王恒樹 張 沖

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011)

自擬組方補(bǔ)腎固筋方對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔血清及關(guān)節(jié)液白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α的影響

王恒樹 張 沖1

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011)

目的 觀察自擬組方補(bǔ)腎固筋方對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)兔血清及關(guān)節(jié)滑液白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制。方法 選取9個(gè)月齡健康雄性新西蘭大白兔44只，隨機(jī)盲法分為正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組11只，除正常組外均采用改良Hulth造模法造模成功后連續(xù)給藥12 w，取空腹血清及造模膝關(guān)節(jié)前方部分滑膜組織、股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨及軟骨下骨及滑液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)血清及關(guān)節(jié)滑液IL-1、TNF-α的含量及變化。結(jié)果 肉眼觀察西藥組關(guān)節(jié)間隙狹窄程度介于模型組和中藥組之間，關(guān)節(jié)表面粗糙，軟骨下骨贅生成明顯；中藥組關(guān)節(jié)間隙較其他各組稍窄，關(guān)節(jié)表面觸之稍粗糙伴輕微骨贅生成；中藥組光鏡下見軟骨細(xì)胞大小均勻排列整齊，模型組軟骨細(xì)胞大小不均且呈簇狀排列；模型組血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量升高(P<0.01)。兩個(gè)給藥組與模型組比較血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量降低(P<0.01)，兩給藥組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 補(bǔ)腎固筋方可以明顯降低血清和關(guān)節(jié)滑液IL-1、TNF-α的分泌水平。

補(bǔ)腎固筋方；兔膝骨性關(guān)節(jié)炎；美洛昔康；軟骨細(xì)胞；白細(xì)胞介素-1；腫瘤壞死因子-α

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)以關(guān)節(jié)軟骨變性及骨質(zhì)增生為病理特征?！端貑枴け哉摗罚罕灾采酷畬?duì)曰：風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也〔1〕，治療多用非甾體類藥物或脛骨高位截骨、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)〔2〕。中藥熟地、枸杞、杜仲、穿牛膝等治療KOA療效確切〔3〕。本實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)腎固筋方對(duì)KOA兔血清及關(guān)節(jié)液白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 44只SPF級(jí)雄性9個(gè)月齡新西蘭大白兔體重2.5～3.0 kg，實(shí)驗(yàn)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心設(shè)施內(nèi)進(jìn)行〔動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：scxk(冀)2012-1-004〕，處死動(dòng)物前經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。適應(yīng)環(huán)境后喂養(yǎng)3 w，室溫15℃～25℃，相對(duì)濕度45%～60%，每天正常光照，空氣流通，標(biāo)準(zhǔn)飼料(組成：麥麩、玉米、大白菜、芹菜)喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 藥物 補(bǔ)腎固筋方組成：熟地20 g、補(bǔ)骨脂20 g、枸杞子20 g、巴戟天15 g、川牛膝18 g、丹參15 g、木瓜10 g、雞血藤15 g，根據(jù)進(jìn)食欠佳，精神倦怠，喜暖惡寒，活動(dòng)多少等按中醫(yī)辨證加減治療，風(fēng)寒濕痹加減防風(fēng)、黃芪、羌活、獨(dú)活、桂枝；風(fēng)濕熱痹加減秦艽、羌活、茯苓、石膏；瘀血閉阻證加減桃仁、紅花、地龍；肝腎虧虛證偏于陰虛者加減枸杞子、山茱萸、川牛膝；偏于陽(yáng)虛者加減菟絲子、制附子、肉桂；以上藥量為成人藥量。購(gòu)于河北省中醫(yī)院藥房，河北省中醫(yī)院制劑室常規(guī)煎煮取汁300 ml，藥液濃縮加入蒸餾水后配成6 g/ml；美洛昔康膠囊，7.5 mg，四川寶光藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字:H20010209批次號(hào)：12050277 0265，加入蒸餾水配制成0.5 mg/ml溶液；注射用青霉素G鈉(石家莊制藥集團(tuán)有限公司,160 萬(wàn)IU/支，批號(hào)：A091136207)；2%利多卡因河北醫(yī)科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 試劑及儀器 兔IL-1、TNF-α ELISA試劑盒(IL-1 ELISA Kit Human，TNF-α ELISA Kit，規(guī)格：48T/96T)、免疫吸附劑、標(biāo)記物和顯色劑；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(規(guī)格：Bio-565)、DNM-9602A酶標(biāo)分析儀(規(guī)格：DNM-9602A)、微量注射器(針頭：33G)、移液器均購(gòu)自上海酶聯(lián)生化試劑有限公司；德國(guó)干燥箱(型號(hào)：TG100，產(chǎn)地：Hahn,Dusseldorf,Germany，廠家：Germany RETSCH Company)；恒溫水箱(DDIL-5型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；石蠟切片機(jī)(u-641型，美國(guó)貝克曼公司)；光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)(BH-5型，日本Olympus公司)；全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(Huu-12A型，日本日立公司)；723分光光度計(jì)(ELX8086型，美國(guó)寶特公司)；數(shù)碼X線機(jī)(CEx86型，美國(guó)GE公司)；4%多聚甲醛(山東省壽光市旭東化工有限公司，CAS號(hào)：30525-89-4)；滅菌注射用水(5 ml，石家莊第四制藥有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組及模型制備 44只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組及中藥組各11只,觀察和造模過程后2～3 w內(nèi)各組均死亡了1只后每組各10只。除正常組外均采用改良Hulth造模〔4〕。2%利多卡因(30 mg/kg)后肢靜脈麻醉，常規(guī)消毒取血，右后肢膝關(guān)節(jié)外側(cè)縱切口長(zhǎng)約5 cm，逐層切開、分離，探查關(guān)節(jié)腔無(wú)原發(fā)病變后，完整切除內(nèi)側(cè)半月板、前交叉韌帶(ACL)，內(nèi)側(cè)副韌帶(MCL)，造成負(fù)重力線內(nèi)移及膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)。術(shù)側(cè)肢體不固定，術(shù)后肌注青霉素160萬(wàn)IU·kg-1·d-1，連續(xù)8 d，每隔1 d觀察創(chuàng)口愈合情況，預(yù)防感染。術(shù)后第4天即強(qiáng)迫兔奔跑(0.5 h/d)，活動(dòng)范圍約2 h/d。造模2 w后軟骨出現(xiàn)改變，6 w后進(jìn)入平臺(tái)期，10 w后開始出現(xiàn)典型的晚期OA改變。當(dāng)脛股關(guān)節(jié)面正常外翻10°變?yōu)閮?nèi)翻，X線片顯示下肢力線改變且跛行明顯，前抽屜實(shí)驗(yàn)和內(nèi)側(cè)應(yīng)力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性即表示造模成功。本實(shí)驗(yàn)造模成功率為81.3%。

1.5 干預(yù)方法 造模成功3 w后干預(yù)治療，采用人與動(dòng)物的體表面積計(jì)算法換算：兔藥量(2.5 kg)/d=成人(65 kg)藥量/d×0.07×2.5×2/3，美洛昔康藥量為6 mg·kg-1·d-1，補(bǔ)腎固筋方藥量為53 g·kg-1·d-1，每天兩次鼻飼胃管注射；正常組、模型組灌胃15 ml生理鹽水，2次/d，連續(xù)干預(yù)8 w。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 步態(tài) 采用Coderre法〔5〕步態(tài)分級(jí)評(píng)價(jià)。0 級(jí)：正常步態(tài)，行走時(shí)間>5 min；Ⅰ級(jí)：輕度跛行，行走時(shí)間3～5 min；Ⅱ級(jí)：中度跛行，行走時(shí)間<3 min。

1.6.2 X線檢查 處死動(dòng)物前拍攝兔膝關(guān)節(jié)正位和側(cè)位DR片。X線損傷情況按改良David等〔6〕分級(jí)，0度：正常；Ⅰ度：可疑；Ⅱ度：肯定；Ⅲ度：明顯退變或伴骨質(zhì)增生。

1.6.3 關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué) 耳緣靜脈空氣栓塞處死，1 ml生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，取脛骨內(nèi)側(cè)軟骨面并肉眼觀察變化，取膝關(guān)節(jié)前方滑膜組織和股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，剪成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織塊1 min內(nèi)置于10%中性緩沖甲醛溶液中固定24 h。水沖洗1 h，5%甲酸甲醛脫鈣2 w；75%、85%、95%、100%各種濃度乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫水；石蠟包埋切片(5 μm)。70℃烤箱內(nèi)烤片30 min后HE染色，觀察關(guān)節(jié)軟骨的層次、軟骨細(xì)胞及軟骨下骨變化。

1.6.4 血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α檢測(cè) 取實(shí)驗(yàn)結(jié)束造模后藥物干預(yù)8 w空腹處死動(dòng)物后，立即心臟取血5 ml，3 000 r/min離心10 min分離出血清及關(guān)節(jié)滑液-60℃冰凍保存；5 000 r/min分離出關(guān)節(jié)軟骨及滑液后，-80℃超低溫冰箱保存24 h后再放入液氮(-196℃)保存。采用ELISA檢測(cè)兔血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件行ANOVA及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

圖1 各組骨形態(tài)學(xué)結(jié)果(HE，×40)

2.1 肉眼及鏡下觀察 見圖1。正常組關(guān)節(jié)軟骨藍(lán)白色且色澤透明軟骨表面光滑觸之較硬，關(guān)節(jié)液量少；模型組滑膜腫脹明顯，軟骨表面不光滑，關(guān)節(jié)邊緣與滑膜有少許纖維性粘連凹凸不平，鏡下見關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞大小不均呈深層簇聚排列；兩個(gè)給藥組關(guān)節(jié)軟骨呈白色觸之欠光滑，滑膜輕度增生，關(guān)節(jié)液較正常組稍多，輕度滑膜炎性改變，鏡下西藥組軟骨細(xì)胞排列欠完整，簇狀增生；中藥組軟骨細(xì)胞排列完整，相對(duì)整齊。

2.2 X線影像學(xué)比較 正常組兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙均勻一致，關(guān)節(jié)面平整，邊緣整齊規(guī)則無(wú)骨贅，關(guān)節(jié)內(nèi)無(wú)游離體；模型組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙變窄外側(cè)間隙增大，骨囊變、骨贅形成；中藥組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙狹窄不明顯，未見明顯骨贅形成；西藥組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙介于模型組和中藥組之間，有輕微骨贅形成。

2.3 IL-1、TNF-α檢測(cè) 模型組血清及關(guān)節(jié)液與正常組相比IL-1、TNF-α含量升高(P<0.01)。兩個(gè)給藥組與模型組相比血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量降低(P<0.01)，與正常組相比含量明顯降低(P<0.01)，兩給藥組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清及關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α含量 比較

與模型組比較:1)P<0.01

3 討 論

KOA的病理機(jī)制是關(guān)節(jié)軟骨退變，變性退變的關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑，龜裂缺損的范圍及深度各有差異〔7〕。研究表明在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)和骨性關(guān)節(jié)炎(OA)中均可檢測(cè)到IL-1的存在；IL-1可促進(jìn)慢性滑膜炎進(jìn)一步加重，同時(shí)軟骨基質(zhì)降解產(chǎn)物也可刺激滑膜繼發(fā)炎癥形成惡性循環(huán)〔8〕，IL-1還可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌前列腺素(PGE)2〔9〕，刺激骨吸收及成骨細(xì)胞增生鈣化，軟骨下骨異常增生形成骨贅〔10〕。OA軟骨免疫組化染色的基質(zhì)及細(xì)胞中TNF-α及其受體均呈現(xiàn)陽(yáng)性，這種陽(yáng)性強(qiáng)度與范圍和OA嚴(yán)重程度呈正比〔11〕；TNF-α促進(jìn)多形核細(xì)胞刺激滑膜細(xì)胞PGE2分泌，進(jìn)而破壞骨軟骨，TNF-α可以加速滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖，導(dǎo)致最終滑膜組織纖維素樣變性，同時(shí)IL-1、TNF-α協(xié)同作用加快了膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解〔12〕。

筆者積累多年臨床經(jīng)驗(yàn)參考大量文獻(xiàn)自擬補(bǔ)腎固筋方，治則補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋健骨，以熟地、補(bǔ)骨脂為君藥，熟地性微溫、味甘，滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)骨脂乃補(bǔ)腎壯陽(yáng)益精填髓之要藥，熟地、補(bǔ)骨脂和枸杞子配伍可以改善微循環(huán)與血液流變學(xué)，通過降低骨內(nèi)壓來(lái)緩解骨和骨髓血流動(dòng)力學(xué)及其引起的代謝異常〔13〕，更有利于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)；臣藥巴戟天、川牛膝和雞血藤改善軟骨細(xì)胞功能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成，刺激軟骨生發(fā)區(qū)產(chǎn)生大量幼稚軟骨〔14〕，減少或阻斷因關(guān)節(jié)軟骨片丟失引起的滑膜分泌〔15〕；木瓜、丹參是活血化瘀藥可以促進(jìn)關(guān)節(jié)內(nèi)外的血液循環(huán)，改善靜脈瘀滯狀態(tài)，加速血液回流〔16〕。本研究證明補(bǔ)腎固筋方可以有效抑制滑膜炎性改變，減少炎性物質(zhì)對(duì)軟骨和滑膜的侵害；同時(shí)增強(qiáng)滑膜的滲透作用和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代償能力，對(duì)軟骨皸裂、退變和破壞起到一定的延緩作用；補(bǔ)腎固筋方還通過抑制IL-1、TNF-α的分泌來(lái)改善滑膜液性反應(yīng)，修復(fù)并延緩軟骨退變、促進(jìn)軟骨修復(fù)。本研究雖提供了一定的實(shí)驗(yàn)資料闡述了中藥復(fù)方治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，但仍有不足還需從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步探討PGE2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及IL-1之間的相互協(xié)同作用。

1 國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)〔M〕.南京：南京大學(xué)出版社，1999：49-71.

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〔2015-10-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省中醫(yī)藥管理局指導(dǎo)性課題(No.2014172；No.2015107)

張 沖(1976-)，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事骨科、微創(chuàng)骨科臨床科研及教學(xué)研究。

王恒樹(1975-)，男，碩士，副主任技師，主要從事骨科病因病理學(xué)研究。

R274.3

A

1005-9202(2017)05-1079-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.018

1 河北省中醫(yī)院