石洪玥，張菡，孫學亮，王慶奎，陳成勛，郭永軍，邢克智

（天津農(nóng)學院水產(chǎn)科學系，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

兩種致病菌對雜交東方鲀非特異性免疫和抗氧化指標影響

石洪玥，張菡，孫學亮，王慶奎，陳成勛，郭永軍，邢克智*

（天津農(nóng)學院水產(chǎn)科學系，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

為研究遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌感染對雜交東方鲀“冀研一號”（菊黃東方鲀♀×紅鰭東方鲀♂）非特異性免疫和抗氧化指標影響，分別對雜交東方鲀腹腔注射PBS、遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌，注射后6、12、18、24和36h分別取肝胰臟，測定其谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷草轉氨酶（GOT）、谷丙轉氨酶（GPT）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活力。結果表明，在攻毒后36 h內(nèi)，注射遲鈍愛德華氏菌“冀研一號”東方鲀肝胰臟總超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活均極顯著升高（P<0.01）；攻毒后36 h內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽均表現(xiàn)升高趨勢。感染哈氏弧菌后，肝胰臟中谷胱甘肽過氧化物酶、總超氧化物歧化酶活力均高于對照組；谷胱甘肽含量表現(xiàn)升高趨勢。試驗魚體感染致病菌后，引起肝胰臟非特異性免疫和抗氧化指標變化。

雜交東方鲀；遲鈍愛德華氏菌；哈氏弧菌；非特異性免疫；抗氧化

雜交東方鲀“冀研一號”為紅鰭東方鲀♂（Takifugu rubripes）和菊黃東方鲀♀（Takifugu flavidus） 雜交子一代，形態(tài)特征與紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀差異明顯[1]。紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀均屬硬骨魚綱（Osteichthyes），鲀形目（Tetrodontiformes），鲀亞目（Tetrodontoidei），鲀科（Tetrodontidae），東方鲀屬（Takifugu）[2]。其主要分布于西北太平洋沿海區(qū)域和我國東海、渤海和黃海等海域[3]。雜交鲀“冀研一號”具有生長速度快、抗逆性強、蛋白質豐富、易養(yǎng)殖等特點，已在河北、山東等地區(qū)廣泛養(yǎng)殖。研究表明，冀研一號東方鲀對低水溫、鐵錳等重金屬離子、鹽度波動均有良好抗逆性[4-6]。

病原微生物侵入魚體會引發(fā)感染，誘導機體產(chǎn)生防御性應答[7]，遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌是引起海水魚類疾病主要致病菌，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大損失。兩種病菌感染海水主要經(jīng)濟魚類已有報道[8-10]，但目前未見冀研一號東方鲀感染報道。

本研究對冀研一號東方鲀腹腔分別注射遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌，人工感染后分析肝胰臟中7種免疫相關酶變化，了解病原菌感染冀研一號河鲀免疫防御機制，為河鲀免疫增強劑篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗用魚為“冀研一號”東方鲀，魚體長（5.2± 0.4）cm，體重（10.2±1.3）g，健康狀況良好、體表完整，由天津市海升公司提供，實驗室暫養(yǎng)2周后試驗。試驗在容積約240 L聚乙烯水箱中進行，養(yǎng)殖水為鹵水，水溫（23±1）℃、鹽度（12±1）、溶解氧（5.9±0.6）mg·L-1、pH 7.9±0.7。每日8:00和16:00喂食。

1.2 試驗用菌及活化

將實驗室保存遲鈍愛德華菌和哈氏弧菌，分別用已滅菌接種環(huán)蘸取少量原菌液于液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床中培養(yǎng)24 h后，吸取少量培養(yǎng)后菌液于固體培養(yǎng)基中，倒置培養(yǎng)24 h，PBS緩沖液沖洗細菌，放置顯微鏡下計數(shù)，將菌液稀釋到1×106cfu·mL-1，4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑與儀器

0.8%生理鹽水；0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS）：pH 7. 2；試劑盒均由南京建成生物研究所提供；離心機：上海安亭科學儀器廠制造，型號AnkeTDL-40B；三用恒溫水箱：上海精密實驗設備有限公司，DK-600S型；紫外可見分光光度計：日本島津公司；冷凍干燥機：上海愛郎儀器有限公司，型號EYEL4 FDV- 1200；半痕量電子分析天平：天津華北實驗儀器有限公司，XS-205型；磁力攪拌器：天津市華北試驗儀器有限公司，型號Hg-4A。

1.4 試驗設計

試驗魚隨機分3組，對照組、遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌組，分別腹腔注射25 μL無菌PBS，遲鈍愛德華氏菌菌液和哈氏弧菌菌液（濃度為1×106cfu·mL-1），每組3個平行，每個平行40尾魚。注射前停食24 h，取樣時間點為注射后6、12、18、24、36 h，每個時間點每組三個平行分別隨機解剖4尾魚。

1.5 粗酶液制備及酶活性測定

將樣本魚在冰盤上解剖，取肝胰臟除去表面附著結締組織，4℃預冷去離子水沖洗干凈，濾紙吸去表面水分，稱取適量樣品，加入4℃預冷生理鹽水，冰浴條件下，使用勻漿器勻漿，制成10%粗酶液備用，經(jīng)4 000 r·min-1，4℃低溫離心10 min取上清液備用。酶活力測定采用試劑盒法，均購自南京建成生物工程研究所。

1.5.1 谷胱甘肽（GSH）

GSH測定用還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（分光光度法），在412 nm處測定吸光度變化，按GSH標準曲線計算組織中GSH含量。單位（mg GSH·gprot-1）。

1.5.2 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）

GSH-PX活性用GSH-PX試劑盒（DTNB法）測定?；钚詥挝欢x：在37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘扣除非酶反應作用，使反應體系中GSH降低1 μmol·L-1為1個酶活力單位[U·（mg·min）-1]。

1.5.3 總超氧化物歧化酶（T-SOD）

SOD活性用SOD試劑盒(黃嘌呤氧化酶法)測定，活性單位定義：在37℃條件下，每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時對應SOD量為1個SOD活力單位（U·mgprot-1）。

1.5.4 谷草轉氨酶（GOT）和谷丙轉氨酶（GPT）

GOT和GPT活性用GOT試劑盒和GPT試劑盒測定，卡門氏單位定義：1 mL血清，反應液總容量3 mL，340 nm波長，1 cm光徑，25℃，1 min內(nèi)生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD而引起吸光度每下降0.001為一個卡門氏單位。

1.5.5 酸性磷酸酶（ACP）

ACP活性用ACP試劑盒（分光光度法）測定，活性單位定義：每克組織蛋白在37℃與基質作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位（U·gprot-1）。

1.5.6 堿性磷酸酶（AKP）

AKP活性用AKP試劑盒（可見光比色法）測定，活性單位定義：每克組織蛋白在37℃與基質作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為一個金氏單位（金氏單位·gprot-1）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

圖1 腹腔注射菌液對冀研一號東方鲀肝胰臟谷胱甘肽影響Fig.1Effect of intraperitoneal injection of bacteria on GSH of Jiyan-1 in hepatopancreas

酶活性試驗數(shù)據(jù)以Mean±SE表示，SPSS 17.0軟件處理，對感染組和對照組作t檢驗分析，感染組內(nèi)各時間點作單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05為差異顯著，用*表示，P<0.01為差異極顯著，用**表示。兩種菌組內(nèi)比較分別以大寫字母和小寫字母區(qū)分。Excel作圖形處理以及方程計算。

2 結果與分析

2.1 谷胱甘肽（GSH）

由圖1可知，感染遲鈍愛德華氏菌，攻毒6、12和18 h谷胱甘肽含量均低于對照組且差異極顯著（P<0.01）；攻毒24和36 h谷胱甘肽含量均高于對照組且差異顯著（P<0.05），除36 h各時間點內(nèi)差異不顯著。感染哈氏弧菌，攻毒12和18 h谷胱甘肽含量低于對照組且差異極顯著（P<0.01），攻毒24 h谷胱甘肽含量高于對照且差異顯著（P<0.05），攻毒6和36 h與對照組差異不顯著。

2.2 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）

由圖2可知，感染遲鈍愛德華氏菌18 h谷胱甘肽過氧化物酶酶活均低于對照組，其中攻毒12 h與對照差異極顯著（P<0.01），各時間點內(nèi)差異不顯著；攻毒24和36 h谷胱甘肽含量均高于對照組且差異顯著（P<0.05），各時間點內(nèi)差異顯著。感染哈氏弧菌，谷胱甘肽過氧化物酶酶活均高于對照組且差異極顯著（P<0.01）。

2.3 總超氧化物歧化酶（T-SOD）

由圖3可知，感染遲鈍愛德華氏菌，總超氧化物歧化酶酶活均高于對照組且差異顯著（P<0.05），6 h酶活顯著低于（P<0.05）其他時間點。感染哈氏弧菌，在攻毒6、18和36 h總超氧化物歧化酶酶活高于對照且差異極顯著（P<0.01），各時間點酶活差異顯著（P<0.05）。

2.4 谷草轉氨酶（GOT）

由圖4可知，感染遲鈍愛德華氏菌，谷草轉氨酶活力在36 h內(nèi)與對照組差異不顯著，且各時間點間差異不顯著。感染哈氏弧菌，谷草轉氨酶酶活在攻毒6 h顯著高于對照組（P<0.05），且與12、24和36 h差異顯著（P<0.05），與攻毒18 h差異不顯著。可見兩種病原菌對肝臟谷草轉氨酶酶活影響不明顯。

2.5 谷丙轉氨酶（GPT）

由圖5可知，感染遲鈍愛德華，谷丙轉氨酶活性均顯著低于對照組（P<0.05）。感染哈氏弧菌，谷草轉氨酶活性在攻毒后均低于對照組，且12、24 h與對照組差異極顯著（P<0.01），其中24 h活性最低，與其他各時間點差異顯著（P<0.05）。

2.6 堿性磷酸酶（AKP）

由圖6可知，感染遲鈍愛德華氏菌，除攻毒18 h各個時間點堿性磷酸酶活性均顯著高于對照組（P<0.05）。感染哈氏弧菌，除攻毒36 h各個時間點堿性磷酸酶活力均極顯著高于對照組（P<0.01），且24 h活性最高，與其他各時點差異顯著（P<0.05）。

圖2 腹腔注射菌液對冀研一號東方鲀肝胰臟谷胱甘肽過氧化物酶影響Fig.2Effect of intraperitoneal injection of bacteria on GSH-PX of Jiyan-1 in hepatopancreas

圖3 腹腔注射菌液對冀研一號東方鲀肝胰臟總超氧化物歧化酶影響Fig.3Effect of intraperitoneal injection of bacteria on T-SOD of Jiyan-1 in hepatopancreas

圖4 腹腔注射菌液對冀研一號東方鲀肝胰臟谷草轉氨酶影響Fig.4Effect of intraperitoneal injection of bacteria on GOT of Jiyan-1 in hepatopancreas

圖5 腹腔注射菌液對冀研一號東方鲀肝胰臟谷丙轉氨酶影響Fig.5Effect of intraperitoneal injection of bacteria on GPT of Jiyan-1 in hepatopancreas

圖6 腹腔注射菌液對冀研一號東方鲀肝胰臟堿性磷酸酶影響Fig.6Effect of intraperitoneal injection of bacteria on AKP of Jiyan-1 in hepatopancreas

2.7 酸性磷酸酶（ACP）

圖7 腹腔注射菌液對冀研一號東方鲀肝胰臟酸性磷酸酶影響Fig.7Effect of intraperitoneal injection of bacteria on ACP of Jiyan-1 in hepatopancreas

由圖7可知，感染遲鈍愛德華氏菌，酸性磷酸酶活力均極顯著高于對照組（P<0.01），且各時間點內(nèi)差異不顯著。感染哈氏弧菌，酸性磷酸酶活力均顯著高于對照組（P<0.05），且各時間點內(nèi)差異不顯著。

3 討論

環(huán)境脅迫致使魚體肝胰臟相應指標發(fā)生變化，致病菌感染屬環(huán)境急性脅迫之一。本試驗通過腹腔分別注射遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌，檢測兩種致病菌對“冀研一號”東方鲀生理生化及抗氧化指標影響，發(fā)現(xiàn)遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌感染對魚體肝胰臟非特異性免疫及抗氧化指標均有顯著影響。

3.1 谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性變化

GSH-PX可特異地催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，保護細胞膜結構和功能[11]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的非蛋白質低分子質量硫醇，有助于保持細胞完整性，具有解毒作用。其生物學功能免疫特性表現(xiàn)為細胞內(nèi)GSH含量增加，T淋巴細胞分裂增殖反應隨之升高；GSH水平降低，脾臟淋巴細胞DNA合成受阻[12]。因此，GSH-PX和GSH已成為衡量機體抗氧化能力重要指標。本試驗結果表明冀研一號東方鲀受遲鈍愛德華氏菌感染后，魚體肝胰臟在攻毒后36 h內(nèi)GSH-PX和GSH均表現(xiàn)升高趨勢，并在攻毒后24 h與對照組差異顯著（P<0.05）。說明脅迫初期機體抗氧化能力驟減，隨適應時間延長，機體抗氧化能力逐步恢復。感染哈氏弧菌后，魚體肝胰臟中GSH-PX活力均高于對照組且差異顯著（P<0.05），GSH含量在攻毒后12和18 h時顯著低于對照組（P<0.05），說明哈氏弧菌對兩者作用顯著但方式不同。由此可知，機體應對不同致病菌調節(jié)機制不同。

3.2 總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性變化

超氧化物歧化酶（SOD）是具有抗氧化防御性功能酶，抗氧化水平主要表現(xiàn)為清除超氧陰離子自由基，預防過氧化物（ROS）對機體損害[13]。SOD活性對生物免疫水平表現(xiàn)為SOD含量高，魚體免疫功能強，吞噬細胞防御力強[14]。在輕微脅迫下SOD活性升高，脅迫嚴重時SOD活性降低，過量活性氧致機體損[15-17]。葛明峰等用3種致病弧菌感染大黃魚試驗表明，各試驗組血清中SOD酶活性在感染后1～2 d內(nèi)下降，此時機體內(nèi)自由基等毒害物質積累，細胞可能受損傷[18]。王淑紅等以弧菌感染雜色鮑結果顯示SOD活力受抑制，認為SOD活力降低代表機體免疫提升反應[19]。本試驗得到類似結果，冀研一號東方鲀分別受遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌感染后，魚體肝胰臟在攻毒后36 h內(nèi)指標均顯著高于對照組（P<0.05）。這可能是由于在脅迫初期，魚體在細菌感染下機體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，SOD酶活性被激發(fā)增強以清除過量自由基，在整個感染時間內(nèi)一直處于自身調節(jié)中，抵抗外來細菌侵入。

3.3 谷丙轉氨酶（GPT）和谷草轉氨酶（GOT）活性變化

谷丙轉氨酶（GPT）和谷草轉氨酶（GOT）是生物體內(nèi)重要氨基酸轉氨酶，在蛋白質代謝中起重要作用[20-21]。其在魚體肝胰臟內(nèi)含量最豐富，活性變化反映肝細胞是否處于正常狀態(tài)。當魚體肝胰臟遭受嚴重脅迫時，兩種酶活性降低，說明肝功能下降[22]。本試驗結果表明“冀研一號”東方鲀分別受遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌感染后，魚體內(nèi)在36 h內(nèi)大致處于抵抗狀態(tài)，GPT和GOT活性變化規(guī)律不明顯，代表此時魚體肝胰臟功能正常。受遲鈍愛德華氏菌感染，攻毒后36 h內(nèi)GPT酶活均顯著低于對照組（P<0.05），可能是因為谷氨酸和丙氨酸轉氨受抑制，細胞膜通透性變大，GPT滲入血液。受哈氏弧菌感染，攻毒后6 h GOT酶活顯著高于對照組（P<0.05），與趙杰等研究一致[23]，可能是由于谷氨酸和草酰乙酸轉氨增強，氨基酸氧化代謝強度增大。

3.4 堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性變化

堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）是生物體內(nèi)磷酸單酯水解酶，具有防御和免疫調節(jié)等生理作用。由于AKP是溶酶體酶重要組成部分，參與磷酸基團轉移，在機體磷鈣代謝起重要作用，并參與生長活動。酸性磷酸酶消化降解溶酶體內(nèi)類似細菌等異物，同樣參與磷酸酯代謝，其活性變化反映免疫系統(tǒng)相關情況。因此其酶活水平可作為衡量水產(chǎn)動物免疫能力指標。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）為水產(chǎn)動物在環(huán)境脅迫下反映非特異性免疫功能指標[24-26]。本試驗結果表明“冀研一號”東方鲀分別受遲鈍愛德華氏菌和哈氏弧菌感染后，魚體肝胰臟在感染后36 h內(nèi)AKP和ACP酶活均升高并與對照組差異極顯著（P<0.01）。產(chǎn)生此現(xiàn)象原因可能是該菌液刺激水解酶釋放，產(chǎn)生免疫防御機制。這與段亞飛等[27]在副溶血弧菌對斑節(jié)對蝦和江曉路等[28]在褐藻寡糖對刺參相關免疫酶活性變化研究中結果一致。

4 結論

在本試驗中，無論哪種致病菌感染魚體，均會引起肝胰臟非特異性免疫和抗氧化指標變化。TSOD、GSH-Px和GSH之間關系處于動態(tài)平衡，其復雜作用機理有待進一步研究。

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Effect of nonspecific immune response and anti-oxidation of hybrid Puffer infected by two pathogens

To study the effect ofEdwardsiella tardaandVibrio harveyichallenge on the nonspecific immune function and anti-oxidation of hybrid Puffer,intraperitoneal injection PBS,Edwardsiella tarda andVibrio harveyi,respectively.The hepatopancreas were taken at the 6,12,18,24 and 36 h after infection and the activities of GSH,GSH-PX,T-SOD,GOT,GPT,ACP,AKP enzymes were measured to study the variation of enzyme activities.The results showed that during the 36 h,the value of T-SOD, AKP,ACP increased(P<0.01)in hepatopancreas,the value of GSH-PX and GSH increased in the same.After injection withVibrioharveyi,the value of GSH-PX,T-SOD were higher than the control and GSH was increased in hepatopancreas.In this experiment,no matter what kind of fish pathogen infection,will cause changes of nonspecific immunity and antioxidant indices in the hepatopancreas.

hybrid Puffer;Edwardsiella tarda;Vibrio;non-specific immunity;antioxidant

S917.1

A

1005-9369（2017）02-0089-07SHI Hongyue,ZHANG Han,SUN Xueliang,WANG Qingkui,CHEN Chengxun,GUO Yongjun,XING Kezhi(School of Fisheries,Tianjin Agricultural University,Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture,Tianjin 300384,China)

2016-10-24

天津市科技支撐計劃重大項目（12ZCDZNC05900）；天津市高等學校創(chuàng)新團隊基金項目（TD12-5018）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點項目（13JCZDJC29200）

石洪玥（1986-），女，實驗師，碩士，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail:youyan_shy@126.com

*通訊作者：邢克智，教授，研究方向為水域環(huán)境生態(tài)學。E-mail:kzxing6668@126.com

時間2017-3-7 16:18:56[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170307.1618.022.html

石洪玥,張菡,孫學亮,等.兩種致病菌對雜交東方鲀非特異性免疫和抗氧化指標影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(2):83-89. Shi Hongyue,Zhang Han,Sun Xueliang,et al.Effect of nonspecific immune response and anti-oxidation of hybrid Puffer infected by two pathogens[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(2):83-89.(in Chinese with English abstract)