王彩云 ， 潘 登 ， 張召議 ， 范奎奎 ， 李 婷 ， 杜晨光,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 ； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古包頭014109)

類(lèi)固醇激素合成調(diào)節(jié)因子在小鼠下丘腦和卵巢上的分布

王彩云1， 潘 登1， 張召議1， 范奎奎1， 李 婷1， 杜晨光1,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018 ； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古包頭014109)

下丘腦作為神經(jīng)活動(dòng)中樞具有調(diào)控能量平衡和生殖的重要作用。CYP17A1、類(lèi)固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)和1型蛋白(HSD3B1)作為對(duì)生殖過(guò)程中類(lèi)固醇激素合成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在小鼠下丘腦和卵巢中表達(dá)部位尚不明確。本研究應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)了小鼠下丘腦中上述調(diào)節(jié)因子的神經(jīng)元表達(dá)位置和在卵巢中的分布情況。結(jié)果顯示，CYP17A1在小鼠的下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和穹窿處具有區(qū)域性分布的同時(shí)也表達(dá)在成熟的黃體組織中。HSD3B1主要表達(dá)在卵泡的顆粒細(xì)胞，StAR與CYP17A1在卵母細(xì)胞中存在共表達(dá)關(guān)系。上述結(jié)果提示，下丘腦中CYP17A1在下丘腦-垂體-性腺軸中，并可能參于調(diào)控小鼠卵巢類(lèi)固醇激素的合成；StAR,HSD3B1不僅存在于下丘腦的神經(jīng)元中，也同樣存在于卵巢組織中，參與類(lèi)固醇激素的合成。本文為進(jìn)一步研究下丘腦調(diào)控卵巢合成類(lèi)固醇激素的生理過(guò)程提供了基礎(chǔ)。

下丘腦 ； 卵巢 ； CYP17A1 ； StAR ； HSD3B1

P45017A1(17α-hydroxylase/17,20-lyase cytochrome P450)是P450酶系家族中的微粒體，最初在人類(lèi)腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶中發(fā)現(xiàn)的由CYP17A1基因進(jìn)行編碼。它在不同的機(jī)體組織中具有不同的酶活性，具體表現(xiàn)為：17α-羥化酶在腎上腺皮質(zhì)部參與糖皮質(zhì)激素的合成，17α-羥化酶和17,20-裂解酶在性腺中參與睪酮和雌二醇的合成[1]。類(lèi)固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)是一個(gè)30 kDa大小的蛋白，調(diào)節(jié)類(lèi)固醇激素從線粒體的外膜轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體的內(nèi)膜的過(guò)程[2]。有研究表明，StAR的表達(dá)主要在原位的卵泡排卵前的顆粒細(xì)胞中和卵泡膜細(xì)胞黃體化后的細(xì)胞中。在3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶系(3β-hydroxysteroid dehydrogenases)中，其1型蛋白(HSD3B1)在合成孕酮的過(guò)程中主要參與前體物質(zhì)孕烯醇酮向孕酮的轉(zhuǎn)化過(guò)程，并且在之前的研究中表明，HSD3B1在類(lèi)固醇轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有一定的限速酶作用[3]。CYP17A1、StAR、HSD3B1在不同的黃體細(xì)胞中存在，并且高度的表達(dá)。三者的配合會(huì)引發(fā)類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程的順利進(jìn)行[4]。不僅調(diào)節(jié)雌二醇轉(zhuǎn)化為孕酮的過(guò)程，同時(shí)，還與卵巢相關(guān)的類(lèi)固醇的合成有關(guān)[5]。由此可見(jiàn)，這三者在調(diào)節(jié)卵巢中類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程中，發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，并且保障了生殖機(jī)能的順利進(jìn)行。促性腺激素(GnRH)分布在動(dòng)物的下丘腦中，可以刺激垂體釋放卵泡刺激激素(FSH)和黃體生成素(LH)。在雌性動(dòng)物中，F(xiàn)SH和LH在下丘腦的調(diào)控下能夠依次刺激卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和黃體的形成；對(duì)于雄性動(dòng)物而言，LH刺激間質(zhì)類(lèi)固醇合成睪丸激素，作用到睪丸間質(zhì)和生精小管促進(jìn)精子的成熟，F(xiàn)SH則影響配子的細(xì)胞增值和分化[6]，因此大腦在調(diào)控雌性生殖功能方面具有舉足輕重的作用。另外，在睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，CYP17A1、StAR、HSD3B1為這一過(guò)程的調(diào)控提供了轉(zhuǎn)化環(huán)境和引導(dǎo)。本試驗(yàn)主要以雌性小鼠為研究對(duì)象?；谥暗难芯拷Y(jié)果，我們推測(cè)這些參與下丘腦對(duì)于生殖調(diào)控的關(guān)鍵性因子也應(yīng)該體現(xiàn)在卵巢中的相應(yīng)部位來(lái)發(fā)揮相應(yīng)的功能。為了驗(yàn)證這一推測(cè)的可靠性，我們應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對(duì)合成類(lèi)固醇激素的過(guò)程中發(fā)揮主要作用的3種因子(CYP17A1、StAR、HSD3B1)在下丘腦和卵巢上的表達(dá)部位進(jìn)行熒光信號(hào)的定位，為進(jìn)一步研究下丘腦調(diào)控卵巢的機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)中使用的小鼠品種為C57BL/6體重(22～25)g，雌性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。為避免試驗(yàn)中應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn)，小鼠在試驗(yàn)前的5 d給予生理鹽水的訓(xùn)練(上午9:00)。試驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食并在12 h晝夜交替的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)(7:00午前～7:00午后給予光照)。選取健康的小鼠進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

1.2 小鼠性周期的鑒定 選取體重健康狀態(tài)相近的小鼠(n=5)，使用50 μL室溫的生理鹽水對(duì)小鼠的陰道上皮細(xì)胞進(jìn)行沖洗，之后將小鼠的陰道上皮細(xì)胞滴加在防脫載玻片上，待液體自然風(fēng)干后，滴加95%乙醇進(jìn)行固定10 min，之后使用蒸餾水進(jìn)行沖洗。自然風(fēng)干后向其中滴加1%龍膽紫溶液，作用10 min，沖洗干凈后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察(奧林巴斯XSP-2C)。

1.3 材料的獲取和保存 用于免疫熒光的試驗(yàn)材料在取材之前先使用100 mL冷的生理鹽水對(duì)小鼠進(jìn)行灌注，之后換為4%多聚甲醛(PFA，pH值7.4,Sigma公司)灌注20 min。灌注后在冰上取小鼠的下丘腦和卵巢，并將組織放在4%PFA中進(jìn)行6 h的固定。組織的脫水在30%蔗糖溶液中進(jìn)行，直至開(kāi)始切片。切片使用Lecia CM1950型冰凍切片機(jī)進(jìn)行，小鼠下丘腦切片厚度為30 μm，卵巢的切片厚度為10 μm。

1.4 小鼠腦部神經(jīng)元免疫熒光 組織在1%TritonX-100 (pH值7.4,T8787,Sigma公司)中預(yù)處理30 min,之后使用1%硼氫化鈉(71321,Sigma公司)進(jìn)行封閉前的預(yù)處理，30 min后轉(zhuǎn)為封閉。封閉液使用3%正常驢血清(Normal Donkey Serum，017-000-121,Jackson)時(shí)間為1 h。之后使用Goat anti-CYP17A1(1∶200,ab48019 Abcam)一抗，脫色搖床上4 ℃ 過(guò)夜孵育。二抗使用Alexa 561標(biāo)記的Donkey anti-Goat(1∶800,705-165-147,Jackson)室溫進(jìn)行處理，時(shí)間為2 h。組織使用PBST(含1%TritonX-100)進(jìn)行清洗，完畢之后在多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片上進(jìn)行貼片，風(fēng)干過(guò)夜。使用Nikon C2 plus Confocal進(jìn)行成像和圖像的分析。試驗(yàn)結(jié)果中，小鼠腦布表達(dá)區(qū)域的判定以George Paxinos 和Keither B.J.Franklin編寫(xiě)的《小鼠腦布立體坐標(biāo)》第二版中的標(biāo)注為參考。

1.5 小鼠卵巢免疫熒光 卵巢組織切片后快速貼在防脫載玻片上(世泰)。待卵巢牢固貼在防脫載玻片上后，使用0.01 mol/L PBS避光進(jìn)行清理。之后使用0.5%TritonX-100 (pH值7.4,T8787,Sigma公司)預(yù)處理30 min。之后使用3%正常驢血清進(jìn)行封閉(Normal Donkey Serum，017-000-121,Jackson)1 h。一抗使用 Goat anti-CYP17A1(1∶200,ab48019,Abcam),Mouse anti-PCNA (1∶500,ab29,Abcam)，和Rabbit anti-StAR (1∶250,ab203193,Abcam)，4 ℃孵育過(guò)夜。之后使用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。二抗使用Alx 561 Donley anti-Goat (1∶800,705-165-147,Jackson),Alx 488 Donkey anti-Mouse (1∶800,715-545-150,Jackson) 和 Alx 647 Donkey anti-Rabbit (1∶800,711-605-152,Jackson)進(jìn)行特異性結(jié)合，室溫避光孵育2 h。之后使用含有1%Tween-20 (Sigma公司)的0.01 mol/L PBS進(jìn)行避光清洗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠性周期的鑒定 在小鼠陰道上皮細(xì)胞結(jié)果中，小鼠的陰道上皮細(xì)胞在龍膽紫染色的結(jié)果下，呈現(xiàn)出無(wú)核角質(zhì)化上皮細(xì)胞的形態(tài)(染色質(zhì)染色不均勻，細(xì)胞皺縮，缺少細(xì)胞核)，并且在視野中沒(méi)有白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞的出現(xiàn)(見(jiàn)中插彩版圖1)，可以鑒定出小鼠所處的性周期為發(fā)情期。

2.2 CYP17A1在下丘腦的表達(dá) 從試驗(yàn)結(jié)果中可以得知，CYP17A1在下丘腦的腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH) 和穹窿(fornix,f)部位集中表達(dá)(Bregma=-1.70 mm)。CYP17A1神經(jīng)元在小鼠下丘腦的穹窿(見(jiàn)中插彩版圖2，A)和腹內(nèi)側(cè)核(見(jiàn)中插彩版圖2，D)的表達(dá)區(qū)域的熒光結(jié)果，放大倍數(shù)為100 X。為了清晰的顯示神經(jīng)元的具體形態(tài)，我們對(duì)穹窿(見(jiàn)中插彩版圖2，B)和腹內(nèi)側(cè)核(見(jiàn)中插彩版圖2，D)進(jìn)行了放大(400×)。從中我們可以看到試驗(yàn)組(A、B、D、E)的CYP17A1在小鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)和穹窿(fornix,f)部位均存在CYP17A1神經(jīng)元熒光信號(hào)的集中表達(dá)，而且在其周?chē)课灰灿猩倭可⒃诘乇磉_(dá)，但是熒光信號(hào)并不明顯。表達(dá)CYP17A1的神經(jīng)元細(xì)胞染色結(jié)果清晰、熒光亮度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于背景熒光值，呈典型的神經(jīng)元形態(tài),有明顯軸突，而且CYP17A1的熒光信號(hào)表達(dá)則表現(xiàn)為神經(jīng)元的胞質(zhì)部和膜上，可以看出細(xì)胞核中基本不表達(dá)CYP17A1的熒光信號(hào)。在陰性對(duì)照組中沒(méi)有關(guān)于CYP17A1相關(guān)神經(jīng)元熒光信號(hào)的表達(dá)。

2.3 CYP17A1在黃體和卵泡中的表達(dá) 從試驗(yàn)結(jié)果中可知，CYP17A1在小鼠黃體(見(jiàn)中插彩版圖3，A)和次級(jí)卵泡(見(jiàn)中插彩版圖3，B)中均有表達(dá)。CYP17A1集中表達(dá)在小鼠的黃體組織和次級(jí)卵泡的壁顆粒細(xì)胞。對(duì)于已經(jīng)黃體化的卵巢組織部位，CYP17A1在卵巢的間質(zhì)組織中沒(méi)有顯示出較強(qiáng)的熒光信號(hào)，在卵母細(xì)胞中存在CYP17A1的特異性熒光信號(hào)。

我們以CYP17A1和PCNA的免疫熒光雙標(biāo)，以體現(xiàn)未發(fā)育的卵泡和黃體中的CYP17A1的熒光信號(hào)變化。由中插彩版圖4中可以看出，CYP17A1在未發(fā)育狀態(tài)下的卵泡中集中表達(dá)在卵母細(xì)胞的位置，對(duì)于發(fā)育后的黃體細(xì)胞而言CYP17A1，則主要表現(xiàn)在黃體細(xì)胞中。

2.4 卵巢類(lèi)固醇激素中CYP17A1，StAR,HSD3B1間的關(guān)系 由中插彩版圖5可知，小鼠的卵巢中CYP17A1主要在發(fā)情期卵巢的黃體組織和卵母細(xì)胞中表達(dá)，CYP17A1的表達(dá)位置和StAR以及HSD3B1的表達(dá)信號(hào)都出現(xiàn)在小鼠的顆粒細(xì)胞中，其中CYP17A1和StAR的熒光信號(hào)還出現(xiàn)在卵巢的卵母細(xì)胞中，而HSD3B1在透明帶中具有表達(dá)，卵母細(xì)胞中未檢測(cè)到熒光信號(hào)的存在。

3 討論

CYP17A1、HSD3B1、StAR作為調(diào)控小鼠類(lèi)固醇激素合成和孕酮的合成過(guò)程中的關(guān)鍵的酶，在小鼠的卵巢周期性變化和性行為方面具有關(guān)鍵性的作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，CYP17A1在小鼠的下丘腦以及卵巢上均有表達(dá)分布，從而證明下丘腦具有調(diào)控生殖的相關(guān)因子的表達(dá)。

下丘腦作為動(dòng)物機(jī)體的生命中樞，具有調(diào)節(jié)能量代謝和生殖的多重作用。值得注意的是，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)可能存在有下丘腦-垂體-性腺軸，并且在小鼠的生殖和應(yīng)激過(guò)程的反饋中發(fā)生主要的調(diào)控作用[7]。試驗(yàn)結(jié)果表明，下丘腦具有調(diào)節(jié)小鼠上述類(lèi)固醇激素相關(guān)的酶存在，并且可能參與到卵巢的生理性變化的調(diào)控中進(jìn)而影響小鼠的生殖活動(dòng)。在雌性動(dòng)物的性周期變化中，17β-雌二醇會(huì)在排卵前促進(jìn)下丘腦的GnRH的釋放，并且這種神經(jīng)化學(xué)作用的發(fā)生會(huì)減少LH激素釋放的減少和相應(yīng)的作用的衰減[8]。在我們的試驗(yàn)結(jié)果中我們檢測(cè)到了黃體發(fā)育過(guò)程中相關(guān)的調(diào)節(jié)因子CYP17A1的表達(dá)，并且有證據(jù)表明，下丘腦存在HSD3B1和StAR的表達(dá)，并且對(duì)于小鼠的類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程以及小鼠的LH峰的到來(lái)起到了關(guān)鍵性的作用，這種作用同樣會(huì)有雌激素的參與和下丘腦弓狀核雌激素α受體的調(diào)節(jié)[9]。這些結(jié)果在一定程度上說(shuō)明了下丘腦和卵巢中的類(lèi)固醇合成調(diào)節(jié)因子會(huì)在下丘腦和卵巢上同時(shí)發(fā)揮作用，并且這種作用可能是由下丘腦率先發(fā)出的指令，CYP17A1和HSD3B1在促進(jìn)LH峰的到來(lái)的過(guò)程中起到了關(guān)鍵酶的作用[10]。

StAR則參與到了類(lèi)固醇激素的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和孕酮的合成過(guò)程。之前的研究表明，StAR在類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程中發(fā)揮了急性調(diào)節(jié)的作用，StAR缺陷小鼠在類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程中出現(xiàn)障礙[11]，并且在StAR的作用過(guò)程中也會(huì)激活其關(guān)鍵性通路ERk 1/2[12]。我們的試驗(yàn)結(jié)果也表明，StAR在下丘腦和卵巢上均存在表達(dá)，并且StAR在發(fā)育中卵泡的卵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較高的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)合之前下丘腦-垂體-性腺軸的研究，我們猜測(cè)，下丘腦和卵巢在雌性小鼠類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程中共同發(fā)揮作用。

結(jié)合已有的結(jié)果我們可以得知，CYP17A1在成熟的黃體細(xì)胞和卵母細(xì)胞中的表達(dá)量較高，而在顆粒細(xì)胞中表達(dá)量相對(duì)較少，推測(cè)在卵巢合成類(lèi)固醇激素的過(guò)程主要由黃體和卵母細(xì)胞主要分泌CYP17A1來(lái)參與調(diào)節(jié)其合成過(guò)程中的合成和裂解；顆粒細(xì)胞主要分泌HSD3B1來(lái)參與調(diào)控和限速作用；StAR則主要由顆粒細(xì)胞以及卵母細(xì)胞進(jìn)行分泌，參與類(lèi)固醇前體物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。這些在卵巢類(lèi)固醇激素合成過(guò)程中的調(diào)節(jié)因子，同樣在下丘腦調(diào)控FSH，LH激素分泌的過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。

我們做的試驗(yàn)證實(shí)下丘腦存在有調(diào)節(jié)小鼠卵巢相關(guān)的類(lèi)固醇激素合成所必需的關(guān)鍵酶CYP17A1，進(jìn)一步與之前的下丘腦-垂體-性腺軸的研究?jī)?nèi)容相互印證。從而證明了，下丘腦具有參與調(diào)節(jié)小鼠卵巢周期性活動(dòng)和生殖的基礎(chǔ)。另外，在卵巢免疫熒光的結(jié)果中，StAR和CYP17A1在小鼠的卵母細(xì)胞內(nèi)部存在共表達(dá)關(guān)系，可以推測(cè)小鼠的卵母細(xì)胞參與合成CYP17A1和StAR這兩種關(guān)鍵的因子，從而進(jìn)一步參與調(diào)控類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程以及在細(xì)胞內(nèi)線粒體上的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。HSD3B1作為小鼠下丘腦調(diào)節(jié)LH峰值的中間調(diào)控因子，其在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，說(shuō)明 HSD3B1可能參與到顆粒細(xì)胞黃體化的過(guò)程當(dāng)中。以上證據(jù)皆說(shuō)明下丘腦可能參與到了小鼠卵巢對(duì)生殖活動(dòng)機(jī)能的調(diào)節(jié)過(guò)程，但是這些關(guān)鍵因子在卵巢組織中具體的作用方式和調(diào)控過(guò)程有待于進(jìn)一步研究。

本研究表明，下丘腦具有調(diào)節(jié)卵巢合成類(lèi)固醇激素以及影響LH峰值到來(lái)的關(guān)鍵性因子CYP17A1的表達(dá)并且在小鼠的卵巢上具有相對(duì)應(yīng)的表達(dá)。同時(shí)，也證明StAR、HSD3B1和CYP17A1在小鼠卵巢中參與相關(guān)類(lèi)固醇激素的合成，小鼠類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程中需要卵母細(xì)胞的參與。下丘腦作為生命中樞可能參與調(diào)控卵巢的類(lèi)固醇激素合成過(guò)程，為進(jìn)一步研究下丘腦參與調(diào)節(jié)卵巢類(lèi)固醇激素合成的研究打下了基礎(chǔ)。

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Expression of steroidogenic factor in mice ovary and brain

WANG Cai-yun1, PAN Deng1, ZHANG Zhao-yi , FAN Kui-kui1, LI Ting1, DU Chen-guang1，2

(1.College of Veterinary, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;2.Vocational and Technical College, Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014109, China)

Hypothalamus plays a key role in mice energy balance and reproduction.CYP17A1,StAR and HSD3B1 are key factors in mouse steroidogenic,but little evidence describes the expression of CYP17A1,StAR and HSD3B1 in mouse hypothalamus and ovary.The results showed that CYP17A1 was expressed in ventromedial hypothalamic nucleus and fornix area,while it was also expressed in lutein cells in mouse ovary.HSD3B1 was mainly expressed in granulosa cells.In the oocyte,CYP17A1 co-localized with StAR.These results suggest that CYP17A1 may regulate ovary metabolism and synthesis of steroid hormones in mice.We also demonstrated that in CYP17A1 existed hypothalamus-pituitary-gonadal axis in rodents and oocyte takes part in the steroid hormones synthesis.StAR and HSD3B1 were also localized in female mouse ovary and might play a key role in mouse steroid hormones synthesis.This study provides a basis for the study of hypothalamus to regulate ovary to synthase steroid hormones in the future.

Hypothalamus ; Ovary ; CYP17A1 ; StAR ; HSD3B1

DU Chen-guang

2016-09-14

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160455，31660701)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高校自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(NJZZ049)

王彩云(1969-)，女(蒙古族)，副教授，博士，研究方向?yàn)榧倚蠼馄蕦W(xué)，E-mail:576594761@qq.com

杜晨光，E-mail：dcglxj@163.com

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0529-6005(2017)02-0029-04