袁敏，王莉，葛偉娜，張嵐，郭棣

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心，河北唐山 063000）

擬南芥CPK11對開花調(diào)控因子FD的磷酸化作用

袁敏，王莉，葛偉娜，張嵐，郭棣

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心，河北唐山 063000）

CPKs是植物中一類重要絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種植物生物學(xué)反應(yīng)。利用原核表達(dá)技術(shù)純化制得質(zhì)量較高His6-CPK11融合蛋白；Western blot免疫印跡技術(shù)分析表明純化His6-CPK11蛋白可被anti-His單克隆抗體特異識別；體外激酶試驗(yàn)證實(shí)His6-CPK11可磷酸化開花途徑轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白，可為CPKs家族成員參與FD蛋白磷酸化修飾提供支持。

CPK 11；FD；磷酸化；開花

生物體細(xì)胞常通過蛋白質(zhì)翻譯后修飾傳遞遺傳信息。蛋白質(zhì)可逆磷酸化修飾，有效、高速、精準(zhǔn)地參與生物學(xué)過程。蛋白質(zhì)磷酸化作用由蛋白激酶催化。植物體內(nèi)蛋白激酶數(shù)量多，廣泛參與植物細(xì)胞分裂和伸長、多種激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆境脅迫反應(yīng)、光合作用及植物葉片衰老等重要生理活動。鈣依賴鈣調(diào)素不依賴蛋白激酶（Calmodulinindependent and calcium-dependent protein kinase，CPKs）是植物中一類重要絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，參與植物細(xì)胞Ca2+信號傳遞，在植物生物/非生物脅迫、生長發(fā)育以及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種途徑發(fā)揮重要作用[1-4]。

目前已在植物基因組發(fā)現(xiàn)不同類型CPKs，且均具有典型保守結(jié)構(gòu)域，包括催化區(qū)、可變區(qū)、調(diào)節(jié)區(qū)和連接區(qū)。CPKs核心功能區(qū)域即催化區(qū)，也稱蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列非常保守，通常由300個(gè)氨基酸組成?？勺儏^(qū)氨基酸序列保守性較差，不同植物種屬間可變區(qū)變異范圍可達(dá)20～200個(gè)氨基酸。連接區(qū)一般包含20～30個(gè)氨基酸，氨基酸序列保守性較高，且堿性氨基酸含量高，正常狀態(tài)下可與激酶域結(jié)合抑制激酶活性，因此也稱自抑區(qū)。Ca2+信號刺激可改變CPKs激酶構(gòu)型，分離激酶域與連接區(qū)，激活激酶活性。調(diào)節(jié)區(qū)具有可與Ca2+結(jié)合EF手型結(jié)構(gòu)，與鈣調(diào)素CaM結(jié)構(gòu)域類似。EF手型結(jié)構(gòu)使CPKs可直接與Ca2+信號分子結(jié)合調(diào)節(jié)自身激酶活性，無需依賴CaM[5-6]。

植物CPKs功能方面研究日益受到關(guān)注。一方面，CPKs調(diào)控植株生長發(fā)育。水稻中兩個(gè)CPKs家族成員基因OsCDPK2和OsCDPK11參與調(diào)節(jié)水稻種子發(fā)育[7-8]。其次，CPKs也參與植株對外界逆境脅迫響應(yīng)。小麥CPKs基因?qū)洹Ⅺ}、干旱等多種逆境脅迫刺激均有應(yīng)答[9]。水稻中，高溫和干旱可誘導(dǎo)OsCPK6和OsCPK25表達(dá)量上升，而低溫、干旱和鹽可誘導(dǎo)OsCPK17表達(dá)量下降[10]。另外，CPKs還參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。植株體內(nèi)激素代謝變化可引發(fā)胞質(zhì)Ca2+濃度變化，激活作為鈣信號受體CPKs，將激素信號向下傳遞。擬南芥干旱條件下，AtCPK10參與Ca2+信號對植物激素ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氣孔調(diào)節(jié)，提高植株對抗鹽及干旱脅迫能力[11]。Kawamoto等研究結(jié)果表明擬南芥CPKs家族成員AtCPK33可磷酸化開花調(diào)控途徑bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員FD，AtCPK33功能缺失導(dǎo)致植株呈現(xiàn)明顯晚花表型[12]。

植物開花過程受多因素調(diào)控[13-14]。在植物頂端分生組織處，成花素蛋白FT與轉(zhuǎn)錄因子FD及14-3-3蛋白形成成花素激活復(fù)合體（Florigen activation complex，F(xiàn)AC），且只有FD被磷酸化后才可參與形成此復(fù)合體[15-17]。Kawamoto等研究指出FD蛋白磷酸化由蛋白激酶CPK6和CPK33催化，而CPK11不可磷酸化FD[12]。但篩選FD互作蛋白試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CPK11與FD間存在互作。為明確CPK11是否可以磷酸化FD，本研究擬采用原核表達(dá)技術(shù)純化His6-CPK11融合蛋白，再利用體外激酶試驗(yàn)檢測His6-CPK11是否可磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FD。研究結(jié)果將為CPKs參與開花調(diào)控因子FD磷酸化修飾提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料野生型擬南芥Col-0購于美國ABRC Stock；PET-28a載體由華北理工大學(xué)基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心保存；DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、各種酶類購自北京全式金公司；anti-pThr多克隆抗體、anti-His單克隆抗體和His鎳柱購自美國Sigma公司；Western blot化學(xué)發(fā)光底物購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 His6-CPK11表達(dá)載體構(gòu)建

以cDNA為模板，使用帶有合適酶切位點(diǎn)CPK11基因上下游引物PCR擴(kuò)增獲得基因全長。通過NdeⅠ和NotⅠ酶切將CPK11基因擴(kuò)增片段連入PET-28a載體，獲得His6-CPK11表達(dá)載體。所用引物為：

1.2.2 GST-FD蛋白純化

轉(zhuǎn)化GST-FD表達(dá)載體大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，離心棄上清，菌體沉淀用樣品緩沖液重懸。超聲破碎后，4℃，13 000 r·min-1離心15 min后取上清液與GST純化基質(zhì)混合，加入Triton-X100至終濃度為0.2%，90r·min-1，4℃低溫混勻1～2h。低速離心，棄上清，將純化基質(zhì)用含有0.2%Triton-X100樣品緩沖液洗滌3次以去除與基質(zhì)非特異結(jié)合雜蛋白。GST標(biāo)簽蛋白洗脫緩沖液與基質(zhì)充分混勻孵育5～10 min后離心收集目的蛋白，可重復(fù)洗脫數(shù)次以最大程度收集蛋白。所用樣品緩沖液為Tri-HCl 50 mmol·L-1（pH 8.0），NaCl 150 mmol·L-1；蛋白洗脫緩沖液為Tris-HCl 50 mmol·L-1（pH 8.0）、還原型谷胱甘肽10 mmol·L-1。

1.2.3 His6-CPK11蛋白純化

利用0.5 mmol·L-1IPTG室溫過夜誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化His6-CPK11表達(dá)載體大腸桿菌BL21，離心收集菌體。加入磷酸酶和蛋白酶抑制劑樣品緩沖液重懸菌體。超聲破碎后，4℃，13 000 r·min-1離心15 min，收集上清液。吸取500 μL鎳柱基質(zhì)于50 mL離心管中，預(yù)冷樣品緩沖液充分洗滌2～3次以平衡純化基質(zhì)。將His純化基質(zhì)與超聲破碎菌液混合，100～200 r·min-1，低溫混勻2～3 h。500～1 000 r· min-1離心，棄上清。將結(jié)合蛋白后純化基質(zhì)用含有0.2%Triton-X100樣品緩沖液洗滌3次，除去非特異結(jié)合雜蛋白。洗滌離心時(shí)離心力≤2 000 g，以免損壞純化基質(zhì)。蛋白洗脫緩沖液洗脫His6-CPK11蛋白，孵育10 min后離心收集洗脫液，可重復(fù)洗脫多次。收集洗脫液利用截留分子質(zhì)量10 ku以上蛋白質(zhì)濃縮管離心，濃縮收集蛋白。樣品緩沖液為Tris-HCl 50 mmol·L-1（pH 7.4），NaCl 150 mmol·L-1，咪唑60 mmol·L-1；蛋白洗脫液為Tris-HCl 50 mmol·L-1（pH7.4），咪唑500mmol·L-1。

1.2.4 蛋白質(zhì)透析和蛋白質(zhì)純度檢測

蛋白質(zhì)溶液中咪唑或谷胱甘肽可能對后續(xù)激酶試驗(yàn)造成影響，透析方法去除。將收集蛋白洗脫液裝入透析袋后放入裝有透析液燒杯中，低溫緩慢攪拌，更換透析液數(shù)次，直到蛋白質(zhì)溶液中咪唑或谷胱甘肽濃度低至1 pmol·L-1，所用透析液為50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4或pH 8.0）、1 mmol·L-1DTT。透析后收集蛋白，測定蛋白濃度。取適量蛋白，加入2×SDS上樣緩沖液，沸水中煮樣3～5 min，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清作SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，檢測蛋白質(zhì)純化情況。

1.2.5 Western blot免疫印跡鑒定純化蛋白

為確定所得蛋白是否為CPK11，利用免疫印跡技術(shù)Western blot結(jié)合anti-His單克隆抗體作檢測。將待測樣品與對照蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，1 ? 2 000孵育anti-His單克隆抗體。洗膜3次去除非特異結(jié)合一抗，孵育HRP標(biāo)記二抗1 h。再洗膜3次，利用化學(xué)發(fā)光法檢測Western blot免疫印跡條帶。

1.2.6 體外激酶試驗(yàn)

將1 μg蛋白激酶His6-CPK11與0.5 μg底物GST-FD在激酶反應(yīng)液中室溫孵育30 min。然后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，1 ? 2 000孵育antipThr多克隆抗體過夜。洗膜3次去除非特異結(jié)合一抗，孵育HRP標(biāo)記二抗1 h。再洗膜3次，利用化學(xué)發(fā)光法檢測Westernblot免疫印跡條帶。通過分析與His6-CPK11共同孵育后GST-FD是否可被antipThr多克隆抗體識別判斷GST-FD是否被激酶His6-CPK11磷酸化。所用激酶反應(yīng)液為50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.4，1 mmol·L-1MgCl2和10 μmol· L-1ATP。

2 結(jié)果與分析

2.1 His6-CPK11表達(dá)載體構(gòu)建

以cDNA為模板，使用CPK11基因特異性引物PCR擴(kuò)增獲得基因全長。利用酶切連接獲得His6-CPK11表達(dá)載體（見圖1）。

2.2 GST-FD蛋白純化

將轉(zhuǎn)化GST-FD表達(dá)載體BL21（DE3）大腸桿菌菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體，超聲破碎后離心，取上清液純化。純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色分析，得到純度比較高GST-FD融合蛋白，約60 ku，分子質(zhì)量數(shù)值正確，與預(yù)期一致，箭頭所示為純化獲得GST-FD融合蛋白，上方較弱條帶為與純化基質(zhì)非特異結(jié)合蛋白質(zhì)（見圖2）。

2.3 His6-CPK11蛋白純化

純化His6-CPK11蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測，得到His6-CPK11融合蛋白純度和質(zhì)量均較高，約50 ku，分子質(zhì)量大小正確。箭頭所示為純化獲得His6-CPK11融合蛋白，其余較弱條帶為蛋白降解條帶或與純化基質(zhì)非特異結(jié)合蛋白質(zhì)（見圖3）。

2.4 His6-CPK11融合蛋白可被Anti-His單克隆抗體特異識別

分析獲得His6-CPK11蛋白能否被anti-His抗體特異識別，判斷其是否為正確融合CPK11蛋白。Western blot免疫印跡技術(shù)結(jié)合anti-His單克隆抗體檢測結(jié)果表明，anti-His單克隆抗體不可識別陰性對照GST-FD，但可特異識別His6-CPK11融合蛋白（見圖4），上方箭頭所示為GST-FD蛋白，下方箭頭所示為His6-CPK11蛋白。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本研究獲得His6-CPK11蛋白是正確融合蛋白，為下一步激酶試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

2.5 His6-CPK11融合蛋白可磷酸化GST-FD蛋白

anti-pThr可特異識別蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)被磷酸化蛋白，不可識別未被磷酸化蛋白。體外激酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)GST-FD（泳道1）或單獨(dú)His6-CPK11（泳道2）均不可被anti-pThr抗體識別。而與His6-CPK11共同孵育后GST-FD可被anti-pThr抗體識別（泳道3）。通常，蛋白質(zhì)被磷酸化后電泳遷移速率變慢，試驗(yàn)結(jié)果顯示GST-FD被磷酸化后電泳遷移變慢，故圖5中，+所示為未被磷酸化或部分位點(diǎn)被磷酸化GST-FD蛋白，++所示為完全被磷酸化GST-FD蛋白。結(jié)果證實(shí)GST-FD可被His6-CPK11磷酸化。

圖1 CPK11表達(dá)載體構(gòu)建Fig.1Construction of expression vector of CPK11

圖2 GST-FD融合蛋白純化Fig.2Purification of GST-FD recombinant protein

圖3 His6-CPK11融合蛋白純化Fig.3Purification of His6-CPK11 recombinant protein

圖4 His抗體特異性檢測結(jié)果Fig.4Detection result by His antibody

圖5 體外激酶試驗(yàn)結(jié)果Fig.5Result of in vitro kinase assay

3 討論與結(jié)論

鈣依賴鈣調(diào)素不依賴蛋白激酶，是目前植物中研究較多的蛋白激酶，參與調(diào)控植物生物脅迫、非生物環(huán)境脅迫以及生長發(fā)育等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。目前，植物中CPKs基因被克隆，但其功能尚不清楚。

高等植物開花受眾多因素控制，在植物中受光周期途徑、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑協(xié)同控制。不同開花途徑交匯節(jié)點(diǎn)處對植物開花調(diào)控起關(guān)鍵作用是FT蛋白，也稱為成花素。成花素蛋白FT最終在植物頂端分生組織與轉(zhuǎn)錄因子FD及14-3-3蛋白共同組成成花素激活復(fù)合體，啟動植物開花。在成花素激活復(fù)合體中，F(xiàn)T與磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)錄因子FD結(jié)合，F(xiàn)D突變導(dǎo)致去磷酸化狀態(tài)FD無法與FT結(jié)合[16-18]。因此FD磷酸化對植物開花調(diào)控至關(guān)重要，確定磷酸化FD蛋白激酶對解析植物開花調(diào)控機(jī)制將具有重要意義。

CPKs作為一類重要蛋白激酶，在蛋白質(zhì)磷酸化修飾方面發(fā)揮重要作用。Kawamoto等指出CPKs家族中CPK6和CPK33磷酸化開花途徑中轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白[12]。高安禮等研究指出CPK11通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ABF參與植物激素ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。本研究利用原核表達(dá)技術(shù)純化制得質(zhì)量較高His6-CPK11融合蛋白，通過Western blot免疫印跡技術(shù)，確定獲得蛋白可被anti-His單克隆抗體特異識別，體外激酶試驗(yàn)證實(shí)His6-CPK11可磷酸化開花途徑轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白，是CPK11蛋白激酶功能又一新發(fā)現(xiàn)，為CPKs家族成員參與FD蛋白磷酸化修飾提供更多證據(jù)支持。

本研究利用兩種方法判斷蛋白磷酸化。①利用anti-pThr多克隆抗體，該抗體可特異識別蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)被磷酸化蛋白，不可識別未被磷酸化蛋白。②蛋白質(zhì)被磷酸化后電泳遷移速率變慢，試驗(yàn)結(jié)果顯示GST-FD被磷酸化后電泳遷移變慢。試驗(yàn)中anti-pThr多克隆抗體識別條帶為兩條帶緊密連接，因?yàn)镃PK11為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，而FD蛋白氨基酸序列中包含多個(gè)絲氨酸/蘇氨酸殘基。因此推測結(jié)果中下方條帶可能是GST-FD中部分絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)被磷酸化，而上方條帶為GST-FD被完全磷酸化。亦或上方條帶所示蛋白被磷酸化位點(diǎn)比下方條帶更多。間接證明GST-FD蛋白上可能存在多個(gè)可被CPK11磷酸化絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)，隨激酶試驗(yàn)時(shí)間延長，所有蘇氨酸位點(diǎn)均被磷酸化，達(dá)到完全磷酸化狀態(tài)。可結(jié)合質(zhì)譜測序分析蘇氨酸位點(diǎn)被CPK11磷酸化。此外，后續(xù)將在植物體內(nèi)研究CPK11是否可磷酸化FD蛋白，CPK11基因敲除或過表達(dá)突變體是否表現(xiàn)出開花相關(guān)表型，從遺傳學(xué)角度闡明CPK11是否通過磷酸化FD參與開花調(diào)控。

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CPK11 phosphorylates flowering regulator FD inArabidopsis thaliana

YUAN Min,WANG Li,GE Weina,ZHANG Lan,GUO Di(Genomics and Computational Biology Research Center,School of Life Sciences,North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063000,China)

CPKs are a class of important Ser/Thr protein kinases,and mediate a lot of biological processes in plants.His6-CPK11 recombinant protein was expressed and purified using prokaryotic expression method in this study.The purified His6-CPK11 recombinant protein could be detected by anti-His antibody in western blot assay.Thein vitrokinase assay demonstrated that His6-CPK11 could phosphorylate transcription factor FD protein in flowering pathway.This result would provide more evidence to demonstrate that CPKs family members are involved in FD phosphorylation.

CPK11;FD;phosphorylation;flowering

Q786

A

1005-9369（2017）02-0046-06

2016-12-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401212）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2014209134）

袁敏（1982-），女，講師，博士，研究方向?yàn)橹参锷L發(fā)育。E-mail:yuanmin308@163.com

時(shí)間2017-3-7 16:14:58[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170307.1614.012.html

袁敏,王莉,葛偉娜,等.擬南芥CPK11對開花調(diào)控因子FD的磷酸化作用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(2):46-51.

Yuan Min,Wang Li,Ge Weina,et al.CPK11 phosphorylates flowering regulator FD inArabidopsis thaliana[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(2):46-51.(in Chinese with English abstract)