郁宏偉, 鄭朝朝， 柳 珊， 劉 濤, 劉云濤， 鄒立宏

[1.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北保定071000； 2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定071000]

規(guī)模化培養(yǎng)豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝的試驗

郁宏偉1,2, 鄭朝朝1,2， 柳 珊1,2， 劉 濤1,2, 劉云濤1,2， 鄒立宏1,2

[1.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北保定071000； 2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定071000]

為建立一種快速、穩(wěn)定的規(guī)?；囵B(yǎng)豬瘟活疫苗的生產(chǎn)工藝，本試驗將已感染豬瘟病毒的細胞直接接種到生物反應(yīng)器(工作體積為10 L)，收獲病毒液，制備成豬瘟活疫苗。研究結(jié)果顯示，接種帶毒細胞后培養(yǎng)3 d細胞數(shù)可增長4～6倍，15 d可收獲毒液7次，病毒收獲量至少與600個10 L轉(zhuǎn)瓶單次收獲量相當(dāng)，產(chǎn)品各項檢測均合格。本試驗所建立的生產(chǎn)工藝可大幅度縮短培養(yǎng)時間，提高生產(chǎn)效率，為規(guī)模化培養(yǎng)工藝的推廣與使用提供了技術(shù)參數(shù)。

豬瘟 ； 規(guī)?；囵B(yǎng) ； 生物反應(yīng)器

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)[1]。豬瘟被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的動物傳染病，中國也將其列為一類動物疫病[2]。接種疫苗是預(yù)防和控制豬瘟的有效手段。近年來豬瘟常有免疫失敗的報道，究其原因疫苗的質(zhì)量與之有很大的關(guān)系[3]。豬瘟疫苗各生產(chǎn)廠家的水平參差不齊，經(jīng)常出現(xiàn)疫苗效價不穩(wěn)定，病毒滴度低等問題[4]。因此，本行業(yè)亟需提高疫苗產(chǎn)品質(zhì)量以滿足市場需要。應(yīng)用生物反應(yīng)器制備疫苗抗原已經(jīng)成為國內(nèi)各獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注和研究的焦點[5]。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒及試驗動物 豬睪丸細胞(ST)，購自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬瘟病毒兔化弱毒株脾毒(CSFV)，由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司種毒室提供；安全檢驗用豬瘟抗體陰性豬，購自河北唐縣某豬場；效力檢驗用家兔，購自河北定州某兔場。

1.2 主要試劑、設(shè)備 MEM培養(yǎng)基，購自GIBCO公司；葡萄糖測定試劑盒，購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；豬瘟專用新生牛血清，購自武漢三利生物工程有限公司；胰蛋白酶，購自GIBCO公司；AP20C型激流灌注式多功能生物反應(yīng)系統(tǒng)，購自杭州安普生物工程有限公司(工作容積10 L)。

1.3 帶毒細胞制備 以常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代、增殖ST細胞，至長成良好單層后棄去培養(yǎng)液，接種脾毒，接毒量為3 g/瓶，置于37 ℃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。接毒后第4天進行第一次收獲換液，接毒后第8天將已接毒ST消化制備成帶毒細胞懸液，備用。

1.4 帶毒細胞罐體接種與培養(yǎng) 將帶毒細胞懸液接種至生物反應(yīng)器內(nèi)。設(shè)定設(shè)備參數(shù)：T1：37 ℃、T2：40 ℃、T3：36 ℃，pH值：7.4，DO值：50%～70%，振蕩速度20 r/min，空氣流量100 ml/min，啟動培養(yǎng)程序，開始病毒培養(yǎng)。當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L時，開始補液或者換液，維持殘?zhí)菨舛?，并分析細胞生長情況。

1.5 病毒培養(yǎng)、收獲 帶毒細胞培養(yǎng)至第3天進行第一次收獲，2～7收每48 h進行一次收獲，1～6收每次收獲完成后向系統(tǒng)內(nèi)補充9 L細胞維持液，補液后24 h補充200 g/L的葡萄糖，使殘?zhí)菨舛染S持在0.7 g/L。

1.6 半成品檢驗 無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行。半成品病毒含量測定用兔體定型熱反應(yīng)和間接免疫熒光兩種方法測定。

1.7 疫苗的制備與檢驗

1.7.1 疫苗制備 將檢驗合格的病毒液稀釋后混合于同一容器，加入等體積牛乳蔗糖凍干保護劑(5%蔗糖和12%脫脂乳)充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得成品。

1.7.2 疫苗安全性檢驗 按瓶簽注明頭份，將疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含6頭份，肌肉注射CSFV抗體陰性健康豬5頭，每頭5 mL，觀察21 d。

1.7.3 疫苗效力檢驗 將疫苗用生理鹽水稀釋成1/7500頭份/mL，耳靜脈注射家兔2只，1.0 mL/只，觀察96 h。

2 結(jié)果

2.1 半成品檢驗 收獲1～7收各收次毒液，檢測效價，7個收次的病毒液效力均在5.0×106RID/mL以上(如表1)。

表1 各次收獲病毒液的效價 (RID/mL)

7個收次的病毒液按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附錄進行純凈性檢驗，無細菌、真菌、支原體生長和外源病毒污染；病毒液對豬安全無副作用。

2.2 疫苗成品的安全和效力檢驗 接種疫苗后觀察21日，所有試驗豬體溫、精神、食欲無明顯變化，無異常臨床反應(yīng)，疫苗安全檢驗合格。

家兔接種疫苗后觀察4 d，2只家兔1只為定型熱(++)，另1只為輕熱(+)，疫苗效力檢驗合格。

3 討論

應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細胞生產(chǎn)豬瘟病毒能實現(xiàn)細胞高密度生長，本研究建立了一種規(guī)?；囵B(yǎng)豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝，通過將已感染豬瘟病毒的細胞直接接種至反應(yīng)器進行培養(yǎng)，收獲病毒液，縮短了生產(chǎn)周期，充分利用了轉(zhuǎn)瓶中可帶毒傳代的優(yōu)勢，而且自動化水平較高，生產(chǎn)過程穩(wěn)定可控，降低了產(chǎn)品批間差異，有利于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

建立的豬瘟病毒生產(chǎn)工藝一個周期病毒收獲量至少與600個轉(zhuǎn)瓶的單次收獲量相當(dāng)，該工藝與原有的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比，培養(yǎng)時間縮短一半，大大提高了生產(chǎn)效率，對于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本有明顯優(yōu)勢。

采用兔體熱反應(yīng)和間接免疫熒光兩種方法對半成品毒液進行了抗原含量檢測，根據(jù)檢測結(jié)果可以看出兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系，應(yīng)用間接免疫熒光方法檢測抗原含量有很大的可行性。

[1] 張雙, 郭慧, 徐浩，等.新型豬瘟疫苗的研究進展[J].中國獸醫(yī)雜志, 2015, 51(1): 72-74.

[2] 康愷, 林鷙, 高?；郏? 豬瘟病毒促進細胞自噬并利于病毒增殖[J], 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2014, 45(9): 1481-1487.

[3] 李安. 豬瘟病毒強毒株與疫苗C株鑒定方法的建立及疫苗病毒定量檢測的研究[D], 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[4] 鄭朝朝. 脾毒有效期對豬睪丸細胞產(chǎn)豬瘟毒的影響.第四屆京津冀一體化畜牧獸醫(yī)科技創(chuàng)新研討會論文集[S], 石家莊：2014年6月.

[5] 鄭朝朝, 邱貞娜,柳珊.等, 激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98株)工藝的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2013.35(2):107-109.

2016-02-24

郁宏偉(1978-)，男，獸醫(yī)師，博士，主要從事動物用生物制品研究與開發(fā)，E-mail: yuhongwei2005@126.com

鄭朝朝，E-mail: zhengzhao521@163.com

S852.612

B

0529-6005(2017)02-0095-02