尹偉力，劉 瑤，倪楊帆，張四化，岳志芹，孫 濤

(1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái) 264000；2.榮成出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東榮成 264300；3.武漢市農(nóng)業(yè)檢測(cè)中心，湖北武漢 430003；4.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430003；5.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山東青島 266000)

傳染性造血器官壞死病毒焦磷酸測(cè)序檢測(cè)技術(shù)的建立

尹偉力1，劉 瑤2，倪楊帆3，張四化4，岳志芹5，孫 濤5

(1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái) 264000；2.榮成出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東榮成 264300；3.武漢市農(nóng)業(yè)檢測(cè)中心，湖北武漢 430003；4.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430003；5.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山東青島 266000)

根據(jù)傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)基因序列，設(shè)計(jì)了IHNV最為保守的指紋序列，以及測(cè)序引物，建立了IHNV焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法。對(duì)所構(gòu)建的IHNV焦磷酸檢測(cè)方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)和靈敏度檢測(cè)。結(jié)果表明，所建立的方法特異性好，在8種魚類病毒中能夠特異性檢測(cè)出目的病毒，檢測(cè)方法靈敏度高，最低檢出核酸量為10 pg/μL。對(duì)建立的焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用研究，選取國(guó)內(nèi)采集與進(jìn)口的魚類樣本共計(jì)80批次進(jìn)行IHNV檢測(cè)。結(jié)果顯示，焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法可以有效的檢出常規(guī)RT-PCR不能檢出的假陰性樣本和弱陽(yáng)性樣本，該方法的靈敏度和特異性可以滿足水生動(dòng)物疫病檢測(cè)的需要。

傳染性造血器官壞死病毒；焦磷酸測(cè)序；檢測(cè)

傳染性造血器官壞死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)是一種能引起魚類急性全身性疾病而造成高死亡率的病毒，尤其會(huì)感染野生鮭魚及養(yǎng)殖鮭魚的幼苗[1-3]。1953年在美國(guó)華盛頓一家水產(chǎn)養(yǎng)殖孵化場(chǎng)的死亡虹鱒魚發(fā)現(xiàn)該病毒[4-5]。在接下來(lái)的幾十年里，該病在加利福尼亞大鱗鮭魚孵化場(chǎng)出現(xiàn)類似的暴發(fā)。起初專家認(rèn)為IHNV僅限于在美國(guó)西北太平洋鮭科魚類流行[6]。然而，該病毒在20世紀(jì)70年代蔓延到歐洲、日本、美國(guó)、韓國(guó)、中國(guó)大陸和中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)，主要通過(guò)船運(yùn)感染IHNV的魚和卵來(lái)傳播[7-8]。

IHNV是影響世界魚類養(yǎng)殖業(yè)的主要病害，如何控制好疫病的暴發(fā)，做好病害防控，成為目前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和進(jìn)出口行業(yè)的重要工作。參照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》[9]及我國(guó)的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]，細(xì)胞培養(yǎng)分離與RT-PCR是目前普遍采用且有效的2種檢測(cè)方法。細(xì)胞培養(yǎng)分離操作復(fù)雜，需要盲傳2代，檢測(cè)周期長(zhǎng)，而RT-PCR必須與測(cè)序聯(lián)合使用才能作為疫病確診的依據(jù)。RT-PCR作為一種常規(guī)的核酸檢測(cè)方法，其操作需要經(jīng)歷核酸提取、核酸擴(kuò)增、瓊脂糖電泳、擴(kuò)增產(chǎn)物回收以及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序5個(gè)階段，全程耗時(shí)3個(gè)～5個(gè)工作日，耗時(shí)較長(zhǎng)。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度低而不能達(dá)到測(cè)序要求時(shí)，測(cè)序?qū)o(wú)法進(jìn)行，進(jìn)而不能對(duì)檢測(cè)到的疑似陽(yáng)性樣品進(jìn)行最終確診。

在實(shí)際檢測(cè)工作中，需要建立一種對(duì)病原體一段很短但是特別保守的片段進(jìn)行測(cè)序方法，這種方法要求快速簡(jiǎn)潔并滿足對(duì)病原體大量檢測(cè)的需要。因焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法能夠短時(shí)間內(nèi)精準(zhǔn)測(cè)出短DNA片段的序列，同時(shí)可以測(cè)96份樣品[11-12]，操作簡(jiǎn)便，能夠形成標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)流程，特別適合水生動(dòng)物疫病病原體的檢測(cè)與確證。本研究以IHNV為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)特異的測(cè)序引物及其指紋序列，優(yōu)化焦磷酸測(cè)序條件，建立特異、準(zhǔn)確的IHNV焦磷酸測(cè)序檢測(cè)技術(shù)體系，為水生動(dòng)物病毒病害的監(jiān)測(cè)和防控提供新的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株核酸 傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、病毒性神經(jīng)壞死病毒(VNNV)和錦鯉皰疹病毒(KHV)核酸，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。鯉春病毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 引物、檢測(cè)探針，寶生物工程(大連)有限公司合成；生物素標(biāo)記通用引物，上海英俊Invitrogen公司合成；dNTP、ExTaqDNA聚合酶混液、One step RT-PCR試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Qiagen DNA提取試劑盒(52906)、Qiagen RNA提取試劑盒(74104)，Qiagen公司產(chǎn)品；Pyro SQA Reagents DNA序列分析試劑盒(96次)、鏈霉親和素包被磁珠，北京基因有限公司產(chǎn)品。

Qiagen PYROMARKID焦磷酸測(cè)序儀；PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-8C)，北京六一廠產(chǎn)品；凝膠成像儀(G-BOX-EF)，天能公司產(chǎn)品；紫外燈觀察箱(Icm-26)，上海路陽(yáng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)序指紋序列的確定及測(cè)序引物設(shè)計(jì) 選取IHNV較為保守的N基因作為研究對(duì)象。登錄美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心(NCBI)，查詢檢索已公開的IHNV N基因。去除一些信息不全、不完整的序列片段，對(duì)來(lái)自同一地點(diǎn)、同一年份、序列差異極小的毒株，選取其中1株，最后選取的序列號(hào)如下： IHNV N基因序列，登錄號(hào)分別為FJ265710.1、FJ265711.1、FJ265712.1、FJ265713.1、FJ265714.1、FJ265715.1、X89213.1。

用DNA Star 7.1軟件中附帶的Editseq和MegAlign功能，上面找到的序列輸入至軟件中，每個(gè)堿基進(jìn)行比對(duì)。找到IHNV最為保守的20 bp以內(nèi)的一段序列，作為焦磷酸測(cè)序的指紋序列。在指紋序列上、下游設(shè)計(jì)測(cè)序引物。

1.2.2 測(cè)序引物RT-PCR反應(yīng) 按照Qiagen RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取組織樣品或病毒液的RNA。

取2 μL IHNV核酸，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明配置反應(yīng)體系，加入上游測(cè)序引物0.5 μL，標(biāo)記生物素下游測(cè)序引物0.5 μL，DEPC水補(bǔ)足體積至50 μL。PCR儀設(shè)定如下程序：50℃ 30 min；94℃ 5 min，94℃ 30 s，摸索測(cè)序引物的退火溫度，72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

取10 μL RT-PCR產(chǎn)物和1 μL加6×Loadingbuffer混合，在10 g/L瓊脂糖凝膠上以5 V/cm電壓電泳，以標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量作參考，觀察是否擴(kuò)增成功。

1.2.3 焦磷酸測(cè)序反應(yīng) 取50 μL用標(biāo)記生物素的測(cè)序引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，加入200 μg包被了鏈酶親和素的磁珠，室溫孵育20 min，讓磁珠與PCR產(chǎn)物連接。用測(cè)序儀自帶的真空泵工具將連接磁珠的PCR產(chǎn)物吸起，然后用700 mL/L酒精清洗5 s；放入denatureation buffer清洗5 s；用Washing buffer清洗10 s；用真空泵工具將PCR磁珠產(chǎn)物放入反應(yīng)板中，加入測(cè)序引物2 μL，輕輕振搖，釋放磁珠。將待測(cè)物放入80℃烘箱2 min，放置室溫冷卻。

將待測(cè)物放入焦磷酸測(cè)序儀中反應(yīng)，溫度設(shè)置為28℃。每次進(jìn)樣的壓力選擇600 mbar，進(jìn)樣時(shí)間設(shè)置為8 ms，每輪測(cè)序時(shí)間設(shè)置為65 s。測(cè)序引物沿著待測(cè)模板，隨著不同dNTP的加入而擴(kuò)增。每當(dāng)有單個(gè)dNTP結(jié)合，反應(yīng)會(huì)釋放信號(hào)，測(cè)序儀收集信號(hào)，生成測(cè)序峰。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 將IHNV的測(cè)序引物分別與病毒性出血性敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicaemia,VHSV)、流行性造血器官壞死病毒(Epizootic haematopietic necrosis virus,EHNV)、傳染性胰臟壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)、牙鲆彈狀病毒(Hirame rhabdovirus,HRV)、病毒性神經(jīng)壞死病毒(Viral nervous necrosis virus,VNNV)、鯉春病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)和錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)的RNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 將IHNV核酸進(jìn)行10倍倍比稀釋后，采用建立的焦磷酸測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)，并檢測(cè)其靈敏度。

1.2.6 樣本的檢測(cè) 2013年—2015年，采集我國(guó)國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的魚類樣品共計(jì)50批次，進(jìn)口魚樣共計(jì)30批次，每批次采集魚樣本至少30尾，魚品種為大磷大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)、紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大西洋鮭魚(Salmosalar)，樣品為魚苗、幼魚或成魚。取魚樣本的腎、脾、肝、眼、腦等器官。對(duì)于魚苗，取整只魚做為樣品，將組織勻漿，提取RNA，進(jìn)行IHNV焦磷酸測(cè)序檢測(cè)。

取樣本核酸，進(jìn)行IHNV的常規(guī)RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)引物參考OIE《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》(2015版)[9]，將這兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序指紋序列的確定及測(cè)序引物設(shè)計(jì)

IHNV N基因序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)包含558-571位點(diǎn)的核苷酸序列“GGACAGAAGCTCA”高度保守，將其作為標(biāo)準(zhǔn)指紋序列(圖1)。根據(jù)IHNV的指紋序列，設(shè)計(jì)測(cè)序引物(圖2,表1)。

2.2 測(cè)序引物的RT-PCR擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)PCR的變性、退火、延伸溫度和時(shí)間的優(yōu)化，最后確定測(cè)序引物RT-PCR的循環(huán)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s， 54℃ 30s，72℃ 30 s，共循環(huán)30次；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。用所建立的IHNV測(cè)序引物RT-PCR擴(kuò)增IHNV核酸，檢測(cè)結(jié)果均擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶(61 bp,圖3)。

圖1 IHNV的指紋序列

圖2 IHNV N基因引物設(shè)計(jì)結(jié)果

表1 引物設(shè)計(jì)

2.3 焦磷酸測(cè)序結(jié)果

IHNV的RT-PCR產(chǎn)物，經(jīng)焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，所測(cè)序列為“GGACAGAAGCTCA”(圖4)，與預(yù)期的指紋序列一致。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照；2,3.IHNV

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2,3.IHNV

圖3 電泳結(jié)果

Fig.3 The electrophoretic results

圖4 IHNV測(cè)序結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

將IHNV的特異性測(cè)序引物分別與VHSV、EHNV、IPNV、HRV、VNNV、SVCV和KHV的RNA模板進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序，只有與特異性引物相吻合的IHNV RNA模板得到預(yù)期擴(kuò)增片段大小(61 bp，圖5)及相應(yīng)峰型，其余病毒均未得到特異性條帶及和已知序列吻合的峰型，由此鑒定了引物設(shè)計(jì)的特異性。

2.5 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

將IHNV核酸進(jìn)行10倍倍比稀釋后采用該焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著核酸濃度的降低，測(cè)序結(jié)果隨之減少。該方法對(duì)IHNV核酸的最低檢出量達(dá)到 10 pg/μL(圖6)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.IHNV；2.SVCV；3.VHSV；4.EHNV；5.HRV；6.IPNV；7.VNNV；8.KHV；9.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.IHNV;2.SVCV;3.VHSV;4.EHNV;5.HRV;6.IPNV;7.VNNV;8.KHV;9.Negative contol

圖5 IHNV焦磷酸測(cè)序特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.5 The specificity results of the pyrosequencing for IHNV

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.10 ng/μL；2.1 ng/μL； 3.100 pg/μL；4.10 pg/μL；5.1 pg/μL；6.100 fg/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1.10 ng/μL；2.1 ng/μL；3.100 pg/μL；4.10 pg/μL；5.1 pg/μL；6.100 fg/μL

圖6 IHNV 焦磷酸測(cè)序靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

Fig.6 The sensitivity analysis of the pyrosequencing for IHNV

2.6 樣品的檢測(cè)

IHNV陽(yáng)性檢出樣品數(shù)量：焦磷酸測(cè)序檢測(cè)與常規(guī)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相同，共計(jì)14批陽(yáng)性，常規(guī)RT-PCR 12批陽(yáng)性，其中弱陽(yáng)性2批。除1批RT-PCR弱陽(yáng)性樣品外，其余RT-PCR檢出陽(yáng)性樣品均經(jīng)測(cè)序確證為IHNV陽(yáng)性。陽(yáng)性檢出樣品涉及3種被采樣魚品種(表2)。

3 討論

本研究建立了傳染性造血器官壞死病毒的焦磷酸檢測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行了反應(yīng)條件的優(yōu)化。該方法為國(guó)內(nèi)外首次建立IHNV焦磷酸檢測(cè)技術(shù)。

OIE對(duì)于IHNV推薦的檢測(cè)方法為病毒分離與RT-PCR。病毒分離需要建立合適的水生動(dòng)物細(xì)胞系，即使有已經(jīng)構(gòu)建好的細(xì)胞系，還需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代、凍存等操作。在進(jìn)行病毒分離時(shí)，需要將樣品溶液進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種細(xì)胞，觀察7d為1代。如果這一代細(xì)胞沒有出現(xiàn)CPE,則需要盲傳第2代，還需觀察7 d。病毒分離方法總計(jì)需要14 d左右，操作繁瑣，周期較長(zhǎng)，不適合口岸對(duì)大量進(jìn)出境水生動(dòng)物快速檢疫的需求。

表2 IHNV焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法與常規(guī)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表2

編號(hào)№采樣地點(diǎn)/Samplingposition樣品名稱/Name檢測(cè)結(jié)果/Results焦磷酸測(cè)序PyrosequencingRT-PCR編號(hào)№采樣地點(diǎn)/Samplingposition樣品名稱/Name檢測(cè)結(jié)果/Results焦磷酸測(cè)序PyrosequencingRT-PCR39廣州Guangzhou虹鱒Oncorhynchusmykiss--60挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--40廣州Guangzhou虹鱒Oncorhynchusmykiss--61俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--41廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--62俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--42廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--63俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--43廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--64俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--44廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--65俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--45廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss++66俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--46廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss+-67俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--47廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--68俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--48廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--69俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--49廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--70俄羅斯Russia大磷大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha--50廈門Xiamen虹鱒Oncorhynchusmykiss--71加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss+-51挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar++(弱陽(yáng))72加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--52挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--73加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++53挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--74加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++54挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--75加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--55挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--76加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--56挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--77加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss--57挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar++78加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++58挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--79加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++59挪威Norway大西洋鮭魚Salmosalar--80加拿大Canada虹鱒Oncorhynchusmykiss++

對(duì)于RT-PCR來(lái)說(shuō)，由于靈敏度有限及其引物在擴(kuò)增時(shí)可能產(chǎn)生的錯(cuò)配導(dǎo)致的非特異性結(jié)合，檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在假陽(yáng)性、假陰性和非特異性擴(kuò)增，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，OIE和我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序需要送到專門的生物技術(shù)公司，檢測(cè)周期較長(zhǎng)。本研究建立的焦磷酸方法耗時(shí)短，一般3 h～4 h就可以出結(jié)果，并且以具體序列為檢測(cè)結(jié)果，這杜絕了假陽(yáng)性的出現(xiàn)。本研究利用建立的IHNV焦磷酸檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖魚與進(jìn)口魚80份樣本進(jìn)行檢測(cè)，涉及大磷大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)、紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大西洋鮭魚(Salmosalar)等多個(gè)品種，進(jìn)行了IHNV的檢測(cè)，大菱鲆曾經(jīng)在我國(guó)出口魚類養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位，而虹鱒是近些年常有疫病檢出的主要宿主魚。將檢測(cè)結(jié)果與OIE推薦的常規(guī)RT-PCR相比較，結(jié)果可以看出，焦磷酸法對(duì)于常規(guī)RT-PCR的弱陽(yáng)性樣品樣本有明顯的檢出，且檢測(cè)結(jié)果PCR完全一致，因而可以有效的證明，焦磷酸方法的高靈敏度是有效的，避免了假陽(yáng)性檢出。而常規(guī)PCR檢測(cè)檢出的弱陽(yáng)性樣品，由于不能滿足測(cè)序?qū)颖緷舛鹊囊?，因而不能進(jìn)行有效測(cè)序，參照OIE《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》和我國(guó)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，由于不能進(jìn)行有效測(cè)序，因而不能作為疫病陽(yáng)性檢出確診的依據(jù)。焦磷酸測(cè)序方法的核心是設(shè)計(jì)特異性的測(cè)序引物與指紋序列。據(jù)文獻(xiàn)所述[13]，焦磷酸測(cè)序時(shí)，測(cè)序引物5′末端特異性無(wú)嚴(yán)格要求，而3′段需要與目的核酸序列完全互補(bǔ)。本研究所設(shè)計(jì)的測(cè)序引物的5′末端與3′末端DNA熔解溫度(Tm)值一致，因而引物兩端可以同時(shí)與模板結(jié)合，具有一致性，有利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。指紋序列的設(shè)計(jì)需要通過(guò)比對(duì)病毒各個(gè)基因的序列，選擇最為保守的一段序列。因?yàn)榻沽姿釡y(cè)序技術(shù)不能測(cè)過(guò)長(zhǎng)的片段，指紋序列應(yīng)該選擇20 bp以內(nèi)的長(zhǎng)度。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)結(jié)合PCR的靈敏度和DNA測(cè)序技術(shù)的精確度兩方面的優(yōu)勢(shì)，測(cè)序引物與指紋序列高度保守的情況下，對(duì)一段短序列進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果直觀可見，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短，易于推廣應(yīng)用。

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Development of Pyrosequencing Method for Detecting Infectious Hematopoietic Necrosis Virus

YIN Wei-li1,LIU Yao2，NI Yang-fan2， ZHANG Si-hua4，YUE Zhi-qin5,SUN Tao5

(1.YantaiEntry-exitInspectionAndQuarantineBureau,Yantai,Shandong,264000,China;2.RongchengEntry-exitInspectionAndQuarantineBureau,Rongcheng,Shandong,264300,China;3.WuhanTestingCenterForAgriculture,Wuhan,Hubei,430003,China;4.WuhanCenterForAnimalDiseaseControlandPrevention,Wuhan,Hubei,430003,China;5.TechnicalCenterofShandongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao,Shandong,266000,China)

By collecting the sequences of IHNV,the fingerprint sequences and the sequencing primers of the viruse were designed.The pyrosequencing method for detection of IHNV was established successfully.The method has good specificity and sensitivity,and can specifically identify the objective viruses in the eight fish viruses.The method has high sensitivity and the minimum detection limit of nucleic acid is 10 pg/μL.The method was verified by the detection of IHNV in 80 batches of the samples collected from domestic and imported fishes.The results indicated that the pyrosequencing method can effectively detect the false negative and weakly positive samples,which the traditional method RT-PCR cannot detect.The specificity and sensitivity of the method met the requirement for detection of aquatic animal diseases.

Infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV);pyrosequencing;detection

2016-06-25

科技部“十二五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD12B02)

尹偉力(1982-),男，山東煙臺(tái)人，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)學(xué)研究工作。

S854.43

A

1007-5038(2017)03-0043-07