段學(xué)藝，高秀兵，曹 雨，趙華富，張 圓，何 萍，胡華健(貴州省茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】咖啡堿(1，3，7-三甲基黃嘌呤)是茶葉中嘌呤堿的主體成分[1]，約占茶葉干物質(zhì)的2 %～5 %[2]。茶葉咖啡堿具有興奮中樞神經(jīng)，改良心臟機(jī)能，提神、醒腦，提高思維效率，增強(qiáng)肝代謝功能等作用，同時(shí)還有利尿、分解脂肪的功效[3-6]。但是過(guò)量攝入咖啡堿，會(huì)導(dǎo)致高血壓、心率不齊[7-8]，引起鈣流失、骨質(zhì)疏松[9-10]和流產(chǎn)[11-12]等不良反應(yīng)。鑒于茶葉消費(fèi)的廣泛性和咖啡堿藥理作用的復(fù)雜性，GB 2760-2014規(guī)定可樂(lè)飲料中咖啡堿最高限量≤150 mg/kg[13]，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定可樂(lè)等飲料中咖啡堿≤200 mg/mL[14]。因此，選育低咖啡堿茶樹(shù)新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)80年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外一直在進(jìn)行茶葉脫除咖啡堿的研究工作，主要有萃取法、超臨界CO2提取、熱水浸提法和色譜吸附法等方法[15-18]。但是有關(guān)脫除茶葉咖啡堿的系統(tǒng)研究和有效方法較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】要從根本上降低茶葉咖啡堿，還是要從茶樹(shù)育種和栽培學(xué)等研究途徑著手，通過(guò)常規(guī)的茶樹(shù)育種方法篩選低咖啡堿茶樹(shù)新品種[19-22]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取貴州3種古茶樹(shù)資源與16個(gè)選育茶樹(shù)品種，提取茶樹(shù)嫩葉的咖啡堿合成酶[23]；體外進(jìn)行咖啡堿合成的酶促反應(yīng)[24]，HPLC測(cè)定反應(yīng)后各體系咖啡堿的含量[25]，比較19份茶樹(shù)資源的咖啡堿合成酶(TCS)活性，以篩選出咖啡堿合成酶活性低的茶樹(shù)資源，為選育低咖啡堿茶樹(shù)新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 茶樹(shù)資源

19份茶樹(shù)資源分別為龍井長(zhǎng)葉、龍井、保靖黃金茶、烏牛早、丹桂、盤(pán)縣大茶樹(shù)、浙農(nóng)、黃金葉、福鼎大白茶、黔湄601、黃金芽、七舍大茶樹(shù)、金觀(guān)音、鐵觀(guān)音、中茶108、晴隆大茶樹(shù)、香山早、安吉白茶和梅占，其嫩葉均采摘自貴州省茶葉研究所的種質(zhì)資源圃。

1.2 咖啡堿合成酶的提取

將新鮮茶樹(shù)嫩葉剪成小片，并立即放入-20 ℃冰箱冷凍1 h。將冷凍嫩葉樣品2 g、聚乙烯吡咯烷酮1.2 g、石英砂0.6 g、100 mmol/L磷酸鉀鹽緩沖液(pH 7.3，含有5 mmol/L巰基乙醇，5 mmol/L EDTA，0.5 %抗壞血酸鈉)10 mL一起加入已冷凍的研缽中進(jìn)行勻漿。勻漿經(jīng)4層紗布過(guò)濾后離心(重力加速度為10 000 g，下同)20 min收集上清液，加入固體硫酸銨將上清液調(diào)至20 %(W/V)的飽和度，攪拌20 min后離心15 min繼續(xù)收集上層清液，再加入固體硫酸銨將上清液調(diào)至60 %(W/V)的飽和度，攪拌20 min后離心15 min棄上清液，將沉淀溶于上述磷酸鹽緩沖液中。最后將獲得的蛋白溶液進(jìn)行凝膠層析(葡聚糖凝膠G-25，層析柱規(guī)格為30 cm×2 cm)，洗脫劑為10 mmol/L磷酸鉀鹽緩沖液(pH 7.3，含有10 mmol/L巰基乙醇，2 mmol/L EDTA)。以上所有步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行。收集到的活性成分即為咖啡堿合成酶粗酶液，各取最先洗脫出的粗酶液1.5 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?，一般?周內(nèi)酶活力下降不顯著。

1.3 咖啡堿合成酶的體外酶促反應(yīng)及活性檢測(cè)

取400 μl咖啡堿合成酶粗酶液進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，反應(yīng)體系：咖啡堿合成酶粗酶液400 μl，1 μmol底物可可堿(theobromine)200 μl，1 μmol甲基供體S-腺苷蛋氨酸(S-adenosy-lL-metionine)50 μl。37 ℃反應(yīng)30 min后加入100 μl濃度為6 mol的HCl終止反應(yīng)。

高效液相檢測(cè)，色譜柱為Syncronis C18(4.6 mm×250 mm，5 μmol)；流動(dòng)相為乙腈-水，等度洗脫，洗脫比例為12︰88，檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量均為20 μl。

反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，取配制濃度為14.12 μg/mL的咖啡堿對(duì)照品溶液1、0.5、0.1 μl，進(jìn)行高效液相檢測(cè)，制作咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量。稱(chēng)取咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)：A20N6L6274，含量≥99 %)3.53 mg放入5 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容作為儲(chǔ)備液，再取0.5 mL儲(chǔ)備液置于25 mL容量瓶，用甲醇定容，得到14.12 μg/mL 咖啡堿對(duì)照品溶液。

圖1 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of caffeine

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

從圖1看出，咖啡堿進(jìn)樣質(zhì)量(x)與峰面積(y)的線(xiàn)性方程為y=3621.8x+1.8672，R2=1，表明其線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 19份茶樹(shù)資源嫩葉中咖啡堿的含量

從表1看出，七舍大茶樹(shù)在體外酶促反應(yīng)終止后咖啡堿含量最高，為0.900 μg/mL；其次是保靖黃金茶，為0.376 μg/mL；第三是黃金葉，為0.210 μg/mL；烏牛早、晴隆大茶樹(shù)、龍井茶葉等15份茶樹(shù)資源的咖啡堿含量為0.101～0.164 μg/mL，差異不明顯；最低是盤(pán)縣大茶樹(shù)，為0.089 μg/mL。

2.3 19份茶樹(shù)資源嫩葉中咖啡堿合成酶的活性

從表2看出，七舍大茶樹(shù)嫩葉的咖啡堿合成酶活性最高，為0.386 U/mL；其次是保靖黃金茶，為0.161 U/mL；黃金葉、烏牛早分別為0.090和0.070 U/mL；晴隆大茶樹(shù)、龍井長(zhǎng)葉、浙濃為0.043～0.067 U/mL，差異較??；盤(pán)縣大茶樹(shù)最低，僅0.038 U/mL。

3 討 論

茶葉中咖啡堿的含量與茶樹(shù)種質(zhì)資源特性有關(guān)，同時(shí)也與所處的自然環(huán)境和自身生長(zhǎng)期有關(guān)。不同品種茶葉中咖啡堿的含量差異很大；同一茶樹(shù)鮮葉中咖啡堿的合成較多，也是整個(gè)茶葉咖啡堿的主要來(lái)源。目前，關(guān)于不同氣候?qū)Σ枞~咖啡堿合成酶活性影響的研究較少，缺乏低咖啡堿茶樹(shù)資源適生分布區(qū)的調(diào)研，阻礙了低咖啡堿茶樹(shù)品種選育的進(jìn)程。

表1 茶樹(shù)資源嫩葉中咖啡堿合成酶體外酶促反應(yīng)終止后HPLC檢測(cè)結(jié)果Table 1 Caffeine content in tender leaves of 19 tea germplasm resources detected by HPLC after in-vitro enzymatic reaction end of caffeine synthase

表2 茶樹(shù)資源嫩葉中咖啡堿合成酶的酶活Table 2 Caffeine synthase activity in tender leaves of 19 tea germplasm resources

如何有效降低茶葉中咖啡堿含量一直是茶葉研究的熱點(diǎn)。目前，多采用理化方法在茶葉加工階段進(jìn)行咖啡堿的萃取、吸附、浸提等。雖然理化方法應(yīng)用較早，但不能解決根本問(wèn)題，且成本較高，不能有效保留茶葉中的香氣和滋味。利用基因工程對(duì)茶樹(shù)資源進(jìn)行改造，沉默咖啡堿合成酶中關(guān)鍵酶的基因，即抑制咖啡堿合成酶以及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表達(dá)，可降低茶葉中咖啡堿的含量。但是該法過(guò)程復(fù)雜、操作難度高，經(jīng)濟(jì)投入大，且降低咖啡堿的效果也不太理想。常規(guī)的茶樹(shù)育種或雜交方法篩選低咖啡堿茶樹(shù)新品種能有效降低茶葉的咖啡堿，是從本質(zhì)上降低咖啡堿的方法。但是該法選育低咖啡堿茶樹(shù)品種至少需要20 a左右，要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，且選育出的茶樹(shù)品種往往存在綜合性狀不良的缺點(diǎn)。通過(guò)收集低咖啡堿茶樹(shù)種質(zhì)資源，發(fā)掘品質(zhì)優(yōu)良的茶樹(shù)資源，再利用基因工程改造技術(shù)縮短茶樹(shù)品種選育時(shí)間，高效率達(dá)到茶葉品質(zhì)優(yōu)良與低咖啡堿的目的。

在龍井長(zhǎng)葉、龍井、保靖黃金茶等19份茶樹(shù)資源中，采自貴州的3份大茶樹(shù)資源(七舍大茶樹(shù)、晴隆大茶樹(shù)、盤(pán)縣大茶樹(shù))鮮葉的咖啡堿合成酶活性差異較大，可能主要與各茶樹(shù)的種質(zhì)資源特異性有關(guān)，或與各自所處的氣候環(huán)境息息相關(guān)；其余常見(jiàn)16份茶樹(shù)品種鮮葉的咖啡堿合成酶活性差異不大，在0.05 U/mL左右。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，在龍井長(zhǎng)葉、龍井、保靖黃金茶等19份茶樹(shù)資源中，龍井長(zhǎng)葉等其余15種的活性差異不大，在0.043～0.07 U/mL；七舍古茶的咖啡堿合成酶活性最高，為0.386 U/mL；其次是保靖黃金茶、黃金葉，分別為0.161和0.090 U/mL；盤(pán)縣古茶的咖啡堿合成酶活性最低，為0.038 U/mL。因此，盤(pán)縣古茶樹(shù)可作為低咖啡堿新品種的選育材料。

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