孫永健 王 華 郭 森 黃登禹 張 博 榮志靖

（1 天津天獅學院生物與食品工程學院，天津301700；2 天津市食品研究所有限公司，天津301609）

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]又名北冬蟲夏草，是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目昆蟲蛹上形成的子座與蛹的復合體，在我國主要分布于遼寧、內(nèi)蒙古、吉林等地[1～3]。蛹蟲草富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等多種生物活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老等功效，藥理作用廣泛，藥用價值較高[4～6]。目前，利用昆蟲蛹或幼蟲培育蛹蟲草的方法主要有兩種，一種是通過喂食、噴灑、或與蛹蟲草菌絲體共培養(yǎng)的自然感染法，該方法操作簡便，但成功率低且耗時較長；另外一種是通過注射、穿刺等方法，人為提高蛹蟲草菌感染蛹體效率的人工感染法，相較于自然感染法來說，人為干預可以較大地提高感染的成功率且在一定程度上縮短栽培時間，但由于蛹體或蟲體有開放性損傷，容易導致壞蛹率較高，僵化率較低[7～12]。研究采用高溫高壓的方法對柞蠶蛹[An?theraea pernyi Pupa]進行了徹底滅菌，并利用其進行蛹蟲草的培育，所獲得的產(chǎn)品，較傳統(tǒng)方法具有生長速度快、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)等特點。新方法的應用，可以為蛹蟲草的人工培育開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器新潔爾滅、升汞為北京華威銳科化工有限公司生產(chǎn)；蟲草素標準品為Sigma 公司生產(chǎn)；甲醇為色譜純，購自上海泰瑞爾化學有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學試劑均為分析純，購自武漢易泰科技有限公司；新鮮滯育柞蠶蛹為市場采購，蛹蟲草菌種為天津市工業(yè)微生物研究所提供。

GZX-150BS 型光照培養(yǎng)箱、KYC-100B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海圣科儀器設備有限公司生產(chǎn)；MJ-78A 型高壓蒸汽滅菌鍋，上海巴玖實業(yè)有限公司生產(chǎn)；RZ-2D2G 型雙人桌面（水平）凈化工作臺，廣州瑞智凈化設備有限公司生產(chǎn)；Essentia LC-15C 型高效液相色譜儀，島津（中國）公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 栽培種的培養(yǎng) 稱取300 g馬鈴薯，去皮切成小塊，加適量蒸餾水煮沸30 min，用四層紗布過濾取濾液。向濾液中加入1.5 g 硫酸鎂、3 g 磷酸二氫鉀、10 mg 維生素B1、20 g 葡萄糖，用蒸餾水定容至1000 mL。將液體培養(yǎng)基分裝于8 個200 mL 錐形瓶中，每瓶加入20 粒0.6 cm 的玻璃珠，于121℃下滅菌20 min。滅菌完畢的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室，于22℃下預培養(yǎng)3 d，確認培養(yǎng)基沒有被雜菌污染，便可進行栽培種的接種。

在超凈工作臺中，挑取黃豆粒大小的蛹蟲草菌原種，接種于液體培養(yǎng)基。將接種好的錐形瓶，放置于搖床上進行避光振蕩培養(yǎng)，設定溫度為22℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，3 d 后選出菌液澄清、菌球長勢一致的栽培種繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后栽培種培養(yǎng)完成。

1.2.2 柞蠶蛹的預處理及接種方式的單因素試驗 用流動的水將柞蠶蛹清洗干凈，晾干表面的水，按表1的處理方式對柞蠶蛹進行預處理，采用注射法將培養(yǎng)好的栽培種菌液接種于蛹體，接種量為0.2 mL，注射部位為由尾部向上數(shù)第二節(jié)腹環(huán)處。通過考察栽培種對蛹體的感染率、柞蠶蛹完全僵化所需天數(shù)、子實體的萌發(fā)率、復合體的平均干重，確定較優(yōu)的預處理方式。

利用高溫高壓方式對清洗好的柞蠶蛹進行徹底滅菌，按表1的不同方式進行接種，其中注射法與上述接種方法相同，浸泡法為將柞蠶蛹完全浸沒于栽培種菌液5 s；共培養(yǎng)法可免去接種的步驟，就是將柞蠶蛹預先置于液體培養(yǎng)基中，然后進行栽培種的接種與培養(yǎng)，隨著菌種的生長，菌絲體不斷侵入蛹體，當栽培種培養(yǎng)完成后，接種也隨之完成。同樣考察上述幾個指標，以確定較優(yōu)的接種方式。

表1 蛹蟲草菌感染柞蠶蛹的方法

1.2.3 正交試驗設計 利用正交試驗設計對滅菌溫度、接種時的浸泡時間、液體培養(yǎng)基中柞蠶蛹浸提液的含量這3個因素進行3水平的設計。L9（34）的9組正交試驗中因素與水平的設計見表2。以復合體中蟲草素的含量為指標，優(yōu)化培育方法。

表2 正交試驗因素水平表

1.2.4 栽培管理 將接種好的柞蠶蛹置于培養(yǎng)瓶中，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，于17℃培養(yǎng)3～7 d，后進入提溫增菌階段，將溫度調(diào)整為24℃，繼續(xù)培養(yǎng)，使蠶蛹完全僵化。然后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室，進行晝夜溫差刺激培養(yǎng)，日間給予600 lx 的光照12 h，溫度設定為22℃，夜間避光12 h，溫度設定為16℃，空氣相對濕度保持在60%～70%，培養(yǎng)10 d 后原基開始形成。隨后進入發(fā)草階段，晝夜給予600 lx的光照，溫度固定在22℃，為保證新鮮空氣的流通，將瓶口擰松，空氣相對濕度保持在80%～90%，以利于子實體的成長。當子實體尖端稍有膨大時，即可進行采收。

圖1 蟲草素標品的高效液相色譜圖

1.2.5 成品的采收與加工 將培養(yǎng)好的柞蠶蛹蟲草復合體從培養(yǎng)瓶中取出，放入烘箱于60℃干燥2 h，取出進行整理，理順子實體后，于40℃繼續(xù)干燥4 h。烘干完成后，將柞蠶蛹蟲草復合體置于避光、陰涼、通風處徹底風干，避光保存。

1.2.6 蟲草素的提取 將柞蠶蛹蟲草復合體粉碎，過80 目篩，精確稱取2 g 樣品粉末，用50%的乙醇作為溶劑，以1∶50 的料液比，在80℃下，超聲波處理20 min（功率48 W），80℃水浴浸提10 min，重復4次，總計提取2 h。抽濾，收集濾液并以15%的甲醇定容至250 mL容量瓶。

1.2.7 蟲草素含量測定 標準曲線的繪制:精確稱取10 mg 蟲草素標準品（按實際含量折算），以15%的甲醇定容至25 mL 容量瓶，得到質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的蟲草素標準品儲備液[13～16]。利用儲備液分別配制質(zhì)量濃度為4 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、100 μg/mL的標準品溶液，分別將其過0.22 μm 微孔濾膜后進行高效液相色譜測定，根據(jù)標準品出峰時間（圖1）確定蟲草素的保留時間為19.743 min，以標準品濃度為橫坐標，測得的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（圖2），標準曲線方程為y=34975x+46048（R2=0.9993）。

色譜條件:色譜柱為C18 柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相為甲醇∶水=15∶85；流速，0.8 mL/min；柱溫，25℃；檢測波長，260 nm；進樣量，10 μL。

產(chǎn)品中蟲草素的測定:對產(chǎn)品進行5 次重復提取，分別在以上條件下進行蟲草素含量測定，蟲草素含量=（提取液中蟲草素濃度×提取液總體積）/產(chǎn)品粉末質(zhì)量。

圖2 蟲草素標準曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 柞蠶蛹的預處理對蛹蟲草培育的影響經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（表3），在4 種預處理方法中，升汞（A2）的滅菌效果最佳，接種的100 個柞蠶蛹中，僅有1 個被雜菌感染，其余均僵化變硬，僵化率最高，達到了99%；不經(jīng)預處理（A4）的柞蠶蛹，出現(xiàn)壞蛹較多，僵化率最低，僅為86%；但從蛹體僵化所需的時間、子實體是否萌發(fā)、復合體生長情況來看，利用高溫高壓（A1）進行預處理的效果最佳，接種后，雖然僵化率略低于A2處理，但蛹體完全僵化所需時間最短，僅為6 d，僵化的所有柞蠶蛹均萌發(fā)產(chǎn)生子實體，發(fā)草率高達100%，并且子實體長勢健壯、顏色金黃，蛹體呈棕色，沒有明顯的發(fā)黑現(xiàn)象（圖3），復合體平均干重在4種處理中最高，為3.54 g。

表3 滅菌、消毒方式對蛹蟲草培育的影響

圖3 4種不同預處理方法培育出的柞蠶蛹蟲草復合體

表4 接種方式對蛹蟲草培育的影響

圖4 利用3種不同方法進行接種，培養(yǎng)6 d后菌絲體的生長情況

由此可見，升汞滅菌法（A2）雖然可以起到較好的防止雜菌感染柞蠶蛹的效果，但由于重金屬汞對蛹體毒害較大及殘留難以清除干凈，子實體的萌發(fā)及生長均受到較大影響，不如其他3種預處理方式；新潔爾滅消毒法（A3）雖然在一定程度上可以防止雜菌的感染，但同樣會對子實體的萌發(fā)產(chǎn)生影響；而對不經(jīng)消毒、滅菌處理（A3）的柞蠶蛹接種后，開放性創(chuàng)口形成，蛹體較易被雜菌感染，引起了壞血蛹的出現(xiàn)，因此確定高溫高壓滅菌法為較優(yōu)的預處理方式。

2.2 接種方式對蛹蟲草培育的影響經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（表4），浸泡法（B1）、共培養(yǎng)法（B2），可以較好的避免因注射等復雜操作對蛹體造成的雜菌感染，所接種的柞蠶蛹均僵化變硬，僵化率達100%；采用共培養(yǎng)法（B2）進行接種時，柞蠶蛹在蛹蟲草菌栽培種的培養(yǎng)過程中就與其接觸，栽培種在擴大生長時就不斷地侵入蛹體，因此蛹體完全僵化時間明顯短于其它2 種接種方式，僅為3 d，但由于菌絲體在蛹體中生長時間過長，菌齡老化（圖4）等原因的影響，子實體萌發(fā)效果最差，發(fā)草率僅為89%；浸泡法（B1）不但操作簡便，不易引起雜菌感染，而且對子實體的萌發(fā)、生長無不利影響，因此確定為較優(yōu)的接種方式。

2.3 培育方法的優(yōu)化以復合體中蟲草素的含量（圖5）為指標，對利用無菌柞蠶蛹培育蛹蟲草的相關參數(shù)進行正交試驗優(yōu)化。結(jié)果表明（表5），在該方法中，影響柞蠶蛹蟲草復合體中蟲草素含量的主次因素，排序為滅菌溫度＞浸提液含量＞浸泡時間?？疾爝@幾個因素在3 個水平上的變化，確定較優(yōu)方案為A2C2B1，即在栽培種的液體培養(yǎng)基中，按50%的比例添加柞蠶蛹浸提液，在115℃的溫度下對柞蠶蛹進行高溫高壓滅菌，以將蛹體浸泡于栽培用菌液中10 s的方式來接種。

表5 正交試驗直觀分析表

圖5 柞蠶蛹蟲草復合體中蟲草素的高效液相色譜圖

在對正交試驗結(jié)果進行方差分析時，選取空列D作為誤差項，在α=0.05的條件下進行F檢驗，方差分析結(jié)果表明（表6），滅菌溫度和浸提液含量對柞蠶蛹蟲草復合體中蟲草素的含量具有顯著性影響，他們的改變在一定程度上可以影響蛹蟲草的品質(zhì)?？梢?，滅菌溫度為115℃時，既可以起到較好的滅菌效果，又不會因為溫度過高導致蛹體中的營養(yǎng)物質(zhì)被過多破壞，而影響蛹蟲草的生長；同時，以50%的比例向栽培種培養(yǎng)基中添加柞蠶蛹浸提液，可以起到使蛹蟲草菌適應柞蠶蛹營養(yǎng)成分的過度作用，為蛹蟲草菌侵入蛹體后的快速、穩(wěn)定生長發(fā)揮促進作用。

表6 正交試驗方差分析表

3 小 結(jié)

利用無菌柞蠶蛹進行蛹蟲草的培育，必然會減輕甚至完全消除雜菌的影響，增強蛹蟲草菌對柞蠶蛹的感染能力。結(jié)合操作簡便的浸泡法進行接種，盡量簡化中間步驟，可有效避免壞蛹的出現(xiàn)，使柞蠶蛹的僵化率達到100%。當以高溫高壓法作為滅菌方式時，在殺滅雜菌的同時，柞蠶蛹也被殺死，其機體當中能夠抵抗外來菌群侵染的免疫力也隨之消失，這可能就是利用該方法進行蛹蟲草培育時，蛹體完全僵化所需時間大大縮短的原因。同時，由于高溫的作用，可能會使柞蠶蛹中富含的蛋白質(zhì)降解為蛹蟲草菌更易于利用的氨基酸，從而使子實體的萌發(fā)率可提高至100%且長勢強健。研究確定的較優(yōu)方法，既縮短了蛹蟲草的培育周期，又提高了產(chǎn)品的品質(zhì)，可為蛹蟲草工業(yè)化快速生產(chǎn)，提供一種新的技術支持。