王彩云 ， 潘 登 ， 張召議 ， 范奎奎 ， 李 婷 ， 杜晨光,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 ； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古包頭014109)

類固醇激素合成調(diào)節(jié)因子在小鼠下丘腦和卵巢上的分布

王彩云1， 潘 登1， 張召議1， 范奎奎1， 李 婷1， 杜晨光1,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 ； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古包頭014109)

下丘腦作為神經(jīng)活動中樞具有調(diào)控能量平衡和生殖的重要作用。CYP17A1、類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)和1型蛋白(HSD3B1)作為對生殖過程中類固醇激素合成過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在小鼠下丘腦和卵巢中表達部位尚不明確。本研究應(yīng)用免疫熒光檢測了小鼠下丘腦中上述調(diào)節(jié)因子的神經(jīng)元表達位置和在卵巢中的分布情況。結(jié)果顯示，CYP17A1在小鼠的下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和穹窿處具有區(qū)域性分布的同時也表達在成熟的黃體組織中。HSD3B1主要表達在卵泡的顆粒細胞，StAR與CYP17A1在卵母細胞中存在共表達關(guān)系。上述結(jié)果提示，下丘腦中CYP17A1在下丘腦-垂體-性腺軸中，并可能參于調(diào)控小鼠卵巢類固醇激素的合成；StAR,HSD3B1不僅存在于下丘腦的神經(jīng)元中，也同樣存在于卵巢組織中，參與類固醇激素的合成。本文為進一步研究下丘腦調(diào)控卵巢合成類固醇激素的生理過程提供了基礎(chǔ)。

下丘腦 ； 卵巢 ； CYP17A1 ； StAR ； HSD3B1

P45017A1(17α-hydroxylase/17,20-lyase cytochrome P450)是P450酶系家族中的微粒體，最初在人類腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶中發(fā)現(xiàn)的由CYP17A1基因進行編碼。它在不同的機體組織中具有不同的酶活性，具體表現(xiàn)為：17α-羥化酶在腎上腺皮質(zhì)部參與糖皮質(zhì)激素的合成，17α-羥化酶和17,20-裂解酶在性腺中參與睪酮和雌二醇的合成[1]。類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)是一個30 kDa大小的蛋白，調(diào)節(jié)類固醇激素從線粒體的外膜轉(zhuǎn)運到線粒體的內(nèi)膜的過程[2]。有研究表明，StAR的表達主要在原位的卵泡排卵前的顆粒細胞中和卵泡膜細胞黃體化后的細胞中。在3β-羥基類固醇脫氫酶系(3β-hydroxysteroid dehydrogenases)中，其1型蛋白(HSD3B1)在合成孕酮的過程中主要參與前體物質(zhì)孕烯醇酮向孕酮的轉(zhuǎn)化過程，并且在之前的研究中表明，HSD3B1在類固醇轉(zhuǎn)化過程中具有一定的限速酶作用[3]。CYP17A1、StAR、HSD3B1在不同的黃體細胞中存在，并且高度的表達。三者的配合會引發(fā)類固醇激素的合成過程的順利進行[4]。不僅調(diào)節(jié)雌二醇轉(zhuǎn)化為孕酮的過程，同時，還與卵巢相關(guān)的類固醇的合成有關(guān)[5]。由此可見，這三者在調(diào)節(jié)卵巢中類固醇激素的合成過程中，發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，并且保障了生殖機能的順利進行。促性腺激素(GnRH)分布在動物的下丘腦中，可以刺激垂體釋放卵泡刺激激素(FSH)和黃體生成素(LH)。在雌性動物中，F(xiàn)SH和LH在下丘腦的調(diào)控下能夠依次刺激卵泡的生長發(fā)育和黃體的形成；對于雄性動物而言，LH刺激間質(zhì)類固醇合成睪丸激素，作用到睪丸間質(zhì)和生精小管促進精子的成熟，F(xiàn)SH則影響配子的細胞增值和分化[6]，因此大腦在調(diào)控雌性生殖功能方面具有舉足輕重的作用。另外，在睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化的過程中，CYP17A1、StAR、HSD3B1為這一過程的調(diào)控提供了轉(zhuǎn)化環(huán)境和引導(dǎo)。本試驗主要以雌性小鼠為研究對象。基于之前的研究結(jié)果，我們推測這些參與下丘腦對于生殖調(diào)控的關(guān)鍵性因子也應(yīng)該體現(xiàn)在卵巢中的相應(yīng)部位來發(fā)揮相應(yīng)的功能。為了驗證這一推測的可靠性，我們應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對合成類固醇激素的過程中發(fā)揮主要作用的3種因子(CYP17A1、StAR、HSD3B1)在下丘腦和卵巢上的表達部位進行熒光信號的定位，為進一步研究下丘腦調(diào)控卵巢的機理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗中使用的小鼠品種為C57BL/6體重(22～25)g，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。為避免試驗中應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn)，小鼠在試驗前的5 d給予生理鹽水的訓(xùn)練(上午9:00)。試驗期間小鼠自由飲水和進食并在12 h晝夜交替的環(huán)境下進行飼養(yǎng)(7:00午前～7:00午后給予光照)。選取健康的小鼠進行下一步的試驗。

1.2 小鼠性周期的鑒定 選取體重健康狀態(tài)相近的小鼠(n=5)，使用50 μL室溫的生理鹽水對小鼠的陰道上皮細胞進行沖洗，之后將小鼠的陰道上皮細胞滴加在防脫載玻片上，待液體自然風(fēng)干后，滴加95%乙醇進行固定10 min，之后使用蒸餾水進行沖洗。自然風(fēng)干后向其中滴加1%龍膽紫溶液，作用10 min，沖洗干凈后使用光學(xué)顯微鏡進行觀察(奧林巴斯XSP-2C)。

1.3 材料的獲取和保存 用于免疫熒光的試驗材料在取材之前先使用100 mL冷的生理鹽水對小鼠進行灌注，之后換為4%多聚甲醛(PFA，pH值7.4,Sigma公司)灌注20 min。灌注后在冰上取小鼠的下丘腦和卵巢，并將組織放在4%PFA中進行6 h的固定。組織的脫水在30%蔗糖溶液中進行，直至開始切片。切片使用Lecia CM1950型冰凍切片機進行，小鼠下丘腦切片厚度為30 μm，卵巢的切片厚度為10 μm。

1.4 小鼠腦部神經(jīng)元免疫熒光 組織在1%TritonX-100 (pH值7.4,T8787,Sigma公司)中預(yù)處理30 min,之后使用1%硼氫化鈉(71321,Sigma公司)進行封閉前的預(yù)處理，30 min后轉(zhuǎn)為封閉。封閉液使用3%正常驢血清(Normal Donkey Serum，017-000-121,Jackson)時間為1 h。之后使用Goat anti-CYP17A1(1∶200,ab48019 Abcam)一抗，脫色搖床上4 ℃ 過夜孵育。二抗使用Alexa 561標(biāo)記的Donkey anti-Goat(1∶800,705-165-147,Jackson)室溫進行處理，時間為2 h。組織使用PBST(含1%TritonX-100)進行清洗，完畢之后在多聚賴氨酸處理過的載玻片上進行貼片，風(fēng)干過夜。使用Nikon C2 plus Confocal進行成像和圖像的分析。試驗結(jié)果中，小鼠腦布表達區(qū)域的判定以George Paxinos 和Keither B.J.Franklin編寫的《小鼠腦布立體坐標(biāo)》第二版中的標(biāo)注為參考。

1.5 小鼠卵巢免疫熒光 卵巢組織切片后快速貼在防脫載玻片上(世泰)。待卵巢牢固貼在防脫載玻片上后，使用0.01 mol/L PBS避光進行清理。之后使用0.5%TritonX-100 (pH值7.4,T8787,Sigma公司)預(yù)處理30 min。之后使用3%正常驢血清進行封閉(Normal Donkey Serum，017-000-121,Jackson)1 h。一抗使用 Goat anti-CYP17A1(1∶200,ab48019,Abcam),Mouse anti-PCNA (1∶500,ab29,Abcam)，和Rabbit anti-StAR (1∶250,ab203193,Abcam)，4 ℃孵育過夜。之后使用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。二抗使用Alx 561 Donley anti-Goat (1∶800,705-165-147,Jackson),Alx 488 Donkey anti-Mouse (1∶800,715-545-150,Jackson) 和 Alx 647 Donkey anti-Rabbit (1∶800,711-605-152,Jackson)進行特異性結(jié)合，室溫避光孵育2 h。之后使用含有1%Tween-20 (Sigma公司)的0.01 mol/L PBS進行避光清洗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠性周期的鑒定 在小鼠陰道上皮細胞結(jié)果中，小鼠的陰道上皮細胞在龍膽紫染色的結(jié)果下，呈現(xiàn)出無核角質(zhì)化上皮細胞的形態(tài)(染色質(zhì)染色不均勻，細胞皺縮，缺少細胞核)，并且在視野中沒有白細胞和有核上皮細胞的出現(xiàn)(見中插彩版圖1)，可以鑒定出小鼠所處的性周期為發(fā)情期。

2.2 CYP17A1在下丘腦的表達 從試驗結(jié)果中可以得知，CYP17A1在下丘腦的腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH) 和穹窿(fornix,f)部位集中表達(Bregma=-1.70 mm)。CYP17A1神經(jīng)元在小鼠下丘腦的穹窿(見中插彩版圖2，A)和腹內(nèi)側(cè)核(見中插彩版圖2，D)的表達區(qū)域的熒光結(jié)果，放大倍數(shù)為100 X。為了清晰的顯示神經(jīng)元的具體形態(tài)，我們對穹窿(見中插彩版圖2，B)和腹內(nèi)側(cè)核(見中插彩版圖2，D)進行了放大(400×)。從中我們可以看到試驗組(A、B、D、E)的CYP17A1在小鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)和穹窿(fornix,f)部位均存在CYP17A1神經(jīng)元熒光信號的集中表達，而且在其周圍部位也有少量散在地表達，但是熒光信號并不明顯。表達CYP17A1的神經(jīng)元細胞染色結(jié)果清晰、熒光亮度遠遠高于背景熒光值，呈典型的神經(jīng)元形態(tài),有明顯軸突，而且CYP17A1的熒光信號表達則表現(xiàn)為神經(jīng)元的胞質(zhì)部和膜上，可以看出細胞核中基本不表達CYP17A1的熒光信號。在陰性對照組中沒有關(guān)于CYP17A1相關(guān)神經(jīng)元熒光信號的表達。

2.3 CYP17A1在黃體和卵泡中的表達 從試驗結(jié)果中可知，CYP17A1在小鼠黃體(見中插彩版圖3，A)和次級卵泡(見中插彩版圖3，B)中均有表達。CYP17A1集中表達在小鼠的黃體組織和次級卵泡的壁顆粒細胞。對于已經(jīng)黃體化的卵巢組織部位，CYP17A1在卵巢的間質(zhì)組織中沒有顯示出較強的熒光信號，在卵母細胞中存在CYP17A1的特異性熒光信號。

我們以CYP17A1和PCNA的免疫熒光雙標(biāo)，以體現(xiàn)未發(fā)育的卵泡和黃體中的CYP17A1的熒光信號變化。由中插彩版圖4中可以看出，CYP17A1在未發(fā)育狀態(tài)下的卵泡中集中表達在卵母細胞的位置，對于發(fā)育后的黃體細胞而言CYP17A1，則主要表現(xiàn)在黃體細胞中。

2.4 卵巢類固醇激素中CYP17A1，StAR,HSD3B1間的關(guān)系 由中插彩版圖5可知，小鼠的卵巢中CYP17A1主要在發(fā)情期卵巢的黃體組織和卵母細胞中表達，CYP17A1的表達位置和StAR以及HSD3B1的表達信號都出現(xiàn)在小鼠的顆粒細胞中，其中CYP17A1和StAR的熒光信號還出現(xiàn)在卵巢的卵母細胞中，而HSD3B1在透明帶中具有表達，卵母細胞中未檢測到熒光信號的存在。

3 討論

CYP17A1、HSD3B1、StAR作為調(diào)控小鼠類固醇激素合成和孕酮的合成過程中的關(guān)鍵的酶，在小鼠的卵巢周期性變化和性行為方面具有關(guān)鍵性的作用。本試驗結(jié)果顯示，CYP17A1在小鼠的下丘腦以及卵巢上均有表達分布，從而證明下丘腦具有調(diào)控生殖的相關(guān)因子的表達。

下丘腦作為動物機體的生命中樞，具有調(diào)節(jié)能量代謝和生殖的多重作用。值得注意的是，動物機體內(nèi)可能存在有下丘腦-垂體-性腺軸，并且在小鼠的生殖和應(yīng)激過程的反饋中發(fā)生主要的調(diào)控作用[7]。試驗結(jié)果表明，下丘腦具有調(diào)節(jié)小鼠上述類固醇激素相關(guān)的酶存在，并且可能參與到卵巢的生理性變化的調(diào)控中進而影響小鼠的生殖活動。在雌性動物的性周期變化中，17β-雌二醇會在排卵前促進下丘腦的GnRH的釋放，并且這種神經(jīng)化學(xué)作用的發(fā)生會減少LH激素釋放的減少和相應(yīng)的作用的衰減[8]。在我們的試驗結(jié)果中我們檢測到了黃體發(fā)育過程中相關(guān)的調(diào)節(jié)因子CYP17A1的表達，并且有證據(jù)表明，下丘腦存在HSD3B1和StAR的表達，并且對于小鼠的類固醇激素的合成過程以及小鼠的LH峰的到來起到了關(guān)鍵性的作用，這種作用同樣會有雌激素的參與和下丘腦弓狀核雌激素α受體的調(diào)節(jié)[9]。這些結(jié)果在一定程度上說明了下丘腦和卵巢中的類固醇合成調(diào)節(jié)因子會在下丘腦和卵巢上同時發(fā)揮作用，并且這種作用可能是由下丘腦率先發(fā)出的指令，CYP17A1和HSD3B1在促進LH峰的到來的過程中起到了關(guān)鍵酶的作用[10]。

StAR則參與到了類固醇激素的轉(zhuǎn)運過程和孕酮的合成過程。之前的研究表明，StAR在類固醇激素的合成過程中發(fā)揮了急性調(diào)節(jié)的作用，StAR缺陷小鼠在類固醇激素的合成過程中出現(xiàn)障礙[11]，并且在StAR的作用過程中也會激活其關(guān)鍵性通路ERk 1/2[12]。我們的試驗結(jié)果也表明，StAR在下丘腦和卵巢上均存在表達，并且StAR在發(fā)育中卵泡的卵母細胞內(nèi)出現(xiàn)了較高的相對表達量。結(jié)合之前下丘腦-垂體-性腺軸的研究，我們猜測，下丘腦和卵巢在雌性小鼠類固醇激素的合成過程中共同發(fā)揮作用。

結(jié)合已有的結(jié)果我們可以得知，CYP17A1在成熟的黃體細胞和卵母細胞中的表達量較高，而在顆粒細胞中表達量相對較少，推測在卵巢合成類固醇激素的過程主要由黃體和卵母細胞主要分泌CYP17A1來參與調(diào)節(jié)其合成過程中的合成和裂解；顆粒細胞主要分泌HSD3B1來參與調(diào)控和限速作用；StAR則主要由顆粒細胞以及卵母細胞進行分泌，參與類固醇前體物質(zhì)在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程。這些在卵巢類固醇激素合成過程中的調(diào)節(jié)因子，同樣在下丘腦調(diào)控FSH，LH激素分泌的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。

我們做的試驗證實下丘腦存在有調(diào)節(jié)小鼠卵巢相關(guān)的類固醇激素合成所必需的關(guān)鍵酶CYP17A1，進一步與之前的下丘腦-垂體-性腺軸的研究內(nèi)容相互印證。從而證明了，下丘腦具有參與調(diào)節(jié)小鼠卵巢周期性活動和生殖的基礎(chǔ)。另外，在卵巢免疫熒光的結(jié)果中，StAR和CYP17A1在小鼠的卵母細胞內(nèi)部存在共表達關(guān)系，可以推測小鼠的卵母細胞參與合成CYP17A1和StAR這兩種關(guān)鍵的因子，從而進一步參與調(diào)控類固醇激素的合成過程以及在細胞內(nèi)線粒體上的轉(zhuǎn)運過程。HSD3B1作為小鼠下丘腦調(diào)節(jié)LH峰值的中間調(diào)控因子，其在卵泡顆粒細胞中的表達，說明 HSD3B1可能參與到顆粒細胞黃體化的過程當(dāng)中。以上證據(jù)皆說明下丘腦可能參與到了小鼠卵巢對生殖活動機能的調(diào)節(jié)過程，但是這些關(guān)鍵因子在卵巢組織中具體的作用方式和調(diào)控過程有待于進一步研究。

本研究表明，下丘腦具有調(diào)節(jié)卵巢合成類固醇激素以及影響LH峰值到來的關(guān)鍵性因子CYP17A1的表達并且在小鼠的卵巢上具有相對應(yīng)的表達。同時，也證明StAR、HSD3B1和CYP17A1在小鼠卵巢中參與相關(guān)類固醇激素的合成，小鼠類固醇激素的合成過程中需要卵母細胞的參與。下丘腦作為生命中樞可能參與調(diào)控卵巢的類固醇激素合成過程，為進一步研究下丘腦參與調(diào)節(jié)卵巢類固醇激素合成的研究打下了基礎(chǔ)。

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Expression of steroidogenic factor in mice ovary and brain

WANG Cai-yun1, PAN Deng1, ZHANG Zhao-yi , FAN Kui-kui1, LI Ting1, DU Chen-guang1，2

(1.College of Veterinary, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;2.Vocational and Technical College, Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014109, China)

Hypothalamus plays a key role in mice energy balance and reproduction.CYP17A1,StAR and HSD3B1 are key factors in mouse steroidogenic,but little evidence describes the expression of CYP17A1,StAR and HSD3B1 in mouse hypothalamus and ovary.The results showed that CYP17A1 was expressed in ventromedial hypothalamic nucleus and fornix area,while it was also expressed in lutein cells in mouse ovary.HSD3B1 was mainly expressed in granulosa cells.In the oocyte,CYP17A1 co-localized with StAR.These results suggest that CYP17A1 may regulate ovary metabolism and synthesis of steroid hormones in mice.We also demonstrated that in CYP17A1 existed hypothalamus-pituitary-gonadal axis in rodents and oocyte takes part in the steroid hormones synthesis.StAR and HSD3B1 were also localized in female mouse ovary and might play a key role in mouse steroid hormones synthesis.This study provides a basis for the study of hypothalamus to regulate ovary to synthase steroid hormones in the future.

Hypothalamus ; Ovary ; CYP17A1 ; StAR ; HSD3B1

DU Chen-guang

2016-09-14

國家自然科學(xué)基金(31160455，31660701)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高校自然科學(xué)重點項目(NJZZ049)

王彩云(1969-)，女(蒙古族)，副教授，博士，研究方向為家畜解剖學(xué)，E-mail:576594761@qq.com

杜晨光，E-mail：dcglxj@163.com

R114

A

0529-6005(2017)02-0029-04