何鑫+劉春彥+尹基峰+金愛(ài)花+尹學(xué)哲+全吉淑

[摘要]研究祁州漏蘆對(duì)H2O2所致HepG2細(xì)胞凋亡的抑制作用機(jī)制。建立H2O2誘導(dǎo)的人HepG2細(xì)胞損傷模型，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；采用化學(xué)比色法檢測(cè)LDH，ALT，AST活性；采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸法檢測(cè)GSH含量，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA生成量，比色法測(cè)定Caspase3，8，9的相對(duì)活性；蛋白印跡法測(cè)定Cleaved Caspase3（Casp3），細(xì)胞色素c（Cyto c）和NFκB，ERK，JNK，p38 MAPK及其磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，祁州漏蘆在質(zhì)量濃度25～400 mg·L-1對(duì)HepG2細(xì)胞活力無(wú)顯著影響。H2O2降低細(xì)胞存活率，造成細(xì)胞損傷，并上調(diào)Casp3，胞漿Cyto c，pJNK以及核NFκB蛋白水平。與模型組比較，祁州漏蘆組細(xì)胞存活率升高；培養(yǎng)液中LDH，ALT和AST活性降低；細(xì)胞內(nèi)MDA含量降低，SOD活性和GSH含量升高，Caspase3，8，9相對(duì)活性降低，細(xì)胞Casp3和胞漿Cyto c蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞pJNK及核NFκB蛋白水平降低。提示，祁州漏蘆對(duì)H2O2所致HepG2細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其作用可能與其抑制JNK激活和NFκB核轉(zhuǎn)位作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]祁州漏蘆；H2O2；氧化應(yīng)激；凋亡；HepG2

[Abstract]To study the inhibitory effect of Rhaponticum uniflorum on apoptosis induced by H2O2 in HepG2 cells Human HepG2 cells injury models were established by H2O2， then cell survival rate was assayed by MTT method； levels of LDH， ALT， and AST were detected by chemical colorimetric method；SOD activity was detected by xanthine oxidase method； GSH content was detected by dithiobisnitrobenzoic acid（DTNB）； MDA level was detected by thiobarbituric acid （TBA） method；and the relative activities of Caspase3， 8 and 9 were measured by Colorimetry The expression levels of Cleaved Caspase3（Casp3）， cytochrome（Cyto c）， NFκB， ERK， JNK， p38 MAPK， as well as the phospharylated proteins were determined with Western blotting method The results showed that R unifloru had no significant effect on cell viabilities of HepG2 cells at the concentrations of 25400 mg·L-1 However， H2O2decreased the cell viabilities， increased the cellular oxidative stress， and upregulated the protein expressions of Casp3， cytoplasmic Cyto c， pJNK and nuclear NFκB As compared with the model group，R unifloru could increase the cell viability， reduce LDH， ALT and AST leakage， reduce the MDA formation， increase the SOD and GSH levels，reduce the relative activities of Caspase3， 8 and 9， downregulated the protein expressions of Casp3 and cytoplasmic Cyto c， and downregulate the pJNK and nuclear NFκB levelsThe results indicated that R unifloru had the inhibitory effect on apoptosis induced by H2O2in HepG2 cells， and the mechanism maybe associated with inhibiting JNK activation and NFκB nuclear translocation

[Key words]Rhaponticum unifloru； H2O2； oxidative stress； apoptosis； HepG2

近年來(lái)肝病發(fā)生率的逐年上升已經(jīng)引起社會(huì)的關(guān)注，而活性氧引發(fā)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激是多種肝病發(fā)生的重要機(jī)制之一，因此，探討如何有效緩解氧化應(yīng)激損傷對(duì)肝病的防治具有重要意義[1]。祁州漏蘆是菊科植物Rhaponticum uniflorum （L） DC的干燥根，是一味常用中藥。廣泛分布于我國(guó)內(nèi)蒙古、東北、山東等地區(qū)，藥源豐富。它性味咸、苦、寒，能清熱解毒，消腫排毒，通乳汁；主治于乳汁不通、淋巴結(jié)結(jié)核、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痔瘡等[23]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，祁州漏蘆具有提高機(jī)體免疫、抗動(dòng)脈硬化、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗衰老、抗炎等作用[46]。課題組研究還發(fā)現(xiàn)，祁州漏蘆具有良好的保肝作用，能預(yù)防多種因素引起的肝損傷，如，可抑制四氯化碳、氨基半乳糖所致化學(xué)性肝損傷以及對(duì)乙酰氨基酚所致藥物性肝損傷等[79]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立H2O2致HepG2細(xì)胞損傷模型，預(yù)防性給藥后觀察祁州漏蘆水提物對(duì)氧化損傷所致凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，以便探討祁州漏蘆肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為祁州漏蘆的保肝作用研究提供參考。

1材料

11藥物與試劑將祁州漏蘆切碎后加水煎煮，濾液經(jīng)減壓蒸餾即得祁州漏蘆提取物（RU）干品，主要成分為多糖（81%）和甾酮（12%）[6]；用無(wú)血清培養(yǎng)液配成所需濃度，過(guò)濾除雜除菌備用。人HepG2肝癌細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；MTT購(gòu)自SigmaAldrich公司； LDH，ALT，AST，MDA，GSH，SOD試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；Caspase3，8，9檢測(cè)試劑盒、線粒體/細(xì)胞核制備試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；兔NFκB p65多克隆抗體、兔pNFκB p65多克隆抗體、小鼠ERK多克隆抗體、兔pERK多克隆抗體、兔JNK多克隆抗體、兔pJNK多克隆抗體、兔p38多克隆抗體、兔pp38 MAPK多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；兔Cleaved Caspase3（Casp3）單克隆抗體、兔細(xì)胞色素c（Cyto c）單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。

12儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Shellab公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜公司）；垂直版電泳儀及轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)BioRad公司）；凝膠成像分析儀（美國(guó)UVP公司）。

2方法

21細(xì)胞培養(yǎng)及傳代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代按常規(guī)方法進(jìn)行，含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用025%胰蛋白酶溶液消化進(jìn)行傳代[10]。

22RU試驗(yàn)劑量的確定細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)12 h后，正常組換成無(wú)血清培養(yǎng)液；其余6組為藥物組，加RU溶液使其質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200，400，800 mg·L-1。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入MTT溶液，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。另設(shè)空白孔（只加RU溶液）以排除藥物干擾[10]。以細(xì)胞存活率（100±5）%為標(biāo)準(zhǔn)確定RU安全濃度[1011]。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（正常組-空白組）×100%。

23細(xì)胞損傷模型的建立和細(xì)胞存活率的檢測(cè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h細(xì)胞全部貼壁后，分為正常組、模型組及RU高、中、低劑量組（分別為RU 200，RU 100和RU 50組，質(zhì)量濃度分別為200，100，50 mg·L-1）。RU組加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)液，孵育24 h；正常組和模型組加入無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h；除正常組外，其余組加入300 μmol·L-1 H2O2造模[12]。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

24細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH，ALT，AST釋放的檢測(cè)細(xì)胞分組、造模和給藥按23項(xiàng)方法。按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH，ALT，AST的活性。

25細(xì)胞MDA，GSH生成和SOD活性的檢測(cè)按23項(xiàng)方法將細(xì)胞在6孔板中分組、造模和給藥。細(xì)胞用025%的胰酶消化，收集細(xì)胞并裂解，離心取上清。按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞MDA，GSH水平和SOD活性。

26細(xì)胞Caspase3，8，9的相對(duì)活性的測(cè)定裂解細(xì)胞，離心取上清，并按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞Caspase3，8，9的相對(duì)活性。

27細(xì)胞Casp3，Cyto c，NFκB，ERK，JNK，p38蛋白及其磷酸化蛋白水平的檢測(cè)收集和裂解細(xì)胞，并提取細(xì)胞總蛋白。每組以20 μg蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉，加一抗孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記二抗孵育1 h，加ECL試劑顯色，采集圖像并進(jìn)行灰度比值分析[67]。

28統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 190統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

3結(jié)果

31RU對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響隨著RU濃度的升高，細(xì)胞存活率呈升高趨勢(shì)；質(zhì)量濃度介于50～400 mg·L-1時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率為100%～105%，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響；當(dāng)質(zhì)量濃度為800 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率為107%，與正常組比較差異顯著（P<005），有促細(xì)胞生長(zhǎng)作用，見(jiàn)圖1。因此，本研究選50，100，200 mg·L-1為RU干預(yù)劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

32RU對(duì)細(xì)胞存活率以及LDH，ALT，AST釋放的影響正常組的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)液中3種酶活性不高，說(shuō)明正常組細(xì)胞沒(méi)有受到損傷；H2O2損傷后HepG2細(xì)胞存活率僅為正常組的54%，與正常組比較顯著降低（P<005）；細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH，ALT，AST活性分別增高372%，226%，219%，與正常組比較顯著升高（P<005）。與模型組比較，RU各組細(xì)胞存活率顯著增高（P<005），培養(yǎng)液中LDH，ALT，AST活性顯著降低（P<005）。表明，RU干預(yù)降低H2O2所致細(xì)胞損傷，見(jiàn)表1。

33RU對(duì)細(xì)胞MDA，GSH水平和SOD活性的影響與正常組比較，模型組細(xì)胞SOD活性和GSH含量顯著降低（P<005），MDA含量顯著升高（P<005）。與模型組比較，RU各組細(xì)胞SOD活性與GSH含量顯著升高（P<005），MDA含量降低（P<005），表明RU干預(yù)使細(xì)胞抗氧化能力增高，氧化應(yīng)激降低，見(jiàn)表2。

34RU對(duì)Caspase3，8，9相對(duì)活性的影響與正常組比較，模型組細(xì)胞Caspase3，8，9的相對(duì)活性顯著增高（P<005）；與模型組比較，RU各組細(xì)胞Caspase3，8，9的相對(duì)活性顯著降低（P<005），表明RU抑制H2O2所致肝細(xì)胞凋亡，見(jiàn)表3。

35RU對(duì)細(xì)胞Casp3 p17和胞漿Cyto c蛋白水平的影響蛋白印跡結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞Casp3 p17和胞漿Cyto c蛋白水平顯著增高何鑫等：祁州漏蘆通過(guò)下調(diào)JNK和NFκB抑制H2O2致肝細(xì)胞凋亡

36RU對(duì)細(xì)胞MAPK磷酸化的影響H2O2不影響3種MAPK總蛋白水平，對(duì)p38磷酸化水平也無(wú)顯著影響，但上調(diào)ERK和JNK磷酸化水平（P<005）。與模型組比較，RU組細(xì)胞JNK磷酸化水平顯著降低（P<005），但ERK磷酸化水平無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖3。

37RU對(duì)細(xì)胞NFκB磷酸化和核轉(zhuǎn)位的影響

4討論

在肝損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，氧化應(yīng)激是重要環(huán)節(jié)。因此，尋找對(duì)抗肝臟氧化應(yīng)激的藥物，可作為治療肝損傷關(guān)鍵途徑之一[11]。祁州漏蘆為傳統(tǒng)中藥，其保肝作用研究已有一定積累[79]。本試驗(yàn)以人HepG2肝癌細(xì)胞構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷模型，研究祁州漏蘆的抗肝細(xì)胞損傷作用，為闡明祁州漏蘆保肝機(jī)制提供參考。

當(dāng)肝細(xì)胞受到H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷時(shí)，細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒性是反映細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)。而LDH，ALT，AST作為肝細(xì)胞穩(wěn)定的胞內(nèi)酶，培養(yǎng)液中其活性升高是檢測(cè)肝細(xì)胞毒性的重要指標(biāo)之一[1113]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，祁州漏蘆干預(yù)可降低細(xì)胞毒性，提高細(xì)胞存活率，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中，氧化應(yīng)激是重要損傷機(jī)制。肝細(xì)胞受損后產(chǎn)生的過(guò)量活性氧自由基，攻擊生物膜，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，使過(guò)氧化物水平增高，因此MDA可以反映組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[1113]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，祁州漏蘆干預(yù)可升高細(xì)胞SOD活性和GSH含量；降低細(xì)胞MDA生成，提示，祁州漏蘆可通過(guò)減輕H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激而達(dá)到抑制肝細(xì)胞損傷。

氧化應(yīng)激損傷同樣會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。氧化應(yīng)激損傷中產(chǎn)生的過(guò)量活性氧會(huì)損傷功肝細(xì)胞線粒體，使其釋放Cyto c，繼而活化Caspase家族，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是推動(dòng)細(xì)胞凋亡程序的核心事件，其中Caspase9為內(nèi)源性的線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵酶，Caspase8為外源性的死亡受體途徑的關(guān)鍵酶，二者分別在細(xì)胞凋亡的2條主要途徑中起作用，而Caspase3則為凋亡的執(zhí)行者，是2條凋亡通路的共同環(huán)節(jié)，因此是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶[1314]。本研究顯示，H2O2上調(diào)Casp3和胞漿Cyto c蛋白表達(dá)，增高肝細(xì)胞Caspase3，8，9相對(duì)活性，而祁州漏蘆干預(yù)可下調(diào)Casp3和胞漿Cyto c蛋白表達(dá)，降低肝細(xì)胞Caspase3，8，9相對(duì)活性。提示，祁州漏蘆抑制H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，至少與Cyto c釋放引起的線粒體途徑相關(guān)，死亡受體途徑的參與還需進(jìn)一步探討。

氧化應(yīng)激還可通過(guò)多個(gè)通路增強(qiáng)MAPK磷酸化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死基因的激活或改變[15]。MAPK通路是細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)的主要信號(hào)通路，ERK普遍認(rèn)為是“細(xì)胞生存”通路，JNK通路則形成調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，存在協(xié)同和拮抗的現(xiàn)象，p38調(diào)控炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)NFκB活化[16]。NFκB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白因子，其與肝細(xì)胞損傷的關(guān)系一直是肝臟疾病研究中的熱點(diǎn)[17]。研究證實(shí)，活性氧可以直接激活NFκB轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)各種炎癥介質(zhì)釋放而導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，H2O2上調(diào)ERK，JNK和NFκB磷酸化以及NFκB核轉(zhuǎn)位水平，而祁州漏蘆干預(yù)可下調(diào)JNK磷酸化和NFκB核轉(zhuǎn)位水平，對(duì)ERK和NFκB磷酸化水平無(wú)顯著影響。提示，祁州漏蘆可能是通過(guò)抗JNK激活和NFκB核轉(zhuǎn)位作用而抑制肝細(xì)胞凋亡的。祁州漏蘆抗細(xì)胞凋亡作用中NFκB和JNK之間的關(guān)聯(lián)、以及線粒體凋亡通路之間的關(guān)系需進(jìn)一步研究。

綜上所述，祁州漏蘆對(duì)H2O2所致HepG2細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其作用可能與其抗JNK激活和NFκB核轉(zhuǎn)位作用有關(guān)。

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