趙亞飛+高楊+吳欣芳+王建剛+段冷昕

[摘要]該研究旨在探討蚯蚓活性組分（EWAs）對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）所致急性肝損傷的保護(hù)作用。腹腔注射10%CCl4制備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致急性肝損傷模型；血清生化指標(biāo)檢測(cè)ALT，AST，SOD，GSHPX酶活性及MDA含量變化；計(jì)算肝、脾指數(shù)；HE染色觀察肝臟病理學(xué)變化；TUNEL法檢測(cè)肝組織細(xì)胞凋亡情況；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ERS標(biāo)志性蛋白GRP78和CHOP表達(dá)情況；Western blot法檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與模型組小鼠相比，EWAs的高、中、低劑量組血清學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善（P<005或P<001），肝臟病變范圍減小，且損傷程度明顯減輕，小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均有明顯變化（P<005或P<001）；各劑量給藥組的肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降（P<005或P<001）；肝組織中ERS相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達(dá)水平顯著降低（P<005或P<001），各劑量給藥組均能顯著下調(diào)GRP78和CHOP以及CHOP上游信號(hào)通路PERKeIF2αATF4的蛋白表達(dá)（P<005或P<001）。綜上，EWAs對(duì)ERS所致的小鼠急性肝損傷具有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過抑制氧化應(yīng)激和ERS，從而減輕肝臟損傷，并可下調(diào)ERS標(biāo)志性凋亡蛋白CHOP表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]蚯蚓活性組分； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 肝損傷； GRP78； CHOP

[Abstract]To study the protective effect of earthworm active ingredients（EWAs） against endoplasmic reticulum stress（ERS）induced acute liver injury in mice. The model of liver injury was induced through intraperitoneal injection of 10%CCl4. Serum glutamicpyruvic transaminase（ALT）， glutamicoxaloacetic transaminase（AST）， superoxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSHPX） activity and malondialdehyde（MDA） concentration were detected by colorimetric method. Histological examination was performed through hematoxylineosin staining and light microscopy， and apoptosis was detected using terminal transferase dUTP nick end labeling. The expressions of ERS related proteins， including glucose regulated protein 78（GRP78）， protein kinase Rlike ER kinase（PERK）， eukaryotic transcription initiation factor 2α（eIF2α）， active transcription factor4（ATF4） and CCAAT/enhancer binding homologous protein（CHOP）， were measured by immunohistochemistry and Western blot. According to the results， compared with the model group，serological indexes in the high， middle and low doses of EWAs were significantly improved （P<0.05 or P<0.01）， the extent of liver lesion was decreased and the degree of injury was significantly reduced， and that the liver index and the spleen index of mice were significantly changed（P<0.05 or P<0.01）. In liver tissue， the expressions of GRP78 and CHOP were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）. The protein expressions of GRP78， CHOP and its upstream signaling pathway PERKeIF2ATF4 were significantly decreased in each dose group（P<0.05 or P<0.01）. In summary， EWAs has a significant protective effect on ERSinduced acute liver injury， and its mechanism may be correlated with the inhibition of oxidative stress and ERS， and downregulation of ERS marker protein CHOP expression， andinhibition of apoptosis.

[Key words]EWAs； ERS； liver injury； GRP78； CHOP

肝臟疾病是影響人類健康最為常見的疾病之一，從傳統(tǒng)中藥或食物中尋找有效部位或有效成分治療肝臟疾病已成為目前研究的熱點(diǎn)[1]。蚯蚓是一種平肝潛陽(yáng)的傳統(tǒng)中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》上記載該藥性味咸、寒，歸肝、脾、膀胱經(jīng)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、肝臟和腎臟功能、心血管系統(tǒng)、抗腫瘤和抗氧化作用等[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓活性組分（earthworm active ingredients，EWAs）對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）所致的L02細(xì)胞（人正常肝細(xì)胞系）損傷具有顯著的保護(hù)作用，可以促進(jìn)受損細(xì)胞的增殖，減輕ERS，抑制ERS所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3]。本研究旨在探討EWAs對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)小鼠ERS所致急性肝損傷是否有保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制。

1材料

11藥品與試劑EWAs是本實(shí)驗(yàn)室由新鮮冰凍蚯蚓（赤子愛勝蚯蚓）獲得[4]，儲(chǔ)存于-20 ℃，黃白色絮狀物，易溶于水，含多肽（75%），多糖（17%），維生素D和無機(jī)鹽（如鈣和磷）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；TUNEL試劑盒（美國(guó)Roche公司）；兔IgG免疫組化試劑盒（博士德生物工程有限公司）；雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase Rlike ER kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子 4（active transcription factor4，ATF4）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；真核轉(zhuǎn)錄起始因子2α（eukaryotic transcription initiation factor 2α，eIF2α），CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer binding homologousprotein，CHOP）抗體（美國(guó)Proteintech Group公司）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）抗體（美國(guó)Abcam公司）。

12動(dòng)物清潔級(jí)健康昆明種小鼠，雄性，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（鄂）20100007。

2方法

21急性肝損傷模型建立及給藥方案將50只健康雄性小鼠隨機(jī)分為5組，正常組、模型組、EWAs低劑量組（EWAsL，3 mg·kg-1·d-1）、EWAs中劑量組（EWAsM，6 mg·kg-1·d-1）、EWAs高劑量組（EWAsH，12 mg·kg-1·d-1）。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。正常組和模型組每天皮下注射等體積生理鹽水，給藥組皮下注射不同劑量EWAs，連續(xù)10 d。末次給藥8 h后，除正常組外，其余組腹腔注射10%CCl4[5]大豆油溶液（001 mL·g-1），禁食不禁水，24 h后，摘眼球取血，脫臼處死，摘取肝臟及脾臟，稱重。

22生化指標(biāo)檢測(cè)摘眼球取血，離心（3 000 r·min-110 min），取血清，按照相關(guān)試劑盒說明測(cè)定ALT，AST，MDA，GSHPX和SOD含量。

23肝臟、脾臟指數(shù)計(jì)算肝臟指數(shù)（mg·g-1）=肝臟質(zhì)量（mg）/體重（g），脾臟指數(shù)（mg·g-1）=脾臟質(zhì)量（mg）/體重（g）。

24HE及免疫組織化學(xué)染色取肝臟組織相同部位固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。免疫組織化學(xué)染色程序：脫蠟，水化，3%H2O2室溫孵育10 min，熱抗原修復(fù)每次10 min（重復(fù)3次），5%BSA封閉30 min（37 ℃恒溫箱），一抗4 ℃過夜孵育：GRP78（1∶250），CHOP（1∶50），PBS洗3遍（每次5 min），二抗孵育30 min（37 ℃恒溫箱），PBS洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染45 s，脫水，透明，封片，拍照。利用Image Pro Plus 60軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析處理。

25肝組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL法檢測(cè)肝臟細(xì)胞的凋亡情況，以細(xì)胞核呈棕褐色為陽(yáng)性染色。肝組織切片厚度4 μm，脫蠟、水化；蛋白酶K通透30 min（37 ℃恒溫箱）；PBS漂洗3次，加TUNEL反應(yīng)混合液（TdT熒光素標(biāo)記的dUTP 1∶9）進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，37 ℃恒溫箱中孵育30 min；DAB顯色，脫水，透明，封片。結(jié)果處理：在光學(xué)顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，分別計(jì)數(shù)其中的總的細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

26Western blot法檢測(cè)肝組織GRP78和CHOP 及其上游通路PERKeIF2αATF4表達(dá)情況稱取肝臟組織1 g，加入1 mL細(xì)胞裂解液，研磨提取總蛋白，冰浴30 min，4 ℃離心（12 000 r·min-110 min）取上清，測(cè)定蛋白含量（BCA法）。取100 μg蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜（400 mA，90 min），5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育：GRP78（1∶1 000），CHOP（1∶500），PERK（1∶200），eIF2α（1∶200）和ATF4（1∶200），二抗孵育1 h（室溫），暗室中ECL發(fā)光液顯色，掃描結(jié)果。用GelPro Analyzer分析其灰度值，經(jīng)βactin結(jié)果校正后，比較各組相對(duì)灰度值。

27統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用±s表示，不同組間采用單因素方差分析，P<005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31EWAs對(duì)ERS所致急性肝損傷小鼠血清學(xué)指標(biāo)影響與正常組相比，模型組小鼠血清中ALT和AST水平及其MDA含量顯著升高（P<001），SOD和GSHPX活性顯著降低（P<001）。與模型組相比，EWAs低、中、高各劑量組小鼠血清中ALT和AST水平及其MDA含量均明顯降低（P<005或P<001），SOD和GSHPX活性顯著升高（P<001），且具有劑量依賴性，見表1。

32EWAs對(duì)ERS所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)影響模型組較正常組肝臟指數(shù)明顯增高（P<001），脾臟指數(shù)顯著減?。≒<001），與模型組相比，高、中、低劑量組各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005或P<001），見表2。

33EWAs對(duì)ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)變化影響正常組小鼠肝組織中肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，模型組小鼠肝臟腫大，胞質(zhì)疏松，出現(xiàn)明顯的片狀壞死和氣球樣變，高、中、低給藥組小鼠肝臟病變范圍減小，且損傷程度隨著藥物濃度的增大而逐步減輕，見圖1。

34EWAs對(duì)ERS所致急性肝損傷小鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況的影響正常組小鼠肝臟細(xì)胞無明顯凋亡，而模型組小鼠肝臟細(xì)胞大量凋亡，凋亡指數(shù)明顯增高（P<001）。與模型組相比，各給藥組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低（P<005或P<001），見圖2。

35EWAs對(duì)ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織中GRP78和CHOP表達(dá)情況影響模型組ERS標(biāo)志性蛋白GRP78和CHOP表達(dá)水平顯著升高（P<001），中、高劑量組中GRP78蛋白顯著降低（P<001），見圖3，CHOP表達(dá)顯著下調(diào)（P<001），見圖4。

36EWAs對(duì)ERS所致急性肝損傷小鼠肝組織中ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平影響模型組ERS標(biāo)志性蛋白GRP78，CHOP及上游信號(hào)通路PERKeIF2αATF4表達(dá)水平顯著升高（P<001），各給藥組的ERS相關(guān)蛋白因子PERK，GRP78和eIF2α表達(dá)水

A正常組；B模型組；CEWAsL；DEWAsM；EEWAsH（圖2～5同）。

與正常組相比1）P<005，2）P<001；與模型組相比3）P<005，4）P<001（圖3～5同）。

平均降低，呈一定劑量依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005或P<001），中、高劑量組中ATF4和CHOP蛋白表達(dá)顯著降低（P<001），見圖5。

4討論

研究發(fā)現(xiàn)EWAs作為一種新型的保肝藥物，其主要成分是相對(duì)分子質(zhì)量在20 kDa以下的小肽類物質(zhì)，因此選擇皮下注射的給藥方式。根據(jù)EWAs的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定該給藥方式下的高、中、低給藥劑量。預(yù)先給EWAs 10 d，腹腔注射CCl4建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致急性肝損傷模型，繼續(xù)給藥1 d，24 h處死小鼠，取樣。病理學(xué)結(jié)果顯示高劑量組未使肝臟損傷恢復(fù)到正常水平，可能是損傷后給藥時(shí)間過短。

CCl4是一種誘導(dǎo)肝臟損傷的經(jīng)典化學(xué)物質(zhì)，所致的肝細(xì)胞損傷使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，產(chǎn)生活性氧攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[6]，導(dǎo)致過氧化和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中堆積，誘導(dǎo)ERS[7]，降低抗氧化

能力，導(dǎo)致自由基增加，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠血清中 ALT，AST，MDA含量均顯著升高，而SOD，GSHPX酶活性明顯降低，提示小鼠體內(nèi)抗氧化能力明顯下降，可能發(fā)生了氧化應(yīng)激，出現(xiàn)了急性的肝組織損傷。而給予EWAs治療的小鼠各項(xiàng)指標(biāo)均有了顯著改善，這也提示EWAs在動(dòng)物體內(nèi)具有顯著的抗氧化作用，可能通過減輕氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮其保護(hù)作用。

正常生理情況下，GRP78作為一種重要分子伴侶結(jié)合蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上感受態(tài)蛋白PERK、激活作用轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、肌醇酶1α（inositolrequiring enzyme1α，IRE1α）相結(jié)合，形成復(fù)合物，使感受態(tài)蛋白處于未活化狀態(tài)。致病因子作用下，GRP78從感受態(tài)蛋白上解離，識(shí)別和結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔積累的未折疊蛋白，啟動(dòng)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，誘導(dǎo)ERS[9]。強(qiáng)烈

或長(zhǎng)時(shí)間的ERS，使機(jī)體內(nèi)GRP78高度表達(dá)，因此GRP78的表達(dá)水平可以作為ERS發(fā)生的標(biāo)志之一[10]。ERS發(fā)生時(shí)，GRP78從感受態(tài)蛋白上解離，從而使PERK，ATF6和IRE1這3個(gè)膜感受態(tài)蛋白活化，進(jìn)而激活由這3個(gè)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路，啟動(dòng)下游凋亡因子CHOP的表達(dá)[11]，其中PERKeIF2αATF4途徑是啟動(dòng)CHOP表達(dá)所必須的[12]，且活性強(qiáng)于其他通路[13]。本實(shí)驗(yàn)中，重點(diǎn)探討了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞ERS時(shí)，GRP78和CHOP[14]以及其上游的PERKeIF2αATF4通路蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織中GRP78和CHOP蛋白水平明顯升高，且CHOP上游的PERKeIF2αATF4通路蛋白表達(dá)也均顯著上調(diào)，提示模型組小鼠肝組織可能發(fā)生了ERS時(shí)CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明有大量肝臟組織細(xì)胞凋亡。而EWAs給藥組的各項(xiàng)指標(biāo)均有了明顯的改善，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，因此，EWAs對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠ERS所致急性肝損傷的保護(hù)作用可能與其下調(diào)PERKeIF2αATF4通路蛋白表達(dá)，繼而減少CHOP表達(dá)，抑制CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減輕ERS有關(guān)。

綜上，本研究初步探討了蚯蚓活性組分對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠ERS所致急性肝損傷的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制，為深入研究急性肝損傷發(fā)生機(jī)制提供了新的參考，也為蚯蚓活性組分最終作為一類保肝藥物在臨床上應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chen Wei，He Ying，Jiang Dingwen，et alProtective effect of Fomes fomentarius extracts on CCl4induced acute liver injury in mice[J]Lishizhen Med Mater Med Res，2013，24（3）：605

[2]祝未名中藥地龍的活性成分與藥理作用研究[J]海峽藥學(xué)， 2013，25（4）：25

[3]Wang Q， Duan L X， Xu Z S，et alThe protective effect of the earthworm active ingredients on hepatocellular injury induced by endoplasmic reticulum stress[J]Biomed Pharmacother， 2016，82：304

[4]河南科技大學(xué) 一種蚯蚓提取物及其提取方法和應(yīng)用：中國(guó)， 2012100146536[P] 20120116

[5]黎永華，陶力內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小鼠急性肝損傷中的作用機(jī)制[J]廣東醫(yī)學(xué)，2015，36（1）：35

[6]Marumoto Y，Terai S， Urata Y，et al Continuous high expression of XBP1 and GRP78 is important for the survial of bone marrow cells in CCl4treated cirrhotic liver[J]Biochem Biophys Res Commun， 2008， 367（3）：546

[7]Ryusuke Akihara，Takujiro Homma， Jaeyong Lee， et alAblation of aldehyde reductase aggravates carbon tetrachlorideinduced acute hepatic injury involving oxidative stress and endoplasmic reticulum stress[J]Biochem Biophy Res Commun，2016，478（2）： 765

[8]Afzal M，Khan R，KazmiI，et alHepatoprotective potential of new steroid against carbon tetrachlorideinduced hepatic injury[J].Mol Cell Biochem，2013， 2： 355

[9]Parmar V M， Schroder M Sensing endoplasmic reticulum stress[J]Adv Exp Med Biol， 2012， 738：153

[10]Schnthal A H Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stresssignaling incancer[J]Biochem Pharmacol， 2013，85： 653

[11]Rozpdek W， Pytel D，Mucha B The role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP signaling pathway in tumor progression during endoplasmic reticulum stress[J]Author Manuscript， 2016，16（6）： 533

[12]Yang ShuangYan， Wei FuLan， Hu LiHua，et alPERKeIF2αATF4 pathway mediated by endoplasmic reticulum stress response is involved in osteodifferentiation of human periodontal ligament cells under cyclic mechanical force[J]Cell Signal， 2016，28：880

[13]Rao J， Zhang C， Wang P，et alC/EBP homologous protein （CHOP） contributes to hepatocyte death via the promotion of ERO1α signalling in acute liver failure[J]Biochem， 2015， 466（2）：369

[14]Chen L， Ren F， Zhang H， et al Inhibition of glycogen synthase kinase 3β ameliorates DGalN/LPSinduced liver injury by reducing endoplasmic reticulum stresstriggered apoptosis[J] PLoS ONE， 2012，7（9）：e45202

[責(zé)任編輯張寧寧]