賈智麗

(包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古包頭014035)

懸浮培養(yǎng)與傳統(tǒng)工藝兩種方法制備豬口蹄疫疫苗的質(zhì)量比較

賈智麗

(包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古包頭014035)

為比較懸浮培養(yǎng)與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)的豬口蹄疫疫苗的質(zhì)量，通過(guò)病毒含量測(cè)定、滅活檢驗(yàn)、內(nèi)毒素含量測(cè)定、成品理化性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)等方面開展試驗(yàn)，以比較兩種工藝的優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出，經(jīng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后獲得的病毒含量、制備疫苗效價(jià)都有明顯提高，中間產(chǎn)品內(nèi)毒素含量值有大幅降低，在實(shí)際接種動(dòng)物后，會(huì)大大降低副反應(yīng)發(fā)生率，同時(shí)疫苗的免疫效價(jià)以及持續(xù)期均會(huì)有所升高。表明，懸浮培養(yǎng)工藝的疫苗質(zhì)量高于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝。

口蹄疫； 疫苗； 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)； 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一種動(dòng)物性傳染病，表現(xiàn)為急性、熱性和高度接觸性。在我國(guó)，口蹄疫屬于一類動(dòng)物傳染病。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)和全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的豬口蹄疫疫苗進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，來(lái)比較兩種工藝下疫苗質(zhì)量的優(yōu)缺點(diǎn)，從而為口蹄疫疫苗生產(chǎn)的升級(jí)換代提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒種 制造及檢驗(yàn)用毒種為豬口蹄疫O型病毒OZK/93株和OR/80株。疫苗制造用毒種為乳鼠毒經(jīng)BHK21細(xì)胞傳代適應(yīng)的細(xì)胞毒；檢驗(yàn)用毒種為OZK/93株和OR/80株乳鼠毒，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室鑒定、保管和提供。

1.2 動(dòng)物 2～3日齡健康乳鼠(清潔級(jí))，無(wú)口蹄疫抗體的30～40日齡的健康易感仔豬,體重約(18～22)g健康小鼠(清潔級(jí))，體重(350～450)g豚鼠。

1.3 試劑 內(nèi)毒素檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)為201174、鱟試劑批號(hào)為1202022，由廣東湛江安度斯生物有限公司提供；ELISA檢測(cè)用O型口蹄疫抗體液相阻斷檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為2012031601，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.4 方法

1.4.1 病毒含量測(cè)定 按豬口蹄疫O型滅活疫苗(OZK/93株+OR/80株)制造及檢驗(yàn)規(guī)程，TCID50測(cè)定，用細(xì)胞維持液將生產(chǎn)毒液作10倍系列稀釋，培養(yǎng)觀察48～72 h，根據(jù)CPE產(chǎn)生情況按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，每0.1mL病毒含量OZK/93株應(yīng)不低于107.0TCID50；OR/80株應(yīng)不低于107.0TCID50。LD50測(cè)定，用PBS或細(xì)胞維持液將生產(chǎn)毒液作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-83個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度頸背部皮下接種2～3日齡乳鼠4只，每只注射0.2 mL。觀察3～5 d，根據(jù)發(fā)病死亡乳鼠數(shù)按Reed-Muench法計(jì)算LD50，每0.2 mL病毒含量，OZK/93株應(yīng)不低于107.5LD50；OR/80株應(yīng)不低于107.0LD50。

1.4.2 滅活檢驗(yàn) 按豬口蹄疫O型滅活疫苗(OZK/93株+OR/80株)制造及檢驗(yàn)規(guī)程，滅活液原樣接種乳鼠后，觀察7 d不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀和死亡。盲傳乳鼠觀察5 d不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀和死亡。將滅活液注射仔豬2頭，每頭耳根后分點(diǎn)注射共5 mL。仔豬觀察10 d，不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀和死亡。

1.4.3 內(nèi)毒素含量測(cè)定 按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010版[1]檢驗(yàn)，內(nèi)毒素含量應(yīng)≤50EU/mL。

1.4.4 成品理化性狀檢驗(yàn) 外觀性狀、劑型、穩(wěn)定性、黏度檢驗(yàn)，符合檢驗(yàn)規(guī)程。

1.4.5 無(wú)菌檢驗(yàn) 按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010版三部[1]檢驗(yàn)。

1.4.6 安全檢驗(yàn) 按豬口蹄疫O型滅活疫苗(OZK/93株+OR/80株)制造及檢驗(yàn)規(guī)程，用體重(350～450)g的豚鼠2只，皮下注射疫苗2.0 mL；用體重((18～22)g的小鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5 mL。連續(xù)觀察7 d，均不得出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。用30～40日齡的健康易感仔豬2頭，各兩側(cè)耳根后肌肉分點(diǎn)注射疫苗2頭份疫苗，逐日觀察14 d，均不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀或明顯的因注射疫苗引起的毒性反應(yīng)。

1.4.7 效力檢驗(yàn) 按豬口蹄疫O型滅活疫苗(OZK/93株+OR/80株)制造及檢驗(yàn)規(guī)程，根據(jù)免疫豬的保護(hù)數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算疫苗對(duì)攻毒株的免疫效力，每頭份疫苗各應(yīng)至少含3PD50。

2 結(jié)果

2.1 病毒含量結(jié)果 分別用10個(gè)批次的OR和OZK毒株對(duì)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行接毒，收毒后，記錄病毒液收獲時(shí)間、CPE(致細(xì)胞病變效應(yīng))比率，經(jīng)凍融2次后，分別測(cè)LD50和TCID50的數(shù)值，進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 病毒含量結(jié)果

在兩種細(xì)胞培養(yǎng)方式下，病毒液的收獲時(shí)間基本上一致，均保持在13.5～18 h之間，病變比率也基本一致，在80%～95%之間，LD50和TCID50則略有所變化，表現(xiàn)為懸浮培養(yǎng)后的LD50和TCID50值均比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)高0.27。說(shuō)明懸浮培養(yǎng)相對(duì)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)而言，總體上對(duì)毒液的毒價(jià)提升起到了一定作用。

2.2 病毒液滅活檢測(cè)結(jié)果 將不同生產(chǎn)方式下所得滅活后的病毒液接種于乳鼠，觀察72 h后再做乳鼠盲傳，同時(shí)將滅活后病毒液接種于健康仔豬2頭，在規(guī)定觀察期內(nèi)均不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀和死亡，檢測(cè)結(jié)果顯示，滅活液接種乳鼠和仔豬后，在觀察期內(nèi)，除陽(yáng)性對(duì)照全部死亡，接種原液乳鼠、盲傳乳鼠及陰性對(duì)照乳鼠和仔豬均健活，說(shuō)明病毒液滅活比較徹底。

2.3 病毒液滅活后內(nèi)毒素含量檢測(cè)結(jié)果 分別對(duì)兩種工藝生產(chǎn)的各10批中間產(chǎn)品滅活樣進(jìn)行內(nèi)毒素含量檢測(cè)，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式下的滅活樣內(nèi)毒素檢測(cè)值在<0.4EU/mL～48EU/mL之間，懸浮培養(yǎng)方式下的滅活樣內(nèi)毒素檢測(cè)值在<0.6EU/mL～8.1EU/mL之間，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同工藝對(duì)滅活樣內(nèi)毒素含量的影響

經(jīng)比較后得出，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式下，由于存在瓶間差、人為操作因素等，病毒液內(nèi)毒素含量批間差大，結(jié)果不穩(wěn)定，而通過(guò)在密閉容器中進(jìn)行懸浮生產(chǎn)，內(nèi)毒素含量批與批之間檢測(cè)值偏差小，使內(nèi)毒素含量更容易控制。

2.4 成品理化性狀檢驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)兩種工藝生產(chǎn)的各10批豬口蹄疫成品疫苗進(jìn)行理化性狀檢驗(yàn)，包括外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度。具體檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，改變生產(chǎn)工藝后，疫苗的外觀由原來(lái)的粉紅色變?yōu)槿榘咨瑒┬秃宛ざ任窗l(fā)生變化，穩(wěn)定性表現(xiàn)得更為恒定。

2.5 無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)兩種疫苗各10批進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩種疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)均呈陰性。

2.6 安全性檢驗(yàn)結(jié)果 將兩種疫苗各10批，每批分別接種豚鼠和小白鼠，連續(xù)觀察一定時(shí)間，豚鼠全部2/2健活，小白鼠全部5/5健活，均未出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡，但注射傳統(tǒng)苗后的豚鼠，有個(gè)別在觀察期后注射部位存在0.5～1.5 cm的未完全吸收腫塊，注射懸浮苗的豚鼠則沒(méi)有此現(xiàn)象。

每批分別接種健康仔豬2頭，通過(guò)測(cè)量接種前基礎(chǔ)體溫、注苗后6 h體溫和注苗后24 h體溫，以及觀察動(dòng)物注苗后的反應(yīng)等，來(lái)比較兩種疫苗的安全性是否存在差異。結(jié)果顯示，注射兩種疫苗后，觀察動(dòng)物的精神狀態(tài)和食欲等均無(wú)明顯異常反應(yīng)。

2.7 效力檢驗(yàn)結(jié)果比較 用兩種疫苗分別對(duì)健康易感架子豬進(jìn)行攻毒，根據(jù)免疫豬的保護(hù)數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算疫苗對(duì)攻毒株的免疫效力。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 兩種疫苗攻毒后毒株效力結(jié)果比較

從10批疫苗的效力檢驗(yàn)攻毒結(jié)果看，懸浮苗攻毒結(jié)果有19個(gè)在10 PD50以上，平均值為14.03，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)疫苗中有5個(gè)在10 PD50以上，最高為13.59，最低為5.2，平均值為7.88。說(shuō)明懸浮培養(yǎng)后疫苗的效價(jià)比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)疫苗的效價(jià)有明顯的提高。

3 討論

懸浮培養(yǎng)條件下，病毒增值環(huán)境穩(wěn)定，其中包括溫度恒定、能及時(shí)補(bǔ)充氧氣、能隨時(shí)調(diào)整pH值，使病毒在適宜的環(huán)境中大量增值，最終表現(xiàn)為比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式下病毒含量較高。

對(duì)滅活樣內(nèi)毒素含量檢測(cè)進(jìn)行比較，在生產(chǎn)的中間工序已經(jīng)把內(nèi)毒素含量控制到一定范圍，說(shuō)明懸浮工藝對(duì)中間產(chǎn)品內(nèi)毒素含量的控制上起到了很好的作用。

豬口蹄疫疫苗理化性狀檢驗(yàn)顯示，成品疫苗外觀顏色改變，劑型和穩(wěn)定性基本沒(méi)發(fā)生變化。

兩種疫苗的無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果全部為陰性，說(shuō)明兩種生產(chǎn)工藝在生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)都控制的比較好，從中間產(chǎn)品到成品，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)菌污染現(xiàn)象，無(wú)菌檢驗(yàn)100%合格。

疫苗的安全檢驗(yàn)上，注射傳統(tǒng)苗后的豚鼠，有個(gè)別在觀察期后注射部位存在0.5～1.5 cm的未完全吸收腫塊，注射懸浮苗的豚鼠則沒(méi)有此現(xiàn)象；仔豬注射傳統(tǒng)苗后的體溫要略高于注射懸浮苗后的體溫。出現(xiàn)以上問(wèn)題的主要原因是，傳統(tǒng)苗中抗原異源蛋白和雜蛋白含量高，以及抗原內(nèi)毒素含量高。懸浮工藝中有效地去除了大量的異源蛋白和雜蛋白，使口蹄疫病毒的有效蛋白含量增多，最終成品接種于動(dòng)物后引起的副反應(yīng)降低。從效力檢驗(yàn)可以看出，懸浮生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的疫苗免疫效價(jià)以及持續(xù)期均比轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)的疫苗高。

綜上所述，懸浮培養(yǎng)后，疫苗的質(zhì)量在病毒含量、內(nèi)毒素含量、效價(jià)等方面有了明顯的提升，另外，懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫完整病毒粒子(146S)檢測(cè)較轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)高10倍左右[2-3]，說(shuō)明應(yīng)用懸浮培養(yǎng)后，雜蛋白含量更少，口蹄疫完整病毒粒子和口蹄疫疫苗質(zhì)量均提高[3]。

4 結(jié)論

4.1 從兩種懸浮培養(yǎng)比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝比較來(lái)看，懸浮工藝可以提高毒液的毒價(jià)。

4.2 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式下的中間產(chǎn)品內(nèi)毒素含量有高有低，檢測(cè)值不穩(wěn)定，而懸浮培養(yǎng)后所得中間產(chǎn)品內(nèi)毒素含量相對(duì)穩(wěn)定，數(shù)值比較集中主要在0.6EU/mL～8.1EU/mL之間

4.3 懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的豬口蹄疫苗在效價(jià)上有明顯的提高，懸浮苗攻毒結(jié)果效價(jià)最低為9 PD50，最高為15.59 PD50，平均值為14.03，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)疫苗最低為5.2，最高為13.59，平均值為7.88。

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典:2010年版.三部[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[2] 李榮,周勁松,劉國(guó)英,等.口蹄疫疫苗的懸浮培養(yǎng)工藝研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2011, 45(7):14-16.

[3] 陳文慶,王建超,劉華杰,等.懸浮培養(yǎng)工藝與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的比較與分析[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(10):37-41.

2016-07-27.

賈智麗(1979-)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail:jiazhili339@163.com

S858.2

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0529-6005(2017)02-0097-03