戴勝云++徐冰+史新元+徐翔+孫英強(qiáng)+喬延江

[摘要]該文提出基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）的中藥分析方法持續(xù)改進(jìn)策略。以三七總皂苷（PNS）5種皂苷類成分的超高效液相色譜（UPLC）定量分析方法開發(fā)為例，完成分析方法從HPLC到UPLC的轉(zhuǎn)換。在UPLC開發(fā)中，采用PlackettBurman設(shè)計(jì)和BoxBehnken設(shè)計(jì)理解關(guān)鍵方法參數(shù)（CMP）與關(guān)鍵方法屬性（CMA）之間的關(guān)系，建立貝葉斯概率設(shè)計(jì)空間；優(yōu)選穩(wěn)健色譜條件為初始乙腈20%，等度時間10 min，梯度變化速率6 %·min-1，分析時間17 min，采用Accuracy profile進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。在相同的分析目標(biāo)（ATP）下，從色譜條件、CMP辨識結(jié)果、CMPCMA關(guān)系模型、系統(tǒng)適用性等方面對PNS 的HPLC和UPLC定量分析性能的一致性進(jìn)行比較，結(jié)果表明UPLC可縮短分析時間、提高關(guān)鍵峰對分離度、色譜系統(tǒng)適用性滿足要求，UPLC可替代HPLC進(jìn)行PNS定量分析。

[關(guān)鍵詞]質(zhì)量源于設(shè)計(jì)； UPLC； 持續(xù)改進(jìn)； 貝葉斯設(shè)計(jì)空間； 三七總皂苷

[Abstract]This study is aimed to propose a continual improvement strategy based on quality by design （QbD） An ultra high performance liquid chromatography （UPLC） method was developed to accomplish the method transformation from HPLC to UPLC of Panax notogineng saponins （PNS） and achieve the continual improvement of PNS based on QbD， for example PlackettBurman screening design and BoxBehnken optimization design were employed to further understand the relationship between the critical method parameters （CMPs） and critical method attributes （CMAs） And then the Bayesian design space was built The separation degree of the critical peaks （ginsenoside Rg1 and ginsenoside Re） was over 20 and the analysis time was less than 17 min by a method chosen from the design space with 20% of the initial concentration of the acetonitrile， 10 min of the isocratic time and 6%·min-1 of the gradient slope At last， the optimum method was validated by accuracy profile Based on the same analytical target profile （ATP）， the comparison of HPLC and UPLC including chromatograph method， CMA identification， CMPCMA model and system suitability test （SST） indicated that the UPLC method could shorten the analysis time， improve the critical separation and satisfy the requirement of the SST In all， HPLC method could be replaced by UPLC for the quantity analysis of PNS

[Key words]quality by design； UPLC； continual improvement； bayesian design space； Panax notogineng saponins

三七Panax notoginseng（Burk）FHChen為五加科植物，具有散瘀止血、消腫止痛之功效[1]。三七總皂苷（Panax notogineng saponins，PNS）為三七主根或根莖經(jīng)加工制成的總皂苷提取物，已收錄在《中國藥典》2015 年版一部[2]。藥典中PNS 5種皂苷類成分的含量測定采用HPLC，乙腈水梯度洗脫，流速15 mL·min-1。該法分析時間長，流速大、流動相消耗大，系統(tǒng)背壓偏高，峰型也不盡理想。筆者曾嘗試采用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）方法提高PNS分析方法性能。第1次方法改進(jìn)時采用色譜柱（46 mm×150 mm，5 μm），將流速降低到1 mL·min-1，但分析時間沒有變化[3]。第2次方法改進(jìn)選擇色譜柱（46 mm × 75 mm，25 μm），流速為08 mL·min-1，分析時間縮減到36 min，關(guān)鍵分離度為160，基本達(dá)到色譜分離的要求[4]。

超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）具有高效、靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)。本次研究中以三七總皂苷UPLC開發(fā)為例，完成分析方法從HPLC到UPLC的轉(zhuǎn)換，期望縮短分析時間，減少有機(jī)溶劑消耗，并實(shí)現(xiàn)PNS分析方法的持續(xù)改進(jìn)。在PNS的UPLC開發(fā)中，首先定義分析目標(biāo)（analytical target profile，ATP），然后采用風(fēng)險評估（risk evaluation）辨識關(guān)鍵方法屬性（critical method attributes，CMAs）和鍵方法參數(shù)（critical method parameters，CMPs），采用回歸模型建立CMAs和CMPs關(guān)系模型，基于模型開發(fā)分析方法設(shè)計(jì)空間（design space，DSp），最后基于DSp優(yōu)化分析條件。方法開發(fā)完成后，以CMPsCMAs關(guān)系模型的準(zhǔn)確性和系統(tǒng)適用性是否改變?yōu)榕袛鄻?biāo)準(zhǔn)，為評價分析方法改進(jìn)的有效性，為新分析方法的應(yīng)用提供參考。

1材料

11儀器與試劑

Acquity UPLC HClass 超高效液相色譜儀，包括四元泵處理器、樣品處理器、柱溫箱、TUV 檢測器及Empower 色譜工作站（Waters 公司）；AG135型電子分析天平（1/1萬，Sartorius公司）；BT25S型電子分析天平（1/10萬，Sartorius公司）；KQ100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，100 W，40 KHz）。

三七總皂苷提取物（批號ZL20141208，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>80%）購自南京澤朗生物科技有限公司；三七皂苷R1（批號10745201318，純度≥98%）；人參皂苷Rg1（批號110703201530，純度≥98%）；人參皂苷Re（批號110754201525，純度≥98%）；人參皂苷Rb1（批號110704201424，純度≥942%）和人參皂苷Rd（批號111818201302，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜級，乙腈為質(zhì)譜級（賽默飛世爾科技有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。

12數(shù)據(jù)分析軟件

DesignExpert V 80 （StatEase公司），Sigmplot 125（Aspire Software Intl，Ashburn，VA，USA），Matlab 2009a（Mathworks公司），數(shù)據(jù)處理程序自行編寫，JMP（SAS公司）。

2方法與結(jié)果

21色譜條件

采用Acquity UPLC BEH色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm）；流動相為乙腈水先等度后梯度洗脫，檢測波長203 nm，進(jìn)樣量2 μL，流速、柱溫、梯度洗脫程序由試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。

22供試品溶液的制備

稱取三七總皂苷提取物約25 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度線，搖勻，022 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液備用。

23對照品溶液的制備

分別精密稱取三七總皂苷中5種對照品適量，加70%甲醇溶解，分別從5種對照品中取一定量配制混合對照品，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的質(zhì)量濃度分別為0251 7，1266，0232 3，1260 1，0293 4 g·L-1。

24PlackettBurman設(shè)計(jì)

PlackettBurman設(shè)計(jì)是部分析因設(shè)計(jì)用于篩選的備選設(shè)計(jì)。主要針對因素?cái)?shù)較多且未確定眾因素相對于響應(yīng)變量的顯著性時采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)篩選出因素的主效應(yīng)，從眾多考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素供進(jìn)一步研究。

241參數(shù)設(shè)定選取柱溫（A）、梯度變化速率（B）、流速（C）、等度時間（D）、初始乙腈濃度（E）為考察因素。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，為每個因素設(shè)定2個水平進(jìn)行，見表1。梯度洗脫見表2。

242PlackettBurman設(shè)計(jì)結(jié)果與分析將設(shè)定的參數(shù)水平輸入JMP軟件的DOE篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，選擇PlackettBurman設(shè)計(jì)，共12次，得到一個設(shè)計(jì)表。響應(yīng)變量選取人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離度和分析時間共2個指標(biāo)進(jìn)行考察。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，并將結(jié)果輸入響應(yīng)中，見表3。

采用最小二乘法進(jìn)行效應(yīng)篩選模型擬合，分別得到2個關(guān)鍵方法屬性與5個潛在關(guān)鍵方法參數(shù)Pareto分析圖，見圖1。圖中黑色條框代表參數(shù)與響應(yīng)成負(fù)相關(guān)關(guān)系，白色條框代表參數(shù)與響應(yīng)成正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)P<005時說明參數(shù)對響應(yīng)值影響明顯，該參數(shù)為關(guān)鍵方法參數(shù)。對分析時間而言，初始乙腈濃度、梯度變化速率和等度時間模型P<005，故可作為關(guān)鍵方法參數(shù)；同樣，梯度變化速率為關(guān)鍵分離度的關(guān)鍵方法參數(shù)。

此外，通過最小二乘法模型運(yùn)算得到因素刻畫圖，見圖2。該圖為動態(tài)演示圖，主要體現(xiàn)2個方面，一方面是因素之間是否存在相互作用，通過移動其中任何一個因素，若其他因素斜率發(fā)生改變則表明涉及因素間的交互作用，這一部分是Pareto圖分析不能體現(xiàn)的內(nèi)容；另一方面是參數(shù)對響應(yīng)值影響的重要程度，主要通過觀察預(yù)測跡的斜率。本實(shí)驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)各因素間存在交互作用，而等度時間和梯度變化速率對2個響應(yīng)值具有一定的斜率且均較明顯，初始乙腈濃度對2個響應(yīng)值具有一定的斜率但不及前2個因素明顯，流速和溫度對2個響應(yīng)值影響不明顯。因此，綜合考慮5個因素對各響應(yīng)值的影響，等度時間、初始乙腈濃度和梯度變化速率為關(guān)鍵方法參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的考察，而影響較小的因素則選擇一個常用值，如柱溫選擇室溫25 ℃，流速04 mL·min-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

25BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

BoxBehnken設(shè)計(jì)與析因設(shè)計(jì)相比，可以明顯減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，提高實(shí)驗(yàn)效率，降低實(shí)驗(yàn)的成本。

251參數(shù)設(shè)定根據(jù)PlackettBurman設(shè)計(jì)考察結(jié)果，選擇梯度變化速率、等度時間、初始乙腈濃度為因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平、BoxBehnken因素設(shè)計(jì)見表4。

252BoxBehnken設(shè)計(jì)結(jié)果與分析將表4中的內(nèi)容輸入Design Expert806軟件的BoxBehnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，共17次實(shí)驗(yàn)，見表5。以人參皂苷Rg1和人參皂苷Re間的分離度、分析時間為關(guān)鍵方法屬性進(jìn)行優(yōu)化。

根據(jù)結(jié)果，分別以分析時間和分離度為響應(yīng)值，建立響應(yīng)值與3個關(guān)鍵影響參數(shù)梯度變化速率、初始乙腈濃度和等度時間之間的二項(xiàng)式模型，模型P<005，具有顯著性，并且模型決定系數(shù)R2分別為0999 9，0878 1，表明模型擬合程度良好，可以解釋關(guān)鍵影響因素與關(guān)鍵方法屬性之間的相互關(guān)系。

26設(shè)計(jì)空間開發(fā)及其可靠性研究

BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)是響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的一種，而設(shè)計(jì)空間又是在BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)上建立的，故可認(rèn)為設(shè)計(jì)空間的建立是基于預(yù)測響應(yīng)面[5]。由于建立色譜方法時往往會牽涉到多個色譜參數(shù)和多個響應(yīng)，因而設(shè)計(jì)空間應(yīng)該是多個響應(yīng)面的綜合。然而Peterson[6]提出，這樣由多個響應(yīng)變量建立的設(shè)計(jì)空間有2個主要缺點(diǎn)，將直接導(dǎo)致設(shè)計(jì)空間的不可靠，其中一個缺點(diǎn)是模型參數(shù)

不確定性，另一個缺點(diǎn)是沒有考慮多元回歸模型誤差向量的相關(guān)結(jié)構(gòu)。因此，在建立設(shè)計(jì)空間時，有必要同時考慮這2個缺點(diǎn)來確保設(shè)計(jì)空間的可靠性，這樣才能滿足ICH Q8指南中對設(shè)計(jì)空間定義中的“保證質(zhì)量”這一項(xiàng)要求，Bayesian理論恰好能同時考慮模型參數(shù)的不確定性和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。根據(jù)Bayesian理論，Bayesian后驗(yàn)預(yù)測概率可以通過下式來計(jì)算[7]。

Pr（yA|x，data）（1）

其中，x是過程參數(shù)向量，y是響應(yīng)值向量，A是具有規(guī)定閾值的可接受范圍，data是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Pr代表響應(yīng)值在可接受范圍內(nèi)的概率，故設(shè)計(jì)空間可以用下式表示。{x：Pr（yA|x，data）≥π}（2）其中，π表示能“確保質(zhì)量”的設(shè)計(jì)空間預(yù)定義可靠性的概率。那些不確定因素對模型響應(yīng)的影響應(yīng)用Monte Carlo仿真模擬來估計(jì)。

在建立貝葉斯設(shè)計(jì)空間之前，首先要確定分析目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，選擇2個分析目標(biāo)：①實(shí)現(xiàn)三七總皂苷中5種皂苷的基線分離，尤其是人參皂苷Rg1和人參皂苷Re；②縮短分析時間，提高分析效能，基于貝葉斯概率可建立一個多目標(biāo)設(shè)計(jì)空間。

根據(jù)分析目標(biāo)，選擇關(guān)鍵分離度（Rcrit）和分析時間（t）作為三七總皂苷色譜分離的關(guān)鍵方法屬性，該多變量設(shè)計(jì)空間可以用下式表示。

DS={x0X|Eθ[Pr（Rcnt>λ1，t>λ2）|θ]≥π（3）

其中，x0是整個實(shí)驗(yàn)區(qū)域X中的一個點(diǎn)，λ1和λ2是關(guān)鍵分離度與分析時間的可接受閾值，π為要求達(dá)到的質(zhì)量水平的貝葉斯概率值，θ為模型評估參數(shù)的數(shù)據(jù)集，Pr和E代表概率的估計(jì)值和數(shù)學(xué)期望值。

一般而言，關(guān)鍵分離度Rcrit至少應(yīng)該大于15，而對于分析時間t，考慮到中藥的復(fù)雜性和UPLC特點(diǎn)，將其設(shè)置為17 min，設(shè)計(jì)空間就是理論上的穩(wěn)健區(qū)域，區(qū)域中預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)值高于可接受閾值并且盡可能至少達(dá)到此閾值[8]。此外，利用網(wǎng)格搜索法在整個實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)進(jìn)行貝葉斯聯(lián)合后驗(yàn)概率的計(jì)算，滿足2個分析目標(biāo)的貝葉斯后驗(yàn)預(yù)測概率通過對每個網(wǎng)格進(jìn)行1萬次的Monte Carlo仿真模擬計(jì)算得到[810]。

目前并沒有一個針對色譜分析公認(rèn)的概率閾值，故在本研究中選擇88%作為π的基本標(biāo)準(zhǔn)建立設(shè)計(jì)空間，見圖3，圖中設(shè)計(jì)空間用黑線條描繪出來，設(shè)計(jì)空間內(nèi)表示同時滿足關(guān)鍵分離度和分析時間2個目標(biāo)要求的概率至少大于88%，顏色越深，概率越大。

通過對三七總皂苷色譜分析過程的優(yōu)化，采取Bayesian概率評價設(shè)計(jì)空間的可靠性，最后優(yōu)化得到的分析方法的預(yù)測結(jié)果為10 min的等度時間，6 %·min-1的梯度變化速率和20%的初始乙腈濃度，此時可以實(shí)現(xiàn)三七總皂苷中5個成分的完全分離，見圖4。

27方法驗(yàn)證

選擇Accuracy profile[11]進(jìn)行方法驗(yàn)證，分3 d進(jìn)行，選擇4個樣品濃度，每個濃度進(jìn)行3次重復(fù)，一共進(jìn)行3×4×3次，即36次實(shí)驗(yàn)。三七總皂苷樣品的4個質(zhì)量濃度分別是125，25，30，50 g·L-1。每個濃度分別重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)分3 d考察方法的中間精密度。根據(jù)全析因設(shè)計(jì)和β期望容許區(qū)間計(jì)算Accuracy Profile中各個參數(shù)的值，驗(yàn)證試驗(yàn)采用matlab自行編寫的程序進(jìn)行計(jì)算。

271真實(shí)性真實(shí)性代表總誤差理論中的系統(tǒng)誤差，分別用每個濃度3 d重復(fù)3次數(shù)據(jù)的相對偏差表示。5個成分相對偏差都小于5%，這說明優(yōu)化后方法的真實(shí)性可接受，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd方法驗(yàn)證的結(jié)果見表6～10。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 4個成分的相對偏差都小于3%，而人參皂苷Re前2個濃度水平的相對偏差分別為35%，32%，這可能因?yàn)槿藚⒃碥誖e含量較低，測量時存在偏差會比其他4個成分稍大。

272精密度精密度與總誤差理論中的偶然誤差有關(guān)，包括2個方面，分別是重復(fù)性和中間精密度，二者都用RSD表示。5個成分在4個濃度水平的重復(fù)性和中間精密度的RSD都小于2%，意味著優(yōu)化后方法的偶然誤差在可接受范圍內(nèi)，見表6～10。

273準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性代表著誤差理論中偶然誤差與系統(tǒng)誤差值之和，即總誤差。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5個成分在90%β容許區(qū)間內(nèi)并且可接受限

為5%的準(zhǔn)確性，見表6～10，輪廓圖見圖5。除人參皂苷Rd以外，其他4個成分在設(shè)置的4個濃度水平都分布在可接受范圍內(nèi)，說明優(yōu)化后的方法其準(zhǔn)確性在設(shè)定的樣品濃度范圍內(nèi)是可以接受的。但人參皂苷Rd則在第4個濃度水平處超過了5%可接受限，說明其濃度范圍比其他4個成分濃度范圍窄。此外，優(yōu)化后方法在對三七總皂苷中5個成分進(jìn)行分析時，不同成分的分析范圍不一樣，但方法準(zhǔn)確性可接受。三七皂苷R1的分析范圍為0094 61～0378 4 g·L-1，人參皂苷Rg1為0374 2～1497 g·L-1，人參皂苷Re為0039 16～0156 6 g·L-1，人參皂苷Rb1為0448 7～1795 g·L-1，人參皂苷Rd為0132 4～0493 2 g·L-1。

a 三七皂苷 R1；b人參皂苷 Rg1；c人參皂苷 Re；d人參皂苷 Rb1；e人參皂苷 Rd；綠色點(diǎn)為每個濃度每次試驗(yàn)的相對誤差，紅色實(shí)線為相對偏差，藍(lán)色折線表示90%β期望容許區(qū)間，黑色點(diǎn)直線為±5%可接受限。

274最低定量限每個成分的最低定量限（limit of qualification，LOQ）也可從準(zhǔn)確性輪廓圖中看出，準(zhǔn)確性輪廓限制線與90% β容許區(qū)間限制線的交叉點(diǎn)即為最低定量限。從試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度來看，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5個成分的最低定量限分別為0094 61，0374 2，0039 16，0448 7，0132 4 g·L-1。

275線性為了考察方法的線性，對36次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采取線性回歸模型擬合方式得到5個成分的線性方程，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的線性方程分別為Y=4928+1510×106X，Y=-1359+1706×106X，Y=-0479 5+1849×106X，Y=0917 9+1313×106X和Y=1907×104+1570×106X，此5個成分線性方程對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)均大于0999 5，表明方法的線性良好。

28方法持續(xù)改進(jìn)前后定量分析性能比較

在相同的分析目標(biāo)（ATP）下，從色譜條件、CMP辨識結(jié)果、CMPCMA關(guān)系模型、系統(tǒng)適用性等方面對筆者前期建立的三七總皂苷HPLC分析[34]和UPLC分析的性能進(jìn)行比較，見表11。UPLC中選擇色譜柱（21 mm × 100 mm，17 μm）進(jìn)行方法開發(fā)，人參皂苷Rg1和Re之間的分離度有較大改善，達(dá)到210以上，同時分析時間縮短到17 min，見圖6。從CMPCMA關(guān)系模型角度來看，采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法一致，關(guān)鍵影響參數(shù)一致，模型R2符合要求，而設(shè)計(jì)空間的閾值更高，說明改進(jìn)以后方法的穩(wěn)健性更高，更能夠滿足預(yù)定義目標(biāo)。本次改進(jìn)方法同樣經(jīng)過accuracy profile方法學(xué)驗(yàn)證，真實(shí)性、中間精密度、重復(fù)性、分析總誤差和線性均符合要求。因此，改進(jìn)后的分析方法同樣滿足藥典中PNS的定量分析要求，利于三七總皂苷質(zhì)量控制，應(yīng)用QbD工具提高了分析方法開發(fā)的效率和可靠性。

3總結(jié)

本研究建立了UPLC測定三七總皂苷中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5種皂苷的Bayes概率設(shè)計(jì)空間，該方

法一改常規(guī)單因素考察建立操作條件單一的色譜方法，而是基于科學(xué)和風(fēng)險管理原則開發(fā)色譜方法的設(shè)計(jì)空間，增加了對三七總皂苷色譜分析過程的理解，設(shè)計(jì)空間內(nèi)色譜條件的改變不會引起分析性能的改變，提高了色譜方法的穩(wěn)健性。

QbD希望在藥品監(jiān)管和藥品分析中取得一個平衡，實(shí)現(xiàn)監(jiān)管者、分析者和使用者三者之間共贏[12]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上對分析方法進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)，提出采用CMPsCMAs關(guān)系模型的擬合和預(yù)測指標(biāo)，以及關(guān)鍵分離度、選擇性、塔板數(shù)等系統(tǒng)適用性指標(biāo)，評價持續(xù)改進(jìn)效果和改進(jìn)前后分析性能的一致性，更大程度提高方法的可靠性和可維護(hù)性，既滿足監(jiān)管要求，又有利于新技術(shù)的應(yīng)用。

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