林秀芳，尹文哲，張智,*，馬建章，李杰

（1.東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030）

基于design-expert軟件設(shè)計優(yōu)化動物雙歧桿菌培養(yǎng)條件工藝

林秀芳1，尹文哲2，張智1,*，馬建章1，李杰3

（1.東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030）

主要研究培養(yǎng)條件對動物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響，design-expert軟件輔助優(yōu)化設(shè)計，以期更好的為雙歧桿菌的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要。采用改良的玉米糖化液為培養(yǎng)基，以活菌數(shù)為響應值，選取不同的玉米糖化液濃度、培養(yǎng)溫度、接種量和初始pH，借助design-expert軟件建立四因素三水平的試驗，得到響應值與各因素之間交互作用的數(shù)學模型。結(jié)果表明：接種量與培養(yǎng)溫度一次項顯著，4個因素的二次項及玉米糖化液濃度與接種量的交互項顯著，其他項不顯著。動物雙歧桿菌的最佳培養(yǎng)條件分別為：接種量7.4%，玉米糖化液濃度12.0°Bx，初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度37.4℃。

動物雙歧桿菌；design-expert軟件；響應面法；培養(yǎng)條件

動物雙歧桿菌（Bifidobceterium animalis）是人體有益菌之一[1]。它可以對宿主發(fā)揮一定的作用，如免疫[2]、調(diào)節(jié)腸道菌群[3]、抗腫瘤[4]等。有研究表明[5]，經(jīng)動物雙歧桿菌所產(chǎn)生的細菌素有很好的食品加工特性[6]，有作為天然食品防腐劑的巨大發(fā)展?jié)摿7]。design-ex－pert軟件用于探究響應面優(yōu)化條件，通過數(shù)學模型得出響應面的最優(yōu)條件。本試驗主要探究玉米糖化液濃度、接種量、pH值和溫度對動物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響。采用低成本的玉米粉作為原料，制備玉米糖化液作為培養(yǎng)基，進一步探究動物雙歧桿菌的培養(yǎng)條件，以期能夠更好實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要原料與儀器

1.1.1 主要原料

動物雙歧桿菌菌株：東北林業(yè)大學實驗室保藏。

1.1.2 主要儀器

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；722S型可見分光光度計：上海精密儀器科技有限公司；YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州安泰空氣科技有限公司；XSZ-G顯微鏡：重慶光學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

將保藏于斜面的菌株在無菌條件下轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h至出現(xiàn)明顯菌落。觀察菌落的形態(tài)特征并挑取完整的菌落，隨后采用革蘭氏染色法染色并在顯微鏡下觀察，對疑為雙歧桿菌的菌落，用接種環(huán)挑取形態(tài)飽滿的菌落接種于改良玉米糖化液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，置于冰箱備用。取一定量的菌液于改良的玉米糖化液培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，即為活化的菌種。選擇平板稀釋法分離菌株得到目標菌株[8]。

1.2.2 動物雙歧桿菌培養(yǎng)條件的確定

保證其他試驗條件不變，分別變化不同濃度玉米糖化液濃度（6、8、10、12、14、16°Bx）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%），初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和培養(yǎng)溫度（31、33、35、37、39、41℃）進行單因素試驗[9]。

1.2.3 響應面優(yōu)化雙歧桿菌培養(yǎng)條件

在探究單因素玉米糖化液、接種量、初始pH值和培養(yǎng)溫度單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定優(yōu)化試驗的條件與水平。根據(jù)中心響應面試驗原則建立四因素三水平的響應面試驗，采用design-expert軟件優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物雙歧桿菌培養(yǎng)條件的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 玉米糖化液濃度對雙歧桿菌的影響

玉米糖化液濃度對雙歧桿菌的影響見圖1。

圖1 玉米糖化液對菌株生長的影響Fig.1 Effectof the corn juice concentration on cellgroWth

由圖1表明，8°Bx～12°Bx之間，隨著玉米糖化液濃度的增加，雙歧桿菌的活菌數(shù)也逐漸增加，12°Bx～16°Bx之間，隨著玉米糖化液的濃度的增加，活菌數(shù)降低。12°Bx為最佳糖化濃度。這可能由于，高濃度造成滲析現(xiàn)象，高滲溶液對細胞生長有很大的影響。

2.1.2 接種量對雙歧桿菌的影響

接種量對雙歧桿菌的影響見圖2。

圖2 接種量對菌體生長的影響Fig.2 Effectof Bifidobacterium inoculum on cellgroWth

由圖2表明，接種量為1%～7%，隨著接種量的增加，活菌數(shù)增加。接種量為7%～11%時，活菌數(shù)減少。7%為最佳接種量。這可能由于接種量越大，會造成菌株的抑制生長，帶入更多的代謝物產(chǎn)生，使最終的代謝物較多，最終造成成本浪費。

2.1.3 初始pH值對雙歧桿菌的影響

初始pH值對雙歧桿菌的影響見圖3。

圖3 初始pH值對菌株生長的影響Fig.3 Effectof pH on cellgroWth

由圖3表明，初始pH值對雙歧桿菌的影響較大，隨著初始pH值的變化，動物雙歧桿菌活菌數(shù)先增加后降低。初始pH值增加或降低都將影響細胞形態(tài)，pH值過高或過低動物雙歧桿菌都無法正常生長，故一般接近中性時，才能最好的保持細胞形態(tài)。動物雙歧桿菌生長的最佳pH值為6.5。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對雙歧桿菌的影響

培養(yǎng)溫度對雙歧桿菌的影響見圖4。

由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，整體呈先增加再降低的趨勢。37℃為最佳溫度。在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度升高有利于微生物的代謝，但升高至某一溫度時，由于溫度的增加，細胞功能下降至死亡。溫度過高時，酶反應失活，引起代謝失衡。溫度過低，抑制酶活性，降低了代謝活動，從而抑制了雙歧桿菌的生長。

2.2 響應面優(yōu)化雙歧桿菌菌株培養(yǎng)條件

2.2.1 響應面試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計了玉米糖化液濃度、初始pH值、接種量和培養(yǎng)溫度的四因素三水平響應面試驗，其因素水平見表1和表2，所得試驗結(jié)果見表3。

表1 響應面設(shè)計因素與水平Table1 Variablesand levels in theexperim entaldesign

表2 響應面試驗結(jié)果Table2 Experim ent resultsof response surfacem ethod

續(xù)表2 響應面試驗結(jié)果Continue table2 Experiment resu ltsof responsesurfacemethod

表3 多元回歸模型方差分析表Table3 ANOVA for responsesurfacequadraticmethod

采用中心組合模型，進行四因素三水平響應面分析試驗，總共29個試驗點，其中包括5個中心點。分析后得到動物雙歧桿菌的回歸方程y=4.11-0.018A+ 0.14B-0.004C+0.079D-0.28A2-0.35B2-0.4C2-0.26D2+ 0.15AB-0.018AC-0.05AD+0.022BC+0.000 35BD+ 0.053CD。公式中y為響應值，A、B、C、D分別為玉米糖化液濃度、接種量、初始pH值和培養(yǎng)溫度對應的響應值。動物雙歧桿菌所建立的模型的不同處理組間變異極顯著（P＜0.01），說明其應變量與所有自變量之間線性關(guān)系是顯著的，即試驗方法可靠，方程合理。A2、B2、C2與D2項差異顯著（P＜0.01）；玉米糖化液濃度與接種量的二次項差異顯著（P＜0.05）。通過F值還能看出，試驗中各因素對活菌數(shù)變化的影響大小順序為：接種量＞培養(yǎng)溫度＞玉米糖化液＞初始pH值。失擬項P= 0.442 1（P＞0.01）說明失擬項對于純誤差而言是不顯著的，這證明此數(shù)學回歸模型建立的可靠。

圖5 接種量與玉米糖化液濃度對動物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.5 Effectof Bifidobacterium inoculum and the corn juice concentration on cellgroWth

圖6 pH值與玉米糖化液濃度對動物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.6 Effectof pH and the corn juice concentration on cellgroWth

由圖5～圖10所示，兩個因素之間交互影響基本呈由一個極大值點的拋物線型關(guān)系，都是先增加后減小的變化趨勢。兩個因素交互作用不顯著則等高線呈圓形，相反若顯著則呈橢圓或馬鞍形，等高線均呈現(xiàn)橢圓形，說明試驗中所有因素之間存在差異顯著[10]。最佳培養(yǎng)條件為：接種量7.41%，玉米糖化液濃度12.01°Bx，初始pH 6.48，培養(yǎng)溫度37.37℃，此條件下活菌數(shù)為4.13×109cfu/mL。為檢驗響應面法優(yōu)化雙歧桿菌的培養(yǎng)條件的可靠性，對優(yōu)化后培養(yǎng)條件進行驗證試驗，參考實際操作，將優(yōu)化后培養(yǎng)條件調(diào)整為：接種量7.4%，玉米糖化液濃度12.0°Bx，初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度37.4℃，此條件下活菌數(shù)為4.13×109cfu/mL。與模型預測值的相接近。

圖7 溫度與玉米糖化液濃度對活菌數(shù)的影響Fig.7 Effectof temperatureand the corn juice concentration on cellgroWth

圖8 pH值與接種量對活菌數(shù)的影響Fig.8 Effectof pH and Bifidobacterium inoculum on cellgroWth

圖9 接種量與溫度對動物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.9 Effectof temperatureand Bifidobacterium inoculum on cell groWth

圖10 pH值與溫度對動物雙歧桿菌活菌數(shù)的影響Fig.10 Theeffectof tem peratureand pH on cellgroWth

3 結(jié)論

雙歧桿菌對于人體健康起著重要的作用，具有多種生理功能，提高免疫力、抗氧化、降低膽固醇等功效。雙歧桿菌可以應用于醫(yī)藥及食品等行業(yè)。由于其厭氧特性的限制，所以對于如何提高雙歧桿菌活菌數(shù)的研究越來越多。本試驗主要探究經(jīng)改良的玉米糖化液培養(yǎng)基優(yōu)化動物雙歧桿菌培養(yǎng)條件的工藝。通過單因素試驗結(jié)果，根據(jù)BBD響應面試驗原理，進一步確定響應面的水平。優(yōu)化試驗條件得到：接種量7.4%，玉米糖化液濃度12.0°Bx，初始pH 6.50，培養(yǎng)溫度37.4℃，此條件下活菌數(shù)為4.13×109cfu/mL。

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Optim ization of Fermentation Conditions for Bifidobacrium animalis Production on Design-Expert

LINXiu-fang1，YINWen-zhe2，ZHANG Zhi1，*，MA Jian-zhang1，LIJie3
（1.NortheastForestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Second Affiliated Hospitalof Harbin MedicalUniversity，Harbin 150086，Heilongjiang，China3.NortheastAgriculturalUniversity，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

The researchmainly explored optimization of fermentation conditions for Bifidobacterium animalis by response surfacemethodology，based on design-expertsoftware design，in order to provide the basis data for the further research andmeet the factory need.Meanwhile，the contactof Bifidobacterium animalis，corn juice concentration，pH and fermentation temperaturewere investigated on viable count.Themathematicalmodelof four factorsand three levelswas created according to design-expertsoftware design and Box-Behnken experimental design.The result showed that the interaction term of the contactof Bifidobacterium animalis and fermentation temperature and individualquadratic interaction term are significant，butothersare unsignificant.The optimum culture conditionswere obtained：7.4%of the Bifidobceterium animalis，12.0°Bx of the corn juice concentration，pH 6.5，fermentation temperatureof37.4℃.

Bifidobacrium animalis；design-expert；responsesurfacemethodology；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.032

2016-12-28

大熊貓國際資金項目（SG1409）；黑龍江省應用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目（GA15B203）

林秀芳（1991—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：益生菌發(fā)酵。

*通信作者：張智（1964—），女（漢），教授，博士，研究方向：微生物與發(fā)酵工程。