidney脾Spleen睪丸或卵巢Testis or ovary心Heart肺Lung♂空白對(duì)照組 3.04±0.15 0.80±0.08 0.22±0.05 0.92±0.09 0.35±0.05 0.47±0.04六堡茶低組 3.17±0.24 0.84±0.07 0.23±0.03 0.94±0.10 0.35±0.08 0.48±0.05六堡茶中組 3.03±0.29 0.84±0.10 0.21±0.03 1.02±0.14 0.38±0.06 0.50±0.08六堡茶高組 3.15±0.31 0.87±0.12 0.25±0.02 0.98±0.07 0.37±0.03 0.51±0.06♀空白對(duì)照組 3.16±0.30 0.85±0.06 0.23±0.04 0.07±0.01 0.36±0.08 0.50±0.07六堡茶低組 3.21±0.26 0.88±0.10 0.25±0.07 0.07±0.02 0.37±0.05 0.49±0.10六堡茶中組 3.13±0.32 0.86±0.07 0.28±0.11 0.08±0.01 0.40±0.11 0.52±0.08六堡茶高組 3.28±0.21 0.90±0.05 0.26±0.06 0.08±0.03 0.39±0.07 0.53±0.12

表10 六堡茶對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)及肝功能的影響Table 10 Effect of Liupao tea on blood biochemical parameters and liver functions of rats

表10 六堡茶對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)及肝功能的影響Table 10 Effect of Liupao tea on blood biochemical parameters and liver functions of rats

性別 Sex 組別 Groups ALT/U·L-1 AST/U·L-1 TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 HDL-C/mmol·L-1 GLU/mmol·L-1♂空白對(duì)照組 51.3±3.4 194.5±31.8 2.34±0.43 1.04±0.16 1.05±0.12 6.98±1.31六堡茶低組 52.6±9.0 200.7±30.5 2.26±0.25 0.93±0.13 0.98±0.21 6.85±0.90六堡茶中組 58.1±10.8 212.4±38.1 2.18±0.41 1.01±0.22 1.01±0.19 7.04±0.58六堡茶高組 55.9±6.5 199.6±45.2 2.25±0.35 0.97±0.31 0.94±0.17 7.09±0.82♀空白對(duì)照組 49.7±6.2 191.3±36.9 2.30±0.57 1.08±0.19 1.16±0.20 7.07±0.36六堡茶低組 49.3±10.5 196.9±22.8 2.07±0.44 1.01±0.28 0.98±0.22 7.12±0.55六堡茶中組 53.6±7.1 201.8±31.4 2.23±0.40 0.99±0.32 1.07±0.16 7.03±1.09六堡茶高組 54.1±5.8 206.5±29.6 2.15±0.62 0.95±0.24 1.02±0.24 7.08±0.67

本研究在急性毒性試驗(yàn)中測(cè)得六堡茶半致死劑量為 9.38 g·kg-1，大于 5 g·kg-1的經(jīng)口急性毒性標(biāo)準(zhǔn)，可以判定為實(shí)際無(wú)毒。從小鼠中毒及死亡癥狀如強(qiáng)直震顫、搖頭、呆滯、閉眼、豎尾驚厥、臨死前僅幾秒鐘的掙扎，可以初步推測(cè)六堡茶致小鼠中毒及死亡為中樞神經(jīng)毒性引起；六堡茶內(nèi)含成分分析表明，半死劑量的六堡茶含有較高濃度的茶多酚和咖啡堿（1 082 mg·kg-1和 301 mg·kg-1），已大于咖啡堿的 LD50，同時(shí)也較為接近茶多酚LD50的一半。已有研究認(rèn)為，過(guò)高濃度的咖啡堿能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能造成損傷[15]。由此可以進(jìn)一步推斷小鼠死亡的原因可能與過(guò)高濃度的咖啡堿甚至茶多酚引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)。六堡茶亞急性毒性實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物飲食、排泄、活動(dòng)均正常，未觀察到中毒表現(xiàn)。六堡茶各劑量組動(dòng)物體質(zhì)量、血液學(xué)、血液生化指標(biāo)以及臟器指數(shù)較對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），主要臟器在外觀形態(tài)上未發(fā)現(xiàn)有明顯病理變化。這些結(jié)果表明，六堡茶對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響，對(duì)動(dòng)物的造血功能、肝腎功能、器官組織均無(wú)明顯毒性。但是六堡茶的灌胃能一定程度地降低大鼠體質(zhì)量以及血清TG和TC含量，也一定程度地驗(yàn)證了它可能具有降脂減肥的功效[16-17]，但仍然需要后續(xù)進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

因此，從急性和亞急性毒理學(xué)角度看，廣西六堡茶的飲用安全性是非常高的，正常飲用六堡茶對(duì)人類(lèi)身體并無(wú)有害影響，但任何東西的使用都應(yīng)該在一個(gè)合理的范圍，超出了這個(gè)范圍就不可能發(fā)揮好的作用甚至引起副作用。本研究為六堡茶的安全性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]龍志榮, 馬士成, 梅宇, 等. 六堡茶產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)形勢(shì)分析報(bào)告[J]. 廣東茶業(yè), 2013(3): 23-27.

[2]劉勤晉, 陳文品, 白文祥, 等. 普洱茶急性毒性安全性評(píng)價(jià)研究報(bào)告[J]. 茶葉科學(xué), 2003, 23(2): 141-145.

[3]馬偉光, 黃之鐠, 游文龍, 等. 配方普洱茶的急性毒性研究[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(1): 9-12.

[4]龔加順, 陳文品, 周紅杰, 等. 云南普洱茶特征成分的功能與毒理學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 茶葉科學(xué), 2007, 27(3): 201-210.

[5]肖文軍, 傅冬和, 任國(guó)譜, 等. 茯茶毒理學(xué)試驗(yàn)報(bào)告[J].茶葉科學(xué), 2007, 27(4): 307-310.

[6]劉子音, 王遠(yuǎn)亮, 許愛(ài)清. “金花” 菌食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊, 2011(7): 29-32.

[7]覃良, 黃宇聲, 劉冠萍. 六堡茶毒性研究[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志, 2013(3): 39-40.

[8]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[Z]. 衛(wèi)法監(jiān)發(fā) [2003]42號(hào). 2003.

[9]陳仁惇. 營(yíng)養(yǎng)保健食品[M]. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2006.

[10]徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 2版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 1991.

[11]紀(jì)云晶. 實(shí)用毒理學(xué)手冊(cè)[M]. 北京: 中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 1991.

[12]袁伯俊, 王治喬. 新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐[M]. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 1997.

[13]陸益, 楊帆, 梁寧生, 等. 茶多酚毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 22(6): 831-834.

[14]陳亮延, 吳永方. 茶色素毒理學(xué)研究[J]. 武漢職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 24(4): 25-27.

[15]黃旭, 李晨曦, 汪越, 等. 咖啡因?qū)Υ笫蠛ｑR神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2014(1): 5-8.

[16]張栩顏, 黃宇聲, 劉冠萍, 等. 六堡茶對(duì)高脂血癥小鼠血脂及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐, 2013, 26(5): 563-564.

[17]黃宇聲, 張栩顏, 劉冠萍, 等. 六堡茶降脂作用試驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng): 下半月, 2013(3): 875-876.

Research on Acute and Subacute Toxicity Evaluation of Liupao Tea

WU Wenliang1,2,3,6, LIN Yong1,2,3*, LIU Zhonghua1,2,3, HUANG Jian'an1,2,3, LONG Zhirong4,5, TENG Cuiqing4,5, MA Shicheng4,5, QIU Ruijin4,5, CAO Zhonghuan4,5

1. Key Lab of Tea Science of Education Ministry, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 4. Wuzhou Academy of Liupao Tea, Wuzhou 543003, China; 5. Wuzhou Institute of Agricultural Sciences, Wuzhou 543003, China; 6. Tea of Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences , Changsha 410125, China

Liupao tea has a long history and is characterized as famous agricultural products of Guangxi, but the study of its safety is not enough. In order to verify the safety, the main physicochemical components of Liupao tea from Wuzhou were measured by conventional test method of national standard, then, the acute and subacute toxicities of Liupao tea were systemically studied in accordance with the procedures for toxicological assessment on food safety. The experimental results showed that, the physicochemical indexes of Liupao tea were repeatable, whichwere followed with Guangxi local standards in the acute toxicity test. Using bliss method, the calculated median lethal dose (LD50) of Liupao tea was 9.38 g·kg-1with 95% confidence interval (8.43～10.44 g·kg-1), which was higher than acute toxicity criteria (5 g·kg-1). In the subacute study, compared with the control group, no death or clinical signs, or abnormally hematological, biochemical and histopathological changes were found in either groups of rats receiving daily oral gavage of Liupao tea. The three dose treatments were 0.47, 0.94 and 1.88 g·kg-1·d-1for 30 days (P＞0.05). Thus, Liupao tea products belong to the actual non-toxic grade and fulfill the requirements of food safety according to the food toxicology standards.

Liupao tea, acute toxicity, subacute toxicity, median lethal dosage

TS272.5+4；R285.5

A

1000-369X（2017）02-173-09

2017-01-11

2017-02-26

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（15QN22）、梧州市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201402214、201501028）、2015年梧州市六堡茶產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100502）

吳文亮，男，在讀博士研究生，主要從事茶葉加工及茶葉功能成分化學(xué)研究。*通訊作者：ly2005306@163.com