周佳勃，張宇霆，岳巍，邢月超，汪順偉，孫夢(mèng)，岳順利

（黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

N-乙酰半胱氨酸對(duì)玻璃化凍存小鼠GV期卵母細(xì)胞成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育能力影響

周佳勃，張宇霆，岳巍，邢月超，汪順偉，孫夢(mèng)，岳順利

（黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

冷凍保存后的GV期卵母細(xì)胞內(nèi)大量積累ROS，影響胚胎發(fā)育。NAC作為一種抗氧化劑，可緩解氧應(yīng)激造成的損傷。但NAC對(duì)冷凍GV期卵母細(xì)胞是否存在維持作用尚待研究。為探究NAC在冷凍、解凍后小鼠GV期卵母細(xì)胞發(fā)育中作用，檢測(cè)冷凍保存后小鼠GV期卵母細(xì)胞在添加不同濃度NAC成熟培養(yǎng)液后成熟情況，觀察其卵裂率與囊胚率、線粒體分布、ROS水平和受精后胚胎發(fā)育等。結(jié)果表明，添加1.5 mmol·L-1NAC，冷凍保存后，小鼠GV期卵母細(xì)胞，線粒體排布均勻，卵母細(xì)胞比例顯著提高，ROS水平降低。NAC可改善小鼠GV期卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍保存后復(fù)蘇和體外成熟水平，提高其發(fā)育能力。

小鼠；N-乙酰半胱氨酸；玻璃化冷凍保存；卵母細(xì)胞；ROS

卵細(xì)胞玻璃化冷凍在細(xì)胞保存中廣泛應(yīng)用，可使卵細(xì)胞長(zhǎng)期保存，為基因庫(kù)建立提供技術(shù)保障。目前，常規(guī)冷凍保存主要應(yīng)用于MⅡ期卵母細(xì)胞。但MⅡ期卵母細(xì)胞在低溫條件下易受損傷，出現(xiàn)紡錘體分解、微絲降解、皮質(zhì)顆粒釋放等現(xiàn)象。

研究表明，GV期卵母細(xì)胞代替MⅡ期卵母細(xì)胞作冷凍保存，可提高卵母細(xì)胞低溫耐受性[1]。但GV期卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）及保存后復(fù)蘇要求更高[2-3]。不成熟卵母細(xì)胞復(fù)蘇效率與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞無(wú)明顯差異，但前者受精率與囊胚率明顯低于后者[4]。玻璃化冷凍保存不成熟小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力、低溫保存和體外成熟條件有待提高[2]。目前，多數(shù)研究集中在平衡時(shí)間、降溫速率等方面，冷凍保護(hù)劑及復(fù)蘇后培養(yǎng)成分研究相對(duì)較少。為此，本試驗(yàn)以小鼠GV期卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，探究冷凍保存和復(fù)蘇后培養(yǎng)成分對(duì)卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育能力影響。

哺乳動(dòng)物早期胚胎體外發(fā)育過(guò)程可產(chǎn)生活性氧。廣義活性氧自由基包括超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（HO-）。ROS可影響母體到合子遺傳調(diào)控轉(zhuǎn)換，將胚胎發(fā)育阻斷于特定階段，即合子基因組激活時(shí)期[5]。例如小鼠體內(nèi)ROS產(chǎn)量在受精和第二細(xì)胞期G2/M期升高，綿羊體內(nèi)ROS產(chǎn)量上升時(shí)期也與發(fā)育阻滯時(shí)間吻合[6]。卵母細(xì)胞低溫保存時(shí)積累大量ROS，造成線粒體損傷、ATP降解，影響受精過(guò)程中Ca2+波動(dòng)，甚至阻滯胚胎發(fā)育[7]，降低冷凍保存后卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。

N-乙酰半胱氨酸（NAC）作為一種抗氧化劑，可有效清除細(xì)胞內(nèi)自由基，減輕氧應(yīng)激，提高胚胎發(fā)育能力。同時(shí)，NAC是谷胱甘肽（GSH）合成前體，可提高細(xì)胞外巰基含量，促進(jìn)GSH細(xì)胞內(nèi)生物合成[8]，提高谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性[9]。Whitaker等研究表明，卵母細(xì)胞成熟液中添加NAC可有效提高酶活力，清除自由基[10]。胚胎時(shí)期補(bǔ)充NAC可有效降低由ROS造成的牛畸型胚和流產(chǎn)發(fā)病率[11]。添加NAC可降低由氧自由基引起的端?？s短、端粒融合、染色體異常等問(wèn)題，提高小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育[12-13]。NAC可提高線粒體活性、促進(jìn)基因表達(dá)，改善大齡雌鼠體內(nèi)胚胎發(fā)育環(huán)境[14]。

NAC提高經(jīng)玻璃化冷凍保存GV期卵母細(xì)胞質(zhì)量研究，目前尚不明確。本試驗(yàn)通過(guò)在GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存及體外成熟兩個(gè)過(guò)程添加不同濃度NAC，判斷最適添加量。檢測(cè)經(jīng)不同處理卵母細(xì)胞ROS水平、復(fù)蘇后存活率和成熟率、胚胎發(fā)育時(shí)卵裂率與囊胚率、活性線粒體排布情況，對(duì)比不同培養(yǎng)環(huán)境下卵母細(xì)胞質(zhì)量。探究不同時(shí)期添加NAC對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量影響，獲得適宜玻璃化冷凍保存方案，提高長(zhǎng)距離卵母細(xì)胞運(yùn)輸效率和利用率。

1 材料與方法

本試驗(yàn)所用化學(xué)藥物如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)于Sigma化學(xué)試劑公司。

1.1 動(dòng)物處理

試驗(yàn)用卵細(xì)胞取自6-8周齡ICR雌鼠、精子取自8～12周齡ICR雄鼠（均購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司）。所有動(dòng)物常規(guī)控光（光照時(shí)間：7:00～19:00）環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 GV期卵母細(xì)胞收集

挑選健康雌鼠，腹腔注射7.5 IU PMSG（購(gòu)于哈爾濱市香坊區(qū)獸藥市場(chǎng)），44 h后頸椎脫臼法處死小鼠，取卵巢組織移至體視顯微鏡下，卵泡穿刺法獲得GV期卵母細(xì)胞。得到卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），根據(jù)不同試驗(yàn)要求玻璃化冷凍保存或體外成熟。

1.3 卵母細(xì)胞玻璃化保存與解凍

收集的COCs在含有15%乙二醇（EG）和20%胎牛血清（FCS）的DPBS中平衡3 min，轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍液（含有30%EG、20%FCS和0.5 mol·L-1蔗糖的DPBS）中1 min。將COCs裝載至Cryotop液體薄膜上，快速投入液氮中。

1.3.1 冷凍卵母細(xì)胞解凍

將帶有卵母細(xì)胞的Cryotop薄膜浸泡在預(yù)熱含有20%FCS和0.5 mol·L-1蔗糖的DPBS中3 min，移至37℃環(huán)境下5 min[13]。利用顯微鏡觀察COCs，選取可用COCs體外成熟。

1.4 卵母細(xì)胞體外成熟

未經(jīng)冷凍處理（對(duì)照組）和經(jīng)冷凍處理卵母細(xì)胞分別體外成熟。每30～50個(gè)COCs移入50 μL成熟培養(yǎng)滴，上覆石蠟油，置于37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)16 h。顯微鏡下觀察，以排出第一極體為卵母細(xì)胞成熟標(biāo)志。于體式顯微鏡下觀察，記錄成熟效率。

1.5 ROS濃度檢測(cè)

利用2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCHFDA）探針可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平[14-15]。DCHFDA溶解于二甲基亞砜（DMSO）配置1 mmol· L-1濃貯液-20℃避光保存，使用時(shí)用M2稀釋至10 μmol·L-1。37℃孵育10 min后充分去除染液，每10枚卵細(xì)胞移入一個(gè)微滴中，放入培養(yǎng)箱中孵育15 min。孵育后卵母細(xì)胞用M2沖洗干凈，去除背景，降低干擾。Leica激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)leica公司）488 nm處觀察，分析熒光強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞內(nèi)線粒體排布檢測(cè)

利用Mito Tracker Red標(biāo)記線粒體。透明質(zhì)酸酶消化卵母細(xì)胞5 min，去除顆粒細(xì)胞，將裸露卵母細(xì)胞（DOs）移入含有200 nmol·L-1Mito Tracker Red的M2中，在37℃，5%CO2環(huán)境中孵育30 min，孵育后，用M2將卵母細(xì)胞沖洗3次。激光共聚焦顯微鏡觀察并取圖，相關(guān)軟件分析。

1.7 體外受精（IVF）和胚胎培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死雄鼠，將附睪尾部及輸精管剪下，人合成輸卵管液（HTF）中剪碎，300 g離心，取上清液，37℃培養(yǎng)箱HTF液中獲能l h后（精子密度每mL含2～4×106個(gè)），將新鮮和復(fù)蘇后卵母細(xì)胞分別移入90 μL覆有石蠟油受精液中受精5～6 h。IVF后，KSOM-AA清洗3次，轉(zhuǎn)移至覆有石蠟油含有40 μL KSOM-AA微滴中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24和96 h分別觀察并記錄2-細(xì)胞時(shí)期和囊胚階段胚胎數(shù)目。

1.8 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，SPSS 16.0軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。存活率和成熟率采用方差分析，卵裂率和發(fā)育率采用百分比t檢驗(yàn)分析。P<0.05代表差異顯著。

1.9 主要藥品

今年以來(lái)，為了積極應(yīng)對(duì)經(jīng)貿(mào)摩擦，貫徹落實(shí)中央關(guān)于做好“穩(wěn)就業(yè)、穩(wěn)金融、穩(wěn)外貿(mào)、穩(wěn)外資、穩(wěn)投資、穩(wěn)預(yù)期”的決策部署，上海市制定出臺(tái)了“關(guān)于做好當(dāng)前外貿(mào)工作優(yōu)化企業(yè)服務(wù)的20條工作措施”，市商務(wù)委將繼續(xù)會(huì)同化工行業(yè)協(xié)會(huì)，加強(qiáng)對(duì)本市化工領(lǐng)域遭受國(guó)外貿(mào)易壁壘的調(diào)查研究，持續(xù)深化上海技術(shù)性貿(mào)易措施化工行業(yè)示范點(diǎn)功能，做好產(chǎn)業(yè)安全預(yù)警工作，提升本市公平貿(mào)易公共服務(wù)的準(zhǔn)確性和前瞻性。

KSOM-AA培養(yǎng)液：用于胚胎及卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)，主要成分有EDTA-Na20.38 mg、NaCl 559.5 mg、KCl 18.5 mg、KH2PO44.75 mg、MgSO4·7H2O 4.95 mg、乳酸鈉0.174 mL、葡萄糖3.6 mg、NaHCO3210 mg、谷氨酰胺14.5mg、丙酮酸鈉2.2 mg、青霉素6.3 mg、鏈霉素5 mg、MEM必須氨基酸1 mL、MEM非必須氨基酸0.5 mL、蒸餾水100 mL。

M2操作液：用于獲取卵母細(xì)胞時(shí)作為操作液及稀釋透明質(zhì)酸酶或DCHFDA等，主要成分有CaCl2·2H2O 25.1 mg、無(wú)水MgSO416.5 mg、KCl 35.6 mg、KH2PO416.2 mg、NaHCO335 mg、NaCl 553.2 mg、牛血清白蛋白400 mg、葡萄糖100 mg、HEPES·Na 542.7 mg、酚紅試劑1.06 mg、丙酮酸鈉3.6 mg、乳酸鈉295 mg、青霉素6 mg、鏈霉素5 mg、蒸餾水100 mL。

HTF液：用于體外受精，主要成分有NaCl 1.1875 g、KCl 0.0699 g、MgSO4·7H2O 0.00986 g、KH2PO40.01008 g、CaCl2·2H2O 0.06 g、NaHCO30.42 g、葡萄糖0.1 g、丙酮酸鈉0.0073 g、乳酸鈉0.683 mL、青霉素0.015 g、鏈霉素0.01 g、酚紅試劑0.04 g、BSA 0.8 g、蒸餾水200 mL。

DPBS：杜氏磷酸緩沖液，主要成分為：KCl 0.2 mg·L-1、KH2PO40.2 mg·L-1、NaCl 8.00 mg· L-1、Na2HPO41.15 mg·L-1，pH為7.4。

成熟培養(yǎng)液為含有5%FBS，25 μg·mL-1丙酮酸，300ng·mL-1FSH，50μg·mL-1鏈霉素和75μg·mL-1青霉素MEM培養(yǎng)液。

M16培養(yǎng)液：主要成分有NaCl 553.3 mg、KCl 35.6 mg、MgSO4·7H2O 29.3 mg、KH2PO416.2 mg、CaCl2·2H2O 25.2 mg、NaHCO3210 mg、葡萄糖110.2 mg、丙酮酸鈉3.6 mg、乳酸鈉0.35 mL、青霉素6 mg、鏈霉素6 mg、酚紅試劑2 mg、BSA 400 mg、蒸餾水100 mL。

向玻璃化冷凍液、體外成熟液中分別添加0、1、1.5和2 mmol·L-1NAC，然后IVF或胚胎培養(yǎng)。以新鮮GV期卵母細(xì)胞作對(duì)照。

1.11 線粒體排布情況分析

活性線粒體染色：利用Mito Tracker Red標(biāo)記不同處理組卵母細(xì)胞線粒體，分類線粒體排布情況。

1.12 ROS水平檢測(cè)

為確定冷凍保存過(guò)程中是否積累大量ROS，采用DCFHDA探針染色，利用分析軟件檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加NAC對(duì)卵母細(xì)胞IVM和移植前發(fā)育影響

篩選添加不同濃度NAC處理結(jié)果如圖1，添加1和1.5 mmol·L-1NAC可提高復(fù)蘇卵母細(xì)胞囊胚率；添加1.5 mmol·L-1NAC的卵裂率與囊胚率均顯著提高（P<0.05）；添加2 mmol·L-1NAC的卵裂率和囊胚率與添加1.5 mmol·L-1無(wú)顯著差異（P>0.05）。因此，后續(xù)試驗(yàn)添加NAC濃度為1.5 mmol·L-1。

圖1 向IVM中添加不同濃度NAC的GV期卵母細(xì)胞發(fā)育能力Fig.1Effects of NAC supplementation in the IVM medium on pre-implantation development from the vitrified GV-oocytes

2.2 NAC對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量和成熟率影響

檢測(cè)不同階段添加1.5 mmol·L-1NAC的GV期卵母細(xì)胞成熟率和解凍后形態(tài)學(xué)上正常卵母細(xì)胞數(shù)目（以下稱存活率）。結(jié)果由圖2可見，存活率與是否添加NAC不相關(guān)。在卵母細(xì)胞成熟液中添加NAC（以下如無(wú)特殊說(shuō)明均為1.5 mmol·L-1），其MⅡ期卵細(xì)胞數(shù)目差異顯著。僅在體外成熟液中添加NAC，無(wú)法提高成熟率，同時(shí)向玻璃化冷凍液與成熟液中添加NAC，成熟液中有/無(wú)NAC兩組相比，成熟率顯著提高。

圖2 不同階段添加NAC對(duì)于GV期卵母細(xì)胞存活率與成熟率影響Fig.2Effects of NAC supplementation during vitrification/warming and IVM of GV stage oocytes on survival and nuclear maturation rates

2.3 NAC對(duì)線粒體排布和ROS水平影響

線粒體排布情況如圖3，線粒體排布均勻設(shè)為A類，發(fā)生少量凝集設(shè)為B類，線粒體排布紊亂設(shè)為C類。通過(guò)對(duì)比是否經(jīng)冷凍處理與是否添加NAC試驗(yàn)組，結(jié)果如表1所示，相對(duì)于不經(jīng)冷凍處理，冷凍處理后卵母細(xì)胞中A類細(xì)胞所占比例顯著降低（P<0.05）。而在成熟液中添加NAC，卵母細(xì)胞中A類型細(xì)胞所占比例明顯提高（P<0.05）。

圖3 線粒體排布分類Fig.3Representative mitochondrial distribution patterns

表1 NAC對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響和線粒體排布分類Table 1Effects of NAC on the ROS level and mitochondrial distribution of vitrified-warmed mouse oocyte

分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平結(jié)果如表1所示：經(jīng)冷凍處理卵母細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著高于未經(jīng)冷凍處理卵母細(xì)胞。而在玻璃化冷凍液與成熟液中均添加NAC卵母細(xì)胞與未經(jīng)冷凍處理卵母細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度差異不顯著。

2.4 NAC對(duì)經(jīng)冷凍保存的卵母細(xì)胞發(fā)育能力影響

圖4 在玻璃化冷凍保存或體外成熟不同階段添加NAC對(duì)卵裂率和囊胚率影響Fig.4Effects of NAC supplementation during vitrification/thawing and/or IVM on the developmental competence of vitrified oocytes

通過(guò)添加NAC比較不同試驗(yàn)組卵裂率與囊胚率，推斷NAC對(duì)經(jīng)冷凍處理GV期卵母細(xì)胞質(zhì)量是否有積極影響。由圖4可知，僅在玻璃化冷凍液中添加NAC卵母細(xì)胞的囊胚率無(wú)顯著提高，在體外成熟液中添加NAC，其囊胚率則顯著提高（P<0.05），但卵裂率并無(wú)明顯提高。而在玻璃化冷凍液與成熟液中均添加NAC，其卵裂率與囊胚率均提高，且與未經(jīng)冷凍保存處理的卵母細(xì)胞發(fā)育能力相近（P>0.05）。

3 討論

低溫冷凍配子和胚胎保存方法適用于人和動(dòng)物。而用于冷凍卵細(xì)胞囊胚率有待提高。經(jīng)冷凍保存后卵細(xì)胞和胚胎，對(duì)氧自由基更敏感[15]。隨ROS水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷，ATP降解，受精過(guò)程Ca2+波動(dòng)降低等危害，阻滯胚胎發(fā)育。氧化應(yīng)激與多種細(xì)胞損傷相關(guān)，如導(dǎo)致質(zhì)膜氧化、氨基酸與核酸氧化、細(xì)胞老化和凋亡等，降低卵細(xì)胞質(zhì)量與發(fā)育能力。NAC作為抗氧化劑，可有效清除細(xì)胞內(nèi)自由基，促進(jìn)胞內(nèi)GSH生物合成。向成熟培養(yǎng)液中添加NAC可增強(qiáng)酶活力。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加NAC可有效促進(jìn)經(jīng)冷凍保存GV期卵母細(xì)胞發(fā)育至囊胚；添加1.5 mmol·L-1NAC培養(yǎng)，卵裂率與囊胚率均顯著提高。向玻璃化冷凍液和保存液中添加NAC可顯著提高卵母細(xì)胞成熟率，但無(wú)法影響冷凍后存活率。結(jié)果與Moawad等研究一致，小鼠GV期卵母細(xì)胞存活率并不受L-肉毒堿影響[16]。添加cAMP調(diào)控元件毛喉素（FSK）或3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）均顯著提高冷凍保存后牛GV期卵母細(xì)胞發(fā)育能力，但無(wú)法提高存活率[17]。本試驗(yàn)表明，雖然卵母細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無(wú)顯著變化，但NAC影響其內(nèi)部因子，促進(jìn)發(fā)育。

冷凍保存后，卵母細(xì)胞和胚胎對(duì)氧應(yīng)激更加敏感，易出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、脂膜損傷和結(jié)構(gòu)破壞等問(wèn)題。多由ROS水平上升引起。異常新陳代謝反應(yīng)會(huì)提高ROS水平，ROS可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)氧應(yīng)激指標(biāo)。此外，在胚胎植入前發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)能量主要來(lái)源是線粒體氧化磷酸化反應(yīng)。因此，線粒體對(duì)早期胚胎發(fā)育有重要作用。線粒體紊亂可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平異常，染色體分離失調(diào)，影響卵母細(xì)胞成熟，阻滯卵細(xì)胞分裂。在冷凍保存過(guò)程中，人和小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體活性顯著降低。卵母細(xì)胞內(nèi)大量積累ROS導(dǎo)致線粒體功能紊亂，產(chǎn)生大量線粒體碎片。細(xì)胞核和細(xì)胞器所需能量不足導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育能力衰退。本試驗(yàn)向冷凍液和成熟液中添加NAC可有效降低DCHFDA標(biāo)記ROS熒光強(qiáng)度，即NAC在細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)程起重要作用。同時(shí)，NAC顯著促進(jìn)（P< 0.05）卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體呈均勻排布，降低線粒體凝集比例。由此，推測(cè)NAC通過(guò)清除卵母細(xì)胞內(nèi)ROS，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。

研究表明，小鼠[18]、人[19]、豬[20]、牛[21]、山羊[22]或馬[23]GV期卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍保存后，核成熟率明顯降低?？赡芘c細(xì)胞成熟相關(guān)細(xì)胞器損傷有關(guān)[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GV期卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍保存后，核成熟率顯著下降。在冷凍保存和體外成熟過(guò)程中，添加NAC可緩解核成熟率降低，達(dá)到未經(jīng)冷凍處理卵母細(xì)胞核成熟水平，僅向成熟液中添加NAC則無(wú)法實(shí)現(xiàn)相應(yīng)提高。GV期卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍保存后，添加NAC可緩解胚胎發(fā)育能力降低問(wèn)題。因此，推測(cè)NAC在胞質(zhì)成熟過(guò)程發(fā)揮作用。

向玻璃化冷凍液和成熟液中添加NAC可減少細(xì)胞器損傷，但其主要機(jī)制尚不明確。Whitaker等指出，NAC可直接與自由氧基相互作用，提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量[25]，防止ROS水平上升導(dǎo)致DNA和染色體損傷，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。推測(cè)與NAC作為抗氧化劑有關(guān)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平并提高線粒體活性，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。

在小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存過(guò)程中，添加適當(dāng)濃度NAC可有效抑制ROS等氧應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，提高經(jīng)冷凍處理卵母細(xì)胞復(fù)蘇率與存活率，促進(jìn)卵母細(xì)胞線粒體均勻排布，改善卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育能力。

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Effect of N-acetyl-L-cysteine on mouse GV oocyte maturation and subsequent embryonic development following vitrfication/ZHOUJiabo,

ZHANG Yuting,YUE Wei,XING Yuechao,WANG Shunwei,SUN Meng,YUE Shunli(Key Laboratory of Animal Cellular and Genetic Engineering of Heilongjiang Province,School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Large amounts of ROS were accumulated in frozen-thawed GV-stage oocytes,which could affect embryonic development.NAC,as an antioxidant,could alleviate the damage caused by oxidative stress.However,currently,it remained to be seen whether NAC has a maintenance effect in frozen-thawed GV-stage oocytes.To investigate the role of NAC in frozen-thawed mouse GV-stage oocytes development,the maturation of frozen-thawed mouse GV-stage oocytes was examined at maturation medium added different concentrations of NAC and the cleavage rate,blastocyst rate, mitochondrial distribution,ROS level and embryo development after fertilization were observed.The results showed that the mitochondria were homogeneous,the proportion of oocytes was significantly increased,and the level of ROS was decreased into cryopreserved mouse GV-stage oocytes afteradding 1.5 mmol·L-1NAC.These results suggested that NAC can improve the recovery andin vitro maturation of frozen-thawed mouse GV-stage oocytes and improve their developmental potency.

mouse;N-acetyl-L-cysteine;vitrification;oocyte;ROS

Q492

A

1005-9369（2017）02-0076-07

2016-10-24

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31372311）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2013RFLXJ005）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)人才基金項(xiàng)目（2012RCB18）

周佳勃（1974-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)椴溉閯?dòng)物配子及胚胎工程。E-mail:chowjb@163.com

時(shí)間2017-3-7 16:18:40[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170307.1618.020.html

周佳勃,張宇霆,岳巍,等.N-乙酰半胱氨酸對(duì)玻璃化凍存小鼠GV期卵母細(xì)胞成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育能力影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(2):76-82.

Zhou Jiabo,Zhang Yuting,Yue Wei,et al.Effect of N-acetyl-L-cysteine on mouse GV oocyte maturation and subsequent embryonic development following vitrfication[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(2):76-82.(in Chinese with English abstract)