周東興，王曉，寧玉翠，李晶，鄔欣慧，王廣棟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

鎘脅迫對赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）氧化應(yīng)激反應(yīng)影響

周東興，王曉，寧玉翠，李晶，鄔欣慧，王廣棟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

蚯蚓受重金屬脅迫時，體內(nèi)立即產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，確定脅迫過程氧化應(yīng)激主要指標(biāo)對污染監(jiān)測尤為重要。將脅迫試驗分短期和長期試驗兩組，前者試驗周期為10 d，每天取1條蚯蚓；后者試驗周期為30 d，每10 d取1條蚯蚓。每組均設(shè)定Cd2+濃度梯度50、100、125、250和500 mg·kg-1重金屬脅迫溶液，選擇蚯蚓環(huán)帶后尾部測定體內(nèi)SOD、POD、GPX、GST、CAT、VE、MDA和AChE。結(jié)果表明，短期試驗組，反映蚯蚓體內(nèi)氧化應(yīng)激主要指標(biāo)為CAT、SOD和POD。在長期試驗中，反映蚯蚓體內(nèi)氧化應(yīng)激主要指標(biāo)為GPX和MDA。

Cd脅迫；蚯蚓；氧化應(yīng)激反應(yīng)

鎘（Cd）是普遍存在于農(nóng)業(yè)面源的重金屬污染物[1]。由于重金屬污染的隱蔽性、表聚性、不可逆性以及長期、易積累性[2]，大量動植物體內(nèi)已監(jiān)測到Cd2+，引起廣泛關(guān)注[3-4]。2014年全國土壤污染狀況調(diào)查公報顯示，重金屬Cd污染點位超標(biāo)率達7%，居于八種重金屬(鎘、汞、砷、銅、鉛、鉻、鋅和鎳)污染之首[5]。因此，定期監(jiān)測土壤中重金屬污染尤為重要。近年來，國內(nèi)外環(huán)境保護機構(gòu)認為單獨重金屬含量監(jiān)測無法代表其對生態(tài)系統(tǒng)的真實效應(yīng)[6]。因此，污染土壤生態(tài)安全評價和早期污染預(yù)警研究受到高度重視，建立土壤生物早期預(yù)警風(fēng)險評價體系具有重要意義。

蚯蚓是土壤中生物量最大動物種群之一，占60%～80%[7-8]。從生態(tài)學(xué)上看，蚯蚓處于陸地生態(tài)系統(tǒng)食物鏈最底層，對多數(shù)污染物敏感，其生態(tài)毒理試驗測試終點具有生態(tài)毒理相關(guān)性等優(yōu)點[9-10]，可作為早期預(yù)警生物，評價土壤污染狀況和環(huán)境質(zhì)量[11]。

蚯蚓是表征土壤重金屬含量水平良好標(biāo)志物。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)低濃度鎘溶液促進赤子愛勝蚓體內(nèi)過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性增強，高濃度時則抑制，呈“倒U型”曲線[12]。Zhu等研究則表明高濃度鎘抑制過氧化物酶活性[13]。大量研究表明蚯蚓對鎘脅迫表現(xiàn)較高耐性。Demuynck等證實蚯蚓體內(nèi)MT可作為鎘脅迫下敏感性生物標(biāo)志物[14]。Naimj等研究則證實赤子愛勝蚓體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性可靈敏監(jiān)測土壤中農(nóng)藥生物毒性[15]。

本試驗以外源添加Cd2+為單一重金屬脅迫物質(zhì)，采用OECD（Organization for economic cooperation and development，經(jīng)濟合作與發(fā)展組織）推薦蚯蚓急性毒性試驗的濾紙試驗和人工土壤試驗方法[16]，以赤子愛勝蚓為研究對象，測定不同脅迫時間、濃度下蚯蚓體內(nèi)過氧化物酶（POD）、超氧化物酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛(MDA）、乙酰膽堿酯酶（AChE）和維生素E（VE）活性或含量變化等相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)，分析脅迫時間和濃度與相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)效應(yīng)關(guān)系，以期為重金屬污染早期預(yù)警奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

1.1.1 藥品與試劑

試驗中添加鎘為CdCl2·2.5H2O，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；草炭；高嶺土（Ai2O3·2SiO2·2H2O），分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；石英砂主要成分SiO2，為普通河沙。PBS緩沖液（干粉)，分析純，Coolaber science公司生產(chǎn)，使用時每袋加去離子水定容至1 L。

1.1.2 人工土壤配制

依據(jù)OECD標(biāo)準(zhǔn)配制人工土壤將草炭和石英砂風(fēng)干過2 mm篩后按照草炭?高嶺土?石英砂=1 ? 2 ? 7比例配制，混合均勻后，碳酸鈣調(diào)節(jié)pH 6.0～6.5，去離子水調(diào)節(jié)土壤水分為最大持水量40%。

1.2 供試蚯蚓

試驗蚯蚓為赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）。選取2月齡以上300～500 mg、具有明顯環(huán)帶健康成蚓。試驗開始前，試驗蚯蚓清水沖洗體表，干凈濾紙擦干水分后置于濕潤濾紙上，黑暗環(huán)境中清腸處理24 h，除去蚯蚓腸道內(nèi)雜物等。人工土壤試驗所用蚯蚓測試溫度（22±2）℃，人工土壤中馴養(yǎng)兩周后，挑選尺寸均勻成年蚯蚓用于試驗。試驗過程蚯蚓病死率低于1%。

1.3 鎘脅迫下赤子愛勝蚓急性毒性效應(yīng)

設(shè)定赤子愛勝蚓急性毒性效應(yīng)預(yù)試驗，確定適宜鎘濃度。預(yù)試驗中鎘濃度設(shè)定為：0.01、0.1、1、10、100、1000 mg·kg-1。結(jié)果表明，濃度為100 mg·kg-1脅迫30 d天，蚯蚓全部存活。濃度為1000 mg·kg-1脅迫18 h后，蚯蚓全部死亡。正式試驗時，將CdCl2·2.5H2O溶于去離子水，制成0、20、40、80、120、160、200、250 mg·kg-1濃度鎘溶液。在直徑9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)墊入相同規(guī)格雙層濾紙，均勻淋灑5 mL相應(yīng)濃度鎘溶液。培養(yǎng)皿敞口至于人工氣候箱中，20℃，30%光照，過夜干燥，獲得試驗所需Cd2+在濾紙上沉積量。

干燥過夜后，分別向培養(yǎng)皿中補充5 mL去離子水。清洗清腸后蚯蚓體表，濾紙吸干蚯蚓表面水分，放入培養(yǎng)皿中，記錄蚯蚓質(zhì)量。為防止同一培養(yǎng)皿內(nèi)蚯蚓死亡影響其他蚯蚓，每個培養(yǎng)皿內(nèi)放置1條蚯蚓。培養(yǎng)皿蓋子內(nèi)側(cè)墊入1 mL去離子水濕潤的直徑9 cm濾紙，保證濕度相對穩(wěn)定，同時記錄培養(yǎng)皿和蚯蚓總重量。每個重金屬鎘濃處理組度設(shè)10次重復(fù)。培養(yǎng)皿底與蓋間留有寬約2 mm細縫供蚯蚓逃逸。將培養(yǎng)皿放在（22±2）℃，濕度80%，無光照條件人工氣候箱中。記錄試驗開始時間。同時設(shè)置五個空白對照處理，測定人工氣候箱蒸發(fā)量。

在試驗開始后第6、12、24、36、48、72和96 h觀察并記錄各培養(yǎng)皿總重量和蚯蚓中毒癥狀及行為，當(dāng)用牙簽刺激蚯蚓尾部無反應(yīng)時，判斷蚯蚓已死亡，未死亡蚯蚓軀體出現(xiàn)斷裂的標(biāo)記為“斷裂”。

1.4 鎘脅迫對赤子愛勝蚓氧化應(yīng)激反應(yīng)影響

1.4.1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置長期和短期試驗兩組，根據(jù)赤子愛勝蚓急性毒性試驗結(jié)果，每組依據(jù)Cd2+濃度設(shè)置五個濃度梯度。如表1所示。選用19 cm×12.5 cm× 4.5 cm塑料盒，每個塑料盒加入200 g人工土壤，用噴壺將配制的不同濃度梯度重金屬Cd2+溶液均勻噴灑于土壤并攪拌。室溫下靜置48 h以上，待重金屬溶液充分浸入土壤中，再次向土壤中添加少量去離子水，保證水分含量在最大持水量40%。每個塑料盒中放置已清腸處理，洗凈體表的蚯蚓10條，覆蓋扎有小孔保鮮膜，防止土壤干燥。將塑料盒放于（22±2）℃，濕度80%條件下人工氣候箱中培養(yǎng)，并提供連續(xù)光照，確保試驗期間蚯蚓始終生活在土壤中。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.4.2 樣品采集與測定指標(biāo)

短期試驗周期為10 d，每天每盒隨機取蚯蚓一條；長期試驗周期30 d，每隔10 d取脅迫處理蚯蚓一條，去離子水洗凈蚯蚓體表，濾紙擦干水分后放入-80℃冰箱中保存待測。

表1 試驗設(shè)計Table 1Experimental design

由于外來污染物在蚯蚓體內(nèi)分布的異質(zhì)性[17-18]，本試驗以蚯蚓環(huán)帶后尾部為研究對象。手術(shù)刀切開待測蚯蚓環(huán)帶下部，環(huán)帶后尾部放入玻璃勻漿器中，加入9倍于蚯蚓質(zhì)量（精確到0.000 1 g）PBS緩沖液（pH為7.3），冰水浴中手動研磨，研磨充分后將勻漿液放入離心管中，4℃、3 500 r·min-1離心30 min，取上清液置于-20℃冰箱中待測。

總蛋白含量測定：考馬斯亮藍比色法[19]。

過氧化物酶（POD）活力測定：利用POD催化過氧化氫反應(yīng)原理，測定其酶活性[20]。

總超氧化物歧化酶（SOD）活力測定：利用SOD對超氧陰離子自由基專一性抑制作用原理測定SOD酶活力[21]。

谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活力測定：2-硫代-2，4二硝基苯甲酸比色法[22]。

谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）活力測定：1-氯-2, 4-二硝基苯比色法[23]。

過氧化氫酶（CAT）活力測定：鉬酸銨比色法[24]。乙酰膽堿酯酶（AChE）活力測定：1，3，5-三硝基苯比色法[25]。

丙二醛（MDA）含量測定：硫代巴比妥酸法[26]。

維生素E（VE）含量測定：菲羅啉比色法[27]。

以上測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 統(tǒng)計分析

Microsoft Excel（2003）作數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表處理，采用SPSS 19.0軟件作相關(guān)性分析，Duncan's檢驗顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下赤子愛勝蚓中毒癥狀

當(dāng)將蚯蚓放入Cd2+濃度為80 mg·kg-1培養(yǎng)皿中時，蚯蚓體表立即分泌帶有特殊氣味黃色液體并劇烈扭動，隨后恢復(fù)平靜。隨Cd2+脅迫濃度增加，蚯蚓恢復(fù)平靜所需時間延長。

中毒死亡蚯蚓身體呈扁平狀，兩側(cè)凹凸不規(guī)則，部分蚯蚓尾部斷裂成多段或呈“藕斷絲連”串珠狀（見圖1）?？谇叭~周圍有黃色液體，頭部呈三角狀并翹起；體表褶皺，分節(jié)不清晰；環(huán)節(jié)呈現(xiàn)白色，長橢圓形，水泡狀；自環(huán)帶以下，蚓體僵硬，由于蚓體腹部收縮較背部大，故蚯蚓尾部呈現(xiàn)鉤狀。在顯微鏡下觀察，可見蚯蚓體表剛毛囊零星凸起，大部分剛毛脫落，剩余剛毛頂端呈現(xiàn)鉤狀；背孔張開，有液體分泌，周圍出現(xiàn)深色斑點；部分體表破裂，可見蚓體內(nèi)物質(zhì)；部分蚯蚓肛門節(jié)異常向外突起，呈黃色。

2.2 鎘脅迫對赤子愛勝蚓急性毒性效應(yīng)

赤子愛勝蚓經(jīng)不同濃度Cd2+和不同時間脅迫后，其中毒行為如圖2所示。

急性毒性試驗期內(nèi)，在0和20 mg·kg-1Cd2+濃度脅迫下，蚯蚓未出現(xiàn)斷裂或死亡，當(dāng)Cd2+濃度達40 mg·kg-1、脅迫時間達96 h時，蚯蚓開始出現(xiàn)斷裂和死亡。隨Cd2+濃度增加到80 mg·kg-1、脅迫36 h時蚯蚓便出現(xiàn)斷裂并隨即死亡；Cd2+濃度增加到120 mg·kg-1時，Cd2+對蚯蚓毒性程度增加，脅迫12 h時蚯蚓出現(xiàn)斷裂，隨后死亡；Cd2+濃度達160 mg· kg-1時，蚯蚓在受到脅迫6 h后出現(xiàn)死亡。但隨Cd2+濃度增加，蚯蚓出現(xiàn)斷裂或死亡時間延后：在Cd2+濃度達200和250 mg·kg-1時，蚯蚓均在受脅迫后12 h出現(xiàn)死亡，后者脅迫時間達24 h時蚯蚓全部死亡，而前者尚有存活蚯蚓，說明250 mg·kg-1的Cd2+對蚯蚓毒害程度較200 mg·kg-1嚴(yán)重。

圖2顯示蚯蚓逃逸現(xiàn)象，由于蚯蚓缺乏食物造成。在濾紙中開展急性毒性試驗，整個試驗過程未添加食物，隨較低濃度Cd2+脅迫時間延長，蚯蚓無法忍受Cd2+毒害作用累積，通過培養(yǎng)皿上方2 mm縫隙逃脫Cd2+脅迫環(huán)境。試驗表明，蚯蚓在急性毒性試驗期內(nèi)，隨Cd2+濃度增加，蚯蚓受毒害程度增大，但局部有小幅度降低。

毒害程度以蚯蚓生長抑制率表示。抑制率計算[28-29]：

式中，I為生長抑制率（%）；W0為試驗開始時赤子愛勝蚓體質(zhì)量（mg）；Wi為受到Cd2+脅迫i h時赤子愛勝蚓體質(zhì)量（mg）。

不同Cd2+脅迫濃度和時間下，赤子愛勝蚓生長抑制率如圖3所示?？芍┞对?20 mg·kg-1的Cd2+脅迫環(huán)境中，在受脅迫0～12 h內(nèi)，隨時間延長，蚯蚓生長抑制率逐漸增大，24 h時達蚯蚓存活狀態(tài)下最大值87.91%，說明此時Cd2+對蚯蚓毒害作用較強；此后，隨脅迫時間延長，Cd2+對蚯蚓生長抑制率急劇下降，72 h時生長抑制率為23.79%，與最初受脅迫6 h抑制率22.66%相近；說明此時蚯蚓體的自我修復(fù)以及對重金屬耐受機制啟動，在Cd2+脅迫下生長抑制程度逐漸減?。划?dāng)脅迫時間達96 h，蚯蚓死亡，說明隨蚯蚓受脅迫時間延長，體內(nèi)Cd2+的毒害累積到一定程度，自我修復(fù)機制崩潰、機體死亡。

在較低濃度（20、40和80 mg·kg-1）Cd2+脅迫試驗中隨脅迫時間延長，蚯蚓生長抑制率上下波動，但在96 h時蚯蚓生長抑制率分別為24.99%、7.64%和2.72%，逐漸接近于0。說明蚯蚓在可忍受Cd2+脅迫濃度下，機體內(nèi)重金屬“解毒”機制（包括蚯蚓自我修復(fù)和對重金屬耐受機制）保持運行狀態(tài)，并最終“解毒”。

圖2 不同Cd2+脅迫濃度和脅迫時間條件下赤子愛勝蚓中毒行為分配匯總Fig.2Distribution proportion of poisoning behavior for the Eisenia fetida with different concentrations and exposure times in Cd2+

圖3 不同Cd2+脅迫濃度和脅迫時間條件下赤子愛勝蚓生長抑制率Fig.3Inhibition rate of growth for the Eisenia fetida with different concentration and exposure time in Cd2+

在較高濃度（160、200和250 mg·kg-1）Cd2+脅迫試驗中，由于脅迫濃度過大，毒害力超過蚯蚓解毒力，隨脅迫時間延長，蚯蚓生長抑制率持續(xù)增大直至100%，即蚯蚓死亡。

2.3 鎘脅迫對赤子愛勝蚓氧化應(yīng)激反應(yīng)影響

2.3.1 短期脅迫下鎘對赤子愛勝蚓氧化應(yīng)激反應(yīng)影響

脅迫試驗結(jié)束后，將待測蚯蚓用手術(shù)刀自環(huán)帶處切開，僅留環(huán)帶后部分在冰水浴中制成10%組織勻漿液用于測定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。

如圖4所示，在整個短期脅迫試驗中，POD活性在脅迫最初1、3和5 d存在升降波動，但幅度較小。圖4B中SOD活性變化，相比POD活性其波動較大，但僅出現(xiàn)在受Cd2+脅迫第1、2和9天。相對于POD和SOD活性整個短期脅迫試驗期內(nèi)，近似平穩(wěn)波動，GST和GPX活性隨脅迫時間延長大幅波動，最后近乎為0（見圖4C和圖4D）。相似酶活性變化同樣出現(xiàn)在CAT和AChE中，不同的是CAT和AChE隨脅迫時間延長，活性最終趨近于原始值（見圖4E和圖4H）。VE濃度雖然也呈現(xiàn)相似波動，但相比前者，VE濃度恢復(fù)至原始濃度所需時間較長。MDA含量在為期10 d短期脅迫試驗中，于脅迫第1和2天急劇增加，第3天小幅回落，第4天則恢復(fù)至第2天水平，隨脅迫時間延長MDA含量呈平穩(wěn)增加趨勢。

圖4 短期脅迫下Cd2+對赤子愛勝蚓氧化應(yīng)激反應(yīng)影響Fig.4Effects of oxidative stress reaction for the Eisenia fetida earthworm with short-time exposure in Cd2+

2.3.2 長期脅迫下鎘對赤子愛勝蚓氧化應(yīng)激反應(yīng)影響

每隔10 d從不同濃度Cd2+污染的人工土壤中隨機取蚯蚓一條，截取蚯蚓環(huán)帶后部分制成組織勻漿測定與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)酶活性和物質(zhì)含量，結(jié)果如圖5所示。

在脅迫早期（脅迫處理10 d），蚯蚓體內(nèi)組織中POD、CAT、AChE活性和MDA含量與對照相比均有一定程度升高，隨脅迫時間延長至中后期（受到脅迫20、30 d時），POD活性呈先降后升趨勢，但由圖5a可知，在脅迫30 d，POD活性在不同濃度Cd2+脅迫中表現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。CAT活性和MDA含量在整個長期脅迫試驗期內(nèi)呈緩慢平穩(wěn)上升趨勢（見圖5e和圖5f）。但AChE活性則在脅迫時間延長后出現(xiàn)持續(xù)降低（見圖5h）。GST和GPX活性在長期脅迫試驗后期表現(xiàn)降低趨勢（見圖5c和圖5d），但兩者出現(xiàn)降低趨勢時間不同：GPX出現(xiàn)在脅迫后第10 d，而GST則出現(xiàn)在脅迫后第20 d。VE含量最初緩慢升高，在脅迫20 d時開始急劇上升（見圖5g）。由圖5b可知，SOD活性在整個長期脅迫試驗期內(nèi)，無明顯變化。

3 討論

為保證機體正常生理代謝，抗氧化系統(tǒng)中抗氧化酶SOD、CAT和POD在清除機體正常代謝及外因引起環(huán)境脅迫產(chǎn)生的自由基方面相互協(xié)同、促進[30-31]。Liu等研究表明，CAT和POD在對抗活性氧引起的損傷中起協(xié)同作用，證明脂質(zhì)過氧化和酶活性間存在顯著相關(guān)[32]。如抗氧化酶活性受抑制或自由基含量超過抗氧化酶系統(tǒng)清除能力上限，均會破壞機體氧化-抗氧化動態(tài)平衡，引起組織細胞氧化損傷機制-脂質(zhì)過氧化。

當(dāng)蚯蚓受Cd脅迫時，機體內(nèi)氧自由基含量升高，出現(xiàn)氧化應(yīng)激，SOD為消除氧自由基引起氧化損傷，活性升高。隨脅迫時間延長，脅迫程度增加，SOD活性下降，主要是蚯蚓體內(nèi)大量氧自由基積累對機體的毒害作用造成[33]。短期試驗組中SOD活性應(yīng)激增加是蚯蚓為克服Cd脅迫影響和防止自身中毒的防御機制中耐性反應(yīng)；當(dāng)脅迫程度隨脅迫時間延長而增大到一定值時，如短期脅迫試驗第9、10天，SOD活性降低，蚯蚓體內(nèi)防御機制受氧化損傷或重金屬毒害作用，蚯蚓表現(xiàn)機體斷裂或形成串珠狀不規(guī)則凹凸，甚至死亡，而長期脅迫試驗中，SOD、POD和CAT活性相對變化不明顯，與土壤Pb脅迫中蚯蚓體內(nèi)酶活性變化一致[28]。杜宇等研究鑭脅迫蚯蚓過程中，隨暴露時間增加，SOD和POD活性呈“低促高抑”，而CAT呈波動性變化[34]，出現(xiàn)差異可能是選取蚯蚓部位不同或所選受脅迫元素不同及蚯蚓體內(nèi)抗氧化響應(yīng)靶細胞不同造成。

MDA是膜脂過氧化過程分解產(chǎn)物，其含量反映自由基產(chǎn)生程度，預(yù)示脂質(zhì)過氧化程度，反映細胞內(nèi)活性氧自由基水平和細胞損傷程度[35-36]。蚯蚓受Cd脅迫時，體內(nèi)MDA含量在短時間內(nèi)大幅度增加，雖然在脅迫試驗過程中短暫回落，但整體水平上，短期和長期脅迫試驗均呈逐漸上升趨勢；在短期脅迫試驗中，MDA最大值出現(xiàn)在Cd2+脅迫濃度為500 mg·kg-1、受脅迫2 d時，高出對照組0.73倍；而在長期脅迫試驗中，MDA最大值出現(xiàn)在Cd2+脅迫濃度為500 mg·kg-1、受脅迫30 d時，高出對照0.63倍。說明蚯蚓體內(nèi)MDA含量對重金屬鎘脅迫具有指示作用，可反映抗氧化酶在脂質(zhì)過氧化過程的保護作用。與Cd2+脅迫家蠶和幼體赤子愛勝蚓等相關(guān)研究結(jié)果一致[37-38]。

GPX是機體內(nèi)廣泛存在的催化過氧化氫分解酶。短期脅迫試驗中，在最初受脅迫時，GST含量升高以催化GPX應(yīng)對機體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)；隨脅迫時間延長，GST和GPX活性最終降低；在長期脅迫試驗中，GST活性在保持短暫穩(wěn)定后，大幅降低至一定水平后，無顯著變化，說明重金屬脅迫對蚯蚓毒害作用累積到一定程度后，蚯蚓體內(nèi)GST和GPX解毒酶系活動無法及時解毒，與李恒舟在DEHP和DBP對蚯蚓氧化損傷研究[39]和王娟在吡蟲啉對蚯蚓抗氧化酶系影響研究[40]結(jié)果一致。

本研究中，蚯蚓體內(nèi)VE含量僅脅迫第6天時明顯增加，長期脅迫試驗中，VE含量在最初緩慢升高后脅迫20 d時急劇上升，推測隨脅迫時間進一步延長，VE含量可能隨之增加。在長期脅迫試驗中，蚯蚓其他氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)無明顯效應(yīng)關(guān)系。

在重金屬鎘脅迫下，蚯蚓體內(nèi)AChE活性雖呈一定時間-效應(yīng)關(guān)系，但相比CAT、POD和SOD等酶活性變化，效應(yīng)關(guān)系不明顯。在整個短期試驗期和長期試驗早、中期，AChE活性變化均在0.005～ 0.5U·mgprot-1。而長期脅迫時間30d時，AChE活性才出現(xiàn)明顯降低，累積降低程度達到對照2.18倍，與Calisi等[41]和Naimj等[15]研究結(jié)果有差異，一方面可能是試驗蚯蚓品種不同（Calisi等所選蚯蚓為Lumbricus terrestri；Naimj等選取Eisenia andrei），另一方面則可能是本研究所選試驗材料——蚯蚓環(huán)帶后部分主要是蚯蚓消化腸道，而富含乙酰膽堿酯酶的中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在于蚯蚓環(huán)帶前部分，包括位于第3體節(jié)背側(cè)一對咽上神經(jīng)節(jié)（腦）及位于第3和第4體節(jié)間腹側(cè)咽下神經(jīng)節(jié)。史志明[17]和Fernandez等[18]研究均證明外來污染物在蚯蚓體內(nèi)分布的異質(zhì)性。

本研究監(jiān)測短期脅迫試驗第10天和長期脅迫試驗第10天蚯蚓氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量存在差異，推測可能是試驗取樣時間間隔不同，兩組試驗蚯蚓受重金屬脅迫同時，其外界干擾頻度不同造成；或是短期試驗組第10天容器中蚯蚓密度小于長期試驗組，暴露在Cd2+脅迫中蚯蚓體表面積不同，兩組試驗出現(xiàn)差異。

4 結(jié)論

急性毒性試驗期內(nèi)，在0和20 mg·kg-1Cd2+濃度脅迫下，蚯蚓未出現(xiàn)斷裂或死亡，當(dāng)Cd2+濃度達40 mg·kg-1、脅迫時間達96 h時，蚯蚓開始出現(xiàn)斷裂和死亡。Cd2+濃度達160 mg·kg-1時，蚯蚓在受脅迫6 h后出現(xiàn)死亡。

短期脅迫試驗（脅迫時間在10 d以內(nèi)）表明，蚯蚓環(huán)帶后組織中，可靈敏有效指示其受重金屬鎘脅迫毒性指標(biāo)有：CAT、SOD和POD。MDA可作為初期和中期指標(biāo)，而VE則只作為中期脅迫指標(biāo)。

長期脅迫試驗（脅迫時間在30 d以內(nèi)）表明，蚯蚓體內(nèi)GPX和MDA可作為指示指標(biāo)。蚯蚓環(huán)帶后組織中AChE僅適合長期(脅迫30 d以上時）重金屬脅迫引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

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Effect of oxidative stress reaction forEisenia fetidawith exposure in Cd

ZHOU Dongxing,WANG Xiao,NING Yucui,LI Jing,WU Xinhui,WANG Guangdong(School of Resources and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Earthworms are widely used in all kinds of pollutants as sensitive bio-indicator organisms because of their immediately oxidative stress response under the stress of heavy metal. However,there are a large number of indices associated with the oxidative stress response.Finding out the key monitoring indices in the stress process becomes a practical demand of the pollution monitoring and warning process.The paper studied two groups,the short-term test and the long-term test.The former one lasted 10 d,taking out an earthworm everyday.The latter test lasted 30 d,taking out an earthworm every 10 d.The Cd2+concentration was set at 50,100,125,250 and 500 mg·kg-1.Postclitellum segments of earthworms were chosen to determine SOD,POD,GPX,GST,CAT,VE,MDA and AChE.The results showed that the main bio-indicators associating with oxidative stress reaction in short-term group were:CAT,SOD and POD.While with the long-term test,the main bio-indicators associated with oxidative stress reaction were GPX and MDA.

Cd exposure;earthworm;oxidative stress reaction

X 826；Q958.116

A

1005-9369（2017）02-0059-10

2016-10-24

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503116-04）

周東興（1972-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為廢棄物處理和生態(tài)工程。E-mail:zhboshi@163.com

時間2017-3-7 16:16:05[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170307.1616.016.html

周東興,王曉,寧玉翠,等.鎘脅迫對赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）氧化應(yīng)激反應(yīng)影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(2):59-68.

Zhou Dongxing,Wang Xiao,Ning Yucui,et al.Effect of oxidative stress reaction forEisenia fetidawith exposure in Cd[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(2):59-68.(in Chinese with English abstract)