王?；?， 張曉峰 ， 苗 麗

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南鄭州450046 ; 2.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局河南鄭州450003)

MALDI-TOF MS技術(shù)在病原菌檢測(cè)與鑒定中的應(yīng)用研究

王?；?， 張曉峰1， 苗 麗2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南鄭州450046 ; 2.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局河南鄭州450003)

病原微生物引起的動(dòng)物疾病不僅嚴(yán)重影響到動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也威脅著人類健康， 隨著近年來(lái)抗菌藥物的濫用導(dǎo)致多種細(xì)菌耐藥以及部分新型細(xì)菌的出現(xiàn)使形勢(shì)更加嚴(yán)峻。傳統(tǒng)的微生物鑒定方法主要有表型的檢測(cè)，包括革蘭染色、微生物分離培養(yǎng)和生化試驗(yàn)等，因時(shí)間較長(zhǎng)、鑒定范圍窄，影響了病原微生物鑒定的速度和準(zhǔn)確性，在一定程度上影響了疾病的控制。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry MALDI-TOF-MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的應(yīng)用于微生物快速檢測(cè)的一項(xiàng)技術(shù)。基于繪制微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜與已知標(biāo)準(zhǔn)微生物的蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較達(dá)到鑒定的目的。不同的細(xì)菌經(jīng)MALDI-TOF MS檢測(cè)可以形成特異性的指紋圖譜，建立這些細(xì)菌的圖譜庫(kù)，將待測(cè)細(xì)菌的質(zhì)譜圖與已有質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行比較，即可確定細(xì)菌種屬。由于所得到的蛋白質(zhì)圖譜中主要的分子離子峰為菌體內(nèi)高豐度、表達(dá)穩(wěn)定且進(jìn)化保守的核糖體蛋白，因此其鑒定結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

1 MALDI-TOF-MS技術(shù)的原理

將微生物樣品和基質(zhì)溶液以一定比例混合，取數(shù)微升上述混合溶液點(diǎn)在靶板上，溶劑揮發(fā)后形成樣品與基質(zhì)的共結(jié)晶體，利用激光作為能量來(lái)源輻射共結(jié)晶體，基質(zhì)從激光中獲取能量躍遷成為激發(fā)態(tài)使樣品發(fā)生解析離子化，離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，飛行時(shí)間與離子的質(zhì)荷比(m/z)成正比，分子量較小的分子，飛行的較快，以離子質(zhì)荷比(m/z)為橫坐標(biāo)，離子峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，形成質(zhì)量圖譜，將質(zhì)量圖譜與已知質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征性質(zhì)譜圖比對(duì)，篩選并確定出特異性圖譜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定。

2 MALDI-TOF-MS在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

根據(jù)國(guó)家食源性致病菌監(jiān)測(cè)要求,微生物檢測(cè)項(xiàng)目主要是沙門菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、彎曲菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌等。目前對(duì)食源性致病菌的病原學(xué)檢測(cè)依賴細(xì)菌的生化代謝和血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果來(lái)判定，耗時(shí)較長(zhǎng)?；诨蛐丸b定方法，細(xì)菌核糖體基因序列分析、熒光定量PCR檢測(cè)特定的基因等易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的想象，而MALDI-TOF-MS方法從首次報(bào)道用于微生物的鑒定以來(lái)，一直被許多國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者應(yīng)用，收到很好的效果。

戰(zhàn)曉微等[1]從牛肉骨粉中分離出甲型副傷寒沙門菌的野生分離株，用傳統(tǒng)方法與MALDI-TOF-MS方法進(jìn)行檢測(cè)比較，MALDI-TOF-MS檢測(cè)的可信度分值為2.372，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致且準(zhǔn)確性較高。Karen L等[2]用MALDI-TOF MS方法對(duì)致瀉性大腸埃希菌、宋內(nèi)志賀菌、金黃色葡萄球菌、腸炎耶爾森菌等31株常見(jiàn)食源性致病菌進(jìn)行成功鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證了該技術(shù)在微生物鑒定方面的可靠性。Barbuddhe S B[3]等應(yīng)用Maldi-TOF MS方法測(cè)試了不同血清型的李斯特菌，不同血清型李斯特菌的特征性峰值不同。該方法與PFGE對(duì)不同血清型的李斯特菌比較，表明MALDI-TOF MS可以有效鑒別李斯特菌及其亞型，甚至可以鑒定到種水平。通過(guò)對(duì)單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證，表明鑒定結(jié)果的可信度很高。R.Dieckmann等[4]對(duì)12個(gè)屬456致病菌株成功進(jìn)行了鑒定。資料顯示，有很多研究學(xué)者采用MALDI-TOF MS方法在宋內(nèi)志賀菌、克羅諾桿菌、大腸埃希菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、沙門菌等食源性致病菌的快速檢測(cè)方面進(jìn)行應(yīng)用，效果良好。

龔艷清等[5]從冷凍保存的羅非魚(yú)、鰻魚(yú)、大菱鲆、鯉魚(yú)、牛蛙及甲魚(yú)等水生動(dòng)物中分離的20 株遲緩愛(ài)德華菌用MALDI-TOF MS和全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK方法進(jìn)行鑒定比較，結(jié)果表明，MALDI-TOF-MS方法檢測(cè)的20株遲緩愛(ài)德華菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中的質(zhì)譜圖匹配比較，分值均在2.35以上，準(zhǔn)確性較高。而全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK檢測(cè)的遲緩愛(ài)德華菌的鑒定值只有85%，說(shuō)明MALDI-TOF MS方法在重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性等方面總體優(yōu)于傳統(tǒng)生化鑒定方法。戰(zhàn)曉微等[6]分別從養(yǎng)殖生豬、動(dòng)物源性食品以及從食物中毒患者及食品加工人員中分離的47株大腸桿菌分離株，經(jīng)MALDI-TOF MS方法檢測(cè)收集菌株的蛋白指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)分析，結(jié)果表明，該47株菌株均為大腸桿菌且可信度分值分布于1.9～2.5之間，與常規(guī)方法分離大腸桿菌的鑒定結(jié)果一致?？尚哦确种档牟町愓f(shuō)明該47株大腸桿菌存在顯著差異。

Wang Y等[7]從樣品中分離的37株單增李斯特菌，應(yīng)用MALDI—TOF MS方法采集蛋白質(zhì)指紋圖譜，匯集成單增李斯特菌圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)與標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行驗(yàn)證，并在此基礎(chǔ)上對(duì)37株單增李斯特菌分離株進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明,MALDI-TOF MS方法將37株單增李斯特菌分離株分成9個(gè)型，以此建立了MALDI-TOF MS快速鑒定與分型方法。Bao C M[8]等分別使用直接涂抹法和提取法處理，對(duì)200株宋內(nèi)志賀菌野生株及致瀉性大腸埃菌進(jìn)行鑒定驗(yàn)證，結(jié)果表明，宋內(nèi)志賀菌經(jīng)涂抹法鑒定準(zhǔn)確率為71.5%，而經(jīng)提取法鑒定準(zhǔn)確率為100%，并以此建立了鑒定宋內(nèi)志賀菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)比分析宋內(nèi)志賀菌的離子峰可鑒別到亞種，為鑒定宋內(nèi)志賀菌提供了一種高效快速的方法。Zheng Q Y等[9]人通過(guò)MALDI-TOF MS方法主成分分析及聚類分析，對(duì)不同血清型、不同地區(qū)來(lái)源及不同宿主的74株沙門菌進(jìn)行溯源分析，結(jié)果如表1所示，表明74株沙門菌中宿主及來(lái)源地相同或相似的沙門菌蛋白質(zhì)指紋圖譜相似性較好，而宿主及來(lái)源不同或較遠(yuǎn)的沙門氏菌指紋圖譜數(shù)據(jù)差異較大，表明宿主及來(lái)源地相似或較遠(yuǎn)的菌株在菌體蛋白表達(dá)上存在差異。

表1 不同菌株來(lái)源及數(shù)量

Zhao G M[10]等，對(duì)32株克羅諾桿菌(28株分離株，4株參考菌株)與相近菌株陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌應(yīng)用MALDI-TOF MS與API方法分別進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS能將32株克羅諾桿菌鑒定到種、屬水平的分別為56.2%和37.5%，而API的方法則為75%和21.9%，并且3株菌未獲得鑒定結(jié)果，其余29株菌的鑒定結(jié)果一致。在此試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用采集的8種參考菌株的蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)構(gòu)建克羅諾桿菌的MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)，再用相近腸桿菌及該屬分離株驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，應(yīng)用建立的克羅諾桿菌的MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)135株克羅諾桿菌分離株進(jìn)行分析，可信度分值均大于2.0，達(dá)到了種水平鑒定要求，通過(guò)聚類分析，可進(jìn)一步分型。這對(duì)克羅諾桿菌鑒定與分型提供了一種新的手段。對(duì)克羅諾桿菌的快速溯源具有重要參考價(jià)值，進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)自建數(shù)據(jù)庫(kù)是提高鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性的方法之一。Zhao H Y[11]等解決了傳統(tǒng)方法對(duì)克羅諾桿菌的鑒定存在一定的假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題，彌補(bǔ)了現(xiàn)有方法的不足，對(duì)克羅諾桿菌(阪崎腸桿菌)的進(jìn)一步研究提供豐富的科學(xué)依據(jù)。

3 MALDI-TOF MS在醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

在疾病診斷與研究過(guò)程中，質(zhì)譜技術(shù)在病原微生物的鑒定和分型[15],靶蛋白的組織定位[16]等方面取得初步成果。在這些成果中最早報(bào)道MALDI-TOF MS方法對(duì)病原菌鑒定的研究與應(yīng)用[17-18]，尤其對(duì)于感染性疾病病原臨床分離株的鑒定與分型。目前，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)在感染性疾病病原的診斷與應(yīng)用研究中主要有以下幾方面：(1)菌落純培養(yǎng)的鑒定；(2)樣本中無(wú)菌部位細(xì)菌的直接鑒定；(3)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)；(4)病毒的檢測(cè)。

嚴(yán)立等[12]將重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院送檢的臨床123株菌株用MALDI-TOF-MS和傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定比較，123株菌株中大多數(shù)是常見(jiàn)的臨床相關(guān)病原菌(包括葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、腸桿菌、革蘭陽(yáng)性桿菌等能較全面反映其在臨床常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室中的表現(xiàn))。結(jié)果表明,MALDI-TOF MS方法可將122株菌株鑒定至種，鑒定可信度為60%～99.9%，尤其對(duì)常見(jiàn)菌如金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腸球菌及大多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌，非發(fā)酵菌及酵母菌的鑒定能力很好，鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)95%。Wang Y R[13]等利用MALDI-TOF MS方法從門診腹瀉患者糞便分離的88株沙門菌進(jìn)行分型，88株沙門菌被分為15個(gè)型，親緣關(guān)系的差異水平值為100。MALDI-TOF MS方法結(jié)合耐藥表型分型88株沙門菌分成44個(gè)亞型；結(jié)合血清學(xué)分型88株菌分成46個(gè)亞型；結(jié)合PFGE分型88株菌分成64個(gè)亞型。盡管MALDI-TOF MS方法在血清分型中具有一定的分型能力，然其分型結(jié)果與傳統(tǒng)結(jié)果還存在一定的差異。目前國(guó)內(nèi)外在這方面的研究性文章很少，尚無(wú)法斷定MALDI-TOF MS在血清分型方面的能力。Sun Z K等[14]用MALDI-TOF MS方法對(duì)臨床分離的40株葡萄球菌進(jìn)行耐藥性、聚類分析和API Staph系統(tǒng)、Kirby-bauer耐藥性鑒定分析對(duì)比，40株葡萄球菌的分離株中有34株為金黃色葡萄球菌，6株為其他葡萄球菌，結(jié)果與API Staph系統(tǒng)鑒定一致。Kirby-bauer法耐藥性檢測(cè)顯示，34株金黃色葡萄球菌其中11株為耐藥性金黃色葡萄球菌，23株為敏感性金黃色葡萄球菌，用MALDI-TOF MS方法聚類分析結(jié)果與耐藥性檢測(cè)結(jié)果一致，試驗(yàn)表明，MALDI-TOF MS方法不僅可區(qū)分MRSA(耐藥)和MSSA(敏感)，甚至能區(qū)分不同類型耐藥性，這對(duì)快速提供治療方案和控制感染具有重要的作用。

4 展望

微生物的鑒定分類主要有表型鑒定和基因型鑒定兩種方法。表型鑒定屬于傳統(tǒng)分類鑒定方法，包括分離培養(yǎng)，形態(tài)特征，生化反應(yīng)，血清學(xué)，耐藥性等分型，鑒定周期較長(zhǎng)，一般需要3～5 d?；蛐丸b定方法包括(G+C)mol%、DNA雜交、PFGE，16S rDNA序列等，從遺傳學(xué)及種系角度對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定分類。MALDI-TOF MS方法鑒定不是基于微生物的生理生化指標(biāo)和基因，而是取決于特異性蛋白圖譜的比較來(lái)進(jìn)行的，因此MALDI-TOF MS方法是對(duì)微生物鑒定分類的一種補(bǔ)充而不是替代。不同的分型方法可以相互借鑒，互相補(bǔ)充。蛋白指紋圖譜與基因水平分型結(jié)合起來(lái)能擴(kuò)大對(duì)亞種水平的分型鑒定能力。

目前MALDI-TOF MS方法具有敏感度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、圖譜簡(jiǎn)明，而且操作簡(jiǎn)單、快捷等特點(diǎn)，越來(lái)越多的用于病原性微生物的快速鑒定與分型方面。盡管如此，國(guó)內(nèi)對(duì)MALDI-TOF MS方法的研究和應(yīng)用還處于探索階段，微生物蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)大多數(shù)來(lái)源于國(guó)外資料，雖然我國(guó)的研究學(xué)者也建立了一些數(shù)據(jù)庫(kù)，但一些新型細(xì)菌的圖譜和罕見(jiàn)菌種尚未被數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，從而導(dǎo)致鑒定困難；而且不同國(guó)家和地區(qū)的同種菌株也存在一定的地理差異，只有不斷的增加不同來(lái)源和地區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)的菌株種類和數(shù)量，才能保證鑒定的準(zhǔn)確性。另外，MALDI-TOF MS方法對(duì)不同菌株的樣品處理、質(zhì)譜圖采集和分析、多血清型細(xì)菌的分型鑒別準(zhǔn)確性等方面還有許多問(wèn)題需要研究改進(jìn)和完善。

隨著MALDI-TOF MS技術(shù)的不斷完善和提高，盡管該技術(shù)在微生物分類研究、食源性致病菌，感染性疾病病原的鑒定與分類方面取得一定的成果，但在畜牧獸醫(yī)行業(yè)的檢測(cè)方面仍然是一個(gè)空白，隨著蛋白質(zhì)譜技術(shù)的提高，相信一定能填補(bǔ)這方面的空白。

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2016-08-10

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技項(xiàng)目(2015IK113)

王?；?1977- )女，講師，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)研究工作，E-mail:whh9023@sina.com

苗麗，E-mail:ml5628@163.com

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0529-6005(2017)02-0062-03