李昆鵬，隋紅，柴政，郭佃磊，張雪云，王香玲，李曦，余麗蕓

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院；3.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所；4.哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院）

新城疫病毒D90毒株抑制人胃癌BGC-823細胞的體外研究

李昆鵬1，隋紅2，柴政3，郭佃磊3，張雪云4，王香玲3，李曦3，余麗蕓1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院；3.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所；4.哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院）

為了探究NDV-D90對BGC-823細胞的抑制作用，通過細胞毒性、腫瘤細胞侵襲和流式細胞術(shù)實驗，來確定新城疫病毒D90毒株（Newcastle disease virus，NDV-D90）對胃癌細胞株BGC-823（低分化）的抑制作用。結(jié)果顯示：NDV-D90能抑制BGC-823細胞的增殖和侵襲，病毒在BGC-823細胞中有很強的復制能力，并且NDV-D90對BGC-823細胞主要造成壞死并伴隨著少量的凋亡。

新城疫病毒D90毒株；胃癌BGC-823細胞系；凋亡；壞死

人胃癌細胞系有很多，根據(jù)分化程度不同[1-2]和分離地點不同，有以下細胞系：BGC-823細胞系，SGC-7901細胞系，MGC-803細胞系，MKN-28細胞系，MKN-1細胞系，MKN-45細胞系，MKN-74細胞系等。其中BGC-823為低分化的胃癌細胞系，惡性程度很高。很多人對BGC-823細胞凋亡作用做了深入研究，王旭等應用HE染色和流式細胞術(shù)等實驗發(fā)現(xiàn)：丹參酮ⅡA能誘導BGC-823細胞發(fā)生凋亡，抑制其增值，并且改變其凋亡形態(tài)[3]。Wei Liu等發(fā)現(xiàn)藤黃酸也具有使BGC-823細胞發(fā)生凋亡的作用及抗腫瘤效果[4]。徐立春等用流式細胞術(shù)法、FITC-AnnexinV與PI雙染法、AO/EB雙熒光染色及熒光顯微鏡、MTT等實驗方法，證明莪術(shù)醇能抑制BGC-823細胞生長并在此過程中發(fā)生凋亡[5]。也有研究報道，用熊果酸、復康辛、牡蠣天然活性肽、冬凌草甲素、奧沙利鉑聯(lián)合培美曲塞及二烯丙基二硫等均能誘導BGC-823細胞增殖且抑制其生長[6-11]。

目前，具有溶瘤作用的病毒被發(fā)現(xiàn)了很多。這些病毒包括腺病毒、狂犬病病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒、呼腸孤病毒（reovirus）和新城疫病毒[12]。新型天然溶瘤病毒M1屬甲病毒屬，也具有溶瘤作用[13]。

溶瘤病毒是指能夠特異性識別并感染腫瘤細胞，并在腫瘤細胞中大量、快速復制一類病毒[14]。溶瘤病毒能特異性的識別腫瘤細胞并在腫瘤細胞中復制，最終使腫瘤細胞破碎裂解，但是在正常組織細胞中不復制。溶瘤病毒的這個特點使溶瘤病毒具有成為一種理想生物治療腫瘤的安全抗腫瘤試劑。

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種重要的溶瘤病毒[15]，新城疫病毒由6種病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別是L、NP、P、HN、F、M蛋白，其中融合蛋白（F）和血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）是主要的保護性抗原，在致病過程中起到重要的作用[16]。雞新城疫病毒作為一種溶瘤試劑具有悠久的歷史。NDV可有選擇性地在腫瘤細胞中增殖并起到特異殺傷作用[17]，NDV在人類癌細胞中的復制效率是在正常細胞中的10 000倍[18-20]。目前研究可用于治療人類腫瘤的NDV包括溶瘤型毒株MTH68/H、PV-701和73-T，非溶瘤型病毒株Ulster，弱毒株HUJ（OV001）[21]。新城疫病毒的毒株和毒力不同，對癌細胞產(chǎn)生的殺傷作用也有很大的區(qū)別。幾個臨床試驗證明雞新城疫病毒是一種高效、安全的治療腫瘤的試劑。對人基本無致病性，除了輕微的流感樣癥狀和結(jié)膜炎。NDV與胃癌的研究可以追溯到上世紀，尤其在1950～1960年之間，應用溶瘤病毒的抗腫瘤的作用得到了更深入的研究。1912年，DePace[22]發(fā)現(xiàn)了狂犬病病毒具有使抑制子宮頸癌的能力，科學家們從此開始研究溶瘤病毒，并挖掘出了多種溶瘤病毒。1950年，Sinkovics研究證明新城疫病毒對腫瘤細胞具有細胞毒性[22]，之后科學家認識到可以利用溶瘤病毒來攻克癌癥疾病的困擾。

2006年，符芳等證明NDV-D90對肺癌A549細胞有很好的抑制能力[24-25]。2014年，張春曉等證明了NDV-D90具有抑制口腔鱗癌細胞系遷移和侵襲的能力[26]。2014年，張增嶺等證明NDV-D90對乳腺癌MCF-7細胞具有抑制作用[27]。NDV-D90對多種細胞具有抑制作用，為了進一步探究NDV-D90是否對人胃癌BGC-823細胞也具有抑制作用，研究NDV-D90對人胃癌BGC-823細胞系體內(nèi)外的抑制能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞

病毒：NDV-D90毒株來自于中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

細胞：BGC-823細胞采購自中國細胞系資源庫上海細胞庫。

1.1.2 主要儀器及試劑

流式細胞儀：FACS Aria BD公司，美國；青、鏈霉素（10 000 U·mL-1），PBS緩沖液，0.25%含EDTA胰蛋白酶，0.25%無EDTA胰蛋白酶國產(chǎn)。RPMI1640，胎牛血清：Hyclone公司，美國。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑購買于KeyGEN公司，Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自DOJINDO。BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber購自BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞胚擴繁NDV-D90病毒

采用9～11日齡的無特定病原（Specific pathogen free，SPF）雞胚5個，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。在超凈工作臺中，將NDV-D90病毒連續(xù)10倍稀釋6次，取10-6倍稀釋的NDV-D90病毒稀釋液100 μL，注射雞胚的尿囊腔內(nèi)。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，無菌操作吸取尿囊液（如果有沉淀，則10 000 rpm·min-1離心5 min），測定病毒液的TCID50，-70℃保存，備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

在液氮罐中取出凍存的BGC-823細胞，放入含有37℃水的燒杯中，細胞凍存液融化后，將細胞吸入無菌Ep管中。在離心機中瞬離，去掉細胞凍存液。將BGC-823細胞接種于含有1%青-鏈霉素10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。在含有5%CO2，溫度為37℃，飽和水分的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁率為80%～90%時傳代一次（約2 d）。

1.2.3 NDV-D90致BGC-823細胞病變

首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌細胞。將胃癌細胞以105個/孔接種于6孔板，待細胞長滿加入MOI為0.01的NDV-D90，在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱感作1 h。棄去病毒液，加入2 mL的2%FBS的RPMI-1640細胞維持液。隨時觀察細胞病變的情況。

1.2.4 病毒含量的測定

首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌細胞。將胃癌細胞以105個/孔接種于6孔板，待細胞長滿加入MOI為0.01的NDV-D90，在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱感作1 h。棄去病毒液，加入2 mL的2%1 640細胞維持液。每12 h收取一孔細胞（共6次）及上清。1 000 rpm·min-1離心5 min，留上清。則病毒感染細胞的時間分別為12、24、36、48、60和72 h。測病毒感染細胞不同時間點，上清液中病毒的含量。用TCID50·0.1 mL-1表示病毒的含量。該實驗重復3次。

1.2.5 病毒在BGC-823細胞中的增殖能力分析

首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌細胞。將胃癌細胞以105個/孔接種于6孔板，待細胞長滿加入MOI為0.01的NDV-D90，在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱感作1 h。棄去病毒液，加入2 mL的2%FBS的RPMI-1640細胞維持液。每12 h收取一孔細胞（共6次）及上清。1 000 rpm·min-1離心5 min，留上清。則病毒感染細胞的時間分別為12、24、36、48、60和72 h。測病毒感染細胞不同時間點，上清液中病毒的含量。用TCID50·0.1-1mL表示病毒的含量。該實驗重復3次。

1.2.6 NDV-D90對BGC-823細胞的毒性檢測

用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測NDV-D90對BGC-823細胞的細胞毒性，具體步驟如下：

（1）用100 μL排槍吸取細胞懸液放入96孔板中，使加入細胞的量為5×104個。將96板放在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)。

（2）待細胞長滿加入病毒感染復數(shù)（multiplicities of infection，MOI=病毒顆粒/腫瘤細胞）分別為0.001，0.01，0.1，1和10的NDV-D90，在含有5% CO2，溫度為37℃，飽和水分的培養(yǎng)箱中感作1 h，對照組不加病毒感作。換2%RPMI-1640細胞維持液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)孵育12、24、36、48、60和72 h。每孔設3個復孔。

（3）待孵育時間完成后向待測孔中加入10 μL CCK-8溶液，加入的過程中不要產(chǎn)生氣泡（若有氣泡，用棉簽去除），否則會影響OD值的讀數(shù)。

（4）將細胞培養(yǎng)板放入37℃，飽和水分的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。

（5）用酶標儀測定細胞培養(yǎng)板在450 nm處的吸光度值，并計算分析。

（6）細胞存活率（%）=[A（加病毒）-A（空白）]/[A（未加病毒）-A（空白）]×100

A（加病毒）：含有病毒溶液、CCK溶液和細胞的孔的吸光度值

A（空白）：只含有CCK溶液和培養(yǎng)基而沒有細胞的孔的吸光度值

A（未加病毒）：只含有細胞、CCK溶液孔的吸光度值。

1.2.7 腫瘤細胞侵襲實驗

用0.25%含EDTA胰酶消化收集胃癌細胞。胃癌細胞以1×106/孔接種于6孔板，待細胞長滿后加入NDV-D90（MOI=0和0.1）在37℃，飽和水分的5% CO2培養(yǎng)箱感作1 h。應用BD公司的的24孔板侵襲小室，該小室包被一層薄的細胞外基質(zhì)并由8 μm聚乙烯膜封閉。消化法從6孔板中獲取經(jīng)NDV-D90處理的胃癌細胞和未經(jīng)病毒處理的胃癌細胞，用含1% FBS培養(yǎng)基洗滌3次（1 000 rpm·min-1，5min）。用含有1%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞調(diào)整至5× 104個·mL-1。上室加200 μL細胞懸液，下室加入750 μL細胞RPMI-1640培養(yǎng)基，含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，10%的FBS作為化學吸引物，37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱孵育14 h。吸掉上室中的培養(yǎng)基，將侵襲小室移到無培養(yǎng)基的24孔板中，用無菌的PBS緩沖液清洗2～3次。上室中加入250 μL的50 μM的Calcein-AM溶液，下室中加入750 μL的50 μM的Calcein-AM溶液。在37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育15～30 min。用PBS緩沖液洗滌細胞2次。在綠光為激發(fā)光的熒光倒置顯微鏡上觀察細胞。隨機選取3個視野進行細胞計數(shù)并保存圖片。該實驗重復2次。

1.2.8 流式細胞術(shù)

用不含EDTA的胰酶（EDTA對實驗有影響，容易造成假陽性）消化收集胃癌細胞。將胃癌細胞以4× 105個每孔接種于12孔板，放入37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長成單層后，吸去培養(yǎng)基分別加入不同MOI值的NDV-D90（MOI=0，0.01，0.1和1）在37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中感作1 h，棄去病毒稀釋液，加入2%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基，放入37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24、48和72 h收取細胞。在每個時間點，用不含EDTA胰酶消化收集一孔細胞，重懸于PBS緩沖液中，收集細胞大于等于1×104個。

流式上機具體操作步驟如下：

（1）用無菌預冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5 min）。

（2）加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。

（3）加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻。避光、室溫反應10 min。

（4）加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，冰上備用。

陰性對照及Annexin V和PI的補償實驗操作步驟如下：

（1）陰性對照：取正常（未經(jīng)病毒處理）細胞約105個，用無菌預冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5min）。加入500 μL 1×Binding Buffer。冰上備用。

（2）Annexin V補償：取正常（未經(jīng)病毒處理）細胞約105個，在60℃水浴鍋水浴6 min（不同的細胞水浴的時間不同）。取出細胞用無菌預冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5 min）。加入100 μL 1× Binding Buffer重懸細胞。加入5 μL·Annexin VFITC Staining Solution，避光、室溫反應10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻。冰上備用。

（3）PI補償：取正常（未經(jīng)病毒處理）細胞約105個，在60℃水浴鍋水浴6 min（不同的細胞水浴的時間不同）。取出細胞用無菌預冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5min）。加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。加入5 μL·PI Staining Solution，避光、室溫反應10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻。冰上備用。

以上操作皆盡量在冰上操作。利用FACS can流式細胞儀（USA）分析技術(shù)檢測細胞凋亡情況。以碘化丙啶（PI）染色陰性，膜連蛋白（Annexin V）染色陽性為早期凋亡細胞。以碘化丙啶（PI）染色陽性性，膜連蛋白（Annexin V）染色陽性為晚期凋亡細胞。以碘化丙啶（PI）染色陽性，膜連蛋白（Annexin V）染色陰性為死細胞。以碘化丙啶（PI）染色陰性，膜連蛋白（Annexin V）染色陰性為正常的活細胞。重復該實驗3次。

2 結(jié)果

2.1 BGC-823細胞病變

BGC-823細胞對NDV-D90病毒敏感，接入MOI=0.01的病毒24 h后，細胞出現(xiàn)合胞體結(jié)構(gòu)，如圖1所示，有明顯的CPE產(chǎn)生。

圖1 BGC-823細胞病變Fig.1BGC-823 cell’s CPE

2.2 病毒含量測定

圖2 NDV-D90病毒在BGC-823細胞中增殖曲線Fig.2 NDV-D90 virus multiplication in BGC-823 cell

用MOI為0.01的NDV-D90感染BGC-823細胞，將96孔板放置于酶標儀上，在OD450nm掃描分析存活細胞數(shù)，分析處理得到的數(shù)據(jù)繪制如圖2所示。用TCID50·0.1-1mL表示病毒的滴度。如圖2中，NDV-D90在BGC-823細胞中，12 h開始增殖。12～60 h持續(xù)增殖，并且在60 h時增殖到最大，達到1010個TCID50·0.1-1mL。因此，NDV-D90病毒可在BGC-823細胞中大量復制。

2.3 細胞毒性檢測

用不同MOI的NDV和不同的感染時間處理BGC-823細胞，在OD450nm掃描分析存活細胞數(shù)。去掉背景后，用實驗組OD值/對照組OD值表示細胞存活率。分析處理得到的數(shù)據(jù)繪制如圖3所示：BGC-823細胞經(jīng)不同MOI值的NDV-D90病毒處理，MOI分別是0.001，0.01，0.1，1和10，在12、24、36、48、60和72 h檢測細胞的存活率。NDV-D90病毒對BGC-823細胞有強的殺傷能力。隨著MOI值的增大，出現(xiàn)BGC-823細胞死亡的時間越快，存活率越低。在MOI為0.001，0～24 h時，細胞出現(xiàn)了少量增殖的情況，在40 h后出現(xiàn)明顯的凋亡。當MOI為0.01，0～24 h時，BGC-823細胞出現(xiàn)了少量增殖的情況，在40 h后出現(xiàn)明顯的凋亡。當MOI為0.1，0～24 h時，BGC-823細胞也出現(xiàn)了少量增殖，在24～72 h出現(xiàn)明顯的凋亡，細胞的存活率下降。當MOI為1，0～24 h時，BGC-823細胞增殖不明顯，在12～36 h時明顯快速的凋亡。當MOI為1，0～72 h時，BGC-823細胞未出現(xiàn)增殖，在12～36 h時明顯快速的凋亡。并且無論MOI值為多少，最后的細胞存活率趨于一致。因此得到結(jié)論：病毒的MOI值越高，對BGC-823細胞的抑制能力越強。

圖3 NDV-D90對BGC-823細胞的細胞毒性分析Fig.3The BGC-823 cell viable assay

2.4 細胞侵襲實驗

腫瘤細胞侵襲實驗，侵襲指數(shù)（invasion index）=實驗組穿過細胞數(shù)/對照組穿過細胞數(shù)。如圖4中A和B所示，經(jīng)NDV-D90處理BGC-823細胞穿過細胞外基質(zhì)和8 μm膜的細胞數(shù)量少，未經(jīng)過NDVD90處理的BGC-823細胞穿過膜的細胞數(shù)多。

圖4 腫瘤細胞侵襲實驗Fig.4Tumor invasion assay

2.5 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)分析不同的MOI值和不同的病毒感染時間，對不同細胞凋亡發(fā)生的凋亡進行分析。左上限（Q1區(qū)）為死細胞，左下限（Q3區(qū)）為正常的活細胞，右上限（Q2區(qū)）為晚期凋亡細胞（死亡細胞），右下限（Q4區(qū)）為早期凋亡細胞。

如圖5中所示，Annexin-V單染出現(xiàn)在Q3區(qū)和Q4區(qū)，Annexin-V單染的半數(shù)細胞凋亡可以用。PI單染出現(xiàn)在Q2和Q4區(qū)，PI單染的半數(shù)細胞凋亡可以用。在不同的MOI感染組中，隨著病毒感染BGC-823細胞的時間的延長，細胞發(fā)生死亡越來越多。細胞死亡率等于細胞凋亡率加上細胞壞死率。如圖6、7、8所示，Control組中，24 h，48 h，72 h對應的死亡率分別是5.8±0.2%，6.3±3.1%，8.4±0.7%。死亡率增加的不明顯，幾乎沒有變化。在MOI=0.01組中，24 h，48 h，72 h對應的死亡率分別是5.3±1.1%，26.3± 1.3%，50.1±3.1%。隨著病毒感染細胞時間的增長，BGC-823細胞的死亡率明顯增加。在72 h死亡率達到最高，為50.1±3.1%。在MOI=0.1組中，24 h，48 h，72 h對應的死亡率分別是14.9±0.3%，58.4±3.9%，74±3.5%。隨著病毒感染細胞時間的增長，BGC-823細胞的死亡率明顯增加，在72 h時，細胞的死亡率已經(jīng)達到74±3.5%。在MOI=1組中，24 h，48 h，72 h對應的死亡率分別是18.1±1.5%，74±2.6%，79±8.2%。隨著病毒感染細胞時間的增長，BGC-823細胞的死亡率明顯增加，在72 h時，細胞死亡率已經(jīng)達到79± 8.2%。如圖9所示，在24 h組中，隨著MOI值的增加，細胞的死亡率也增加。在48 h組中，細胞的死亡率也隨著MOI值的增大而增加。在72 h組中，細胞的死亡率也隨著MOI值的增大而增加。MOI值越大，細胞發(fā)生死亡越快，越多。

圖5 流式未染色組、Annexin V-FITC單染和PI單染組Fig.5The control group，the Annexin V-FITC single staining and PI single staining

圖6 BGC-823細胞流式圖Fig.6The BGC-823 cell flow chart

NDV-D90處理BGC-823細胞以不同的MOI值感染時間為24 h，PI和Annexin-V雙染法FACS檢測細胞死亡率。

NDV-D90處理BGC-823細胞以不同的MOI值感染時間為48 h，PI和Annexin-V雙染法FACS檢測細胞死亡率。

NDV-D90處理BGC-823細胞以不同的MOI值感染時間為72 h，PI和Annexin-V雙染法FACS檢測細胞死亡率。

圖7 BGC-823細胞流式圖Fig.7The BGC-823 cell flow chart

圖8 BGC-823細胞流式圖Fig.8The BGC-823 cell flow chart

3 討論

新城疫病毒是溶瘤病毒的成員之一，新城疫病毒具有抑瘤效果首次報道于1955年。從此，對新城疫病毒抑制腫瘤的研究越來越多。新城疫病毒有多種不同的毒株，不同的新城疫毒株具有不同的溶瘤效果。溶瘤型的新城疫毒株有MTH68/H、PV-701和73-T，非溶瘤型的新城疫毒株有Ulster，弱毒株HUJ[28]。其中MTH68/H和PV-701已經(jīng)應用到了臨床Ⅰ期。

圖9 BGC-823細胞死亡率與感染時間的關(guān)系Fig.9Relationship of BGC-823 cell death rate and infection time

NDV-D90毒株是新分離出來的溶瘤病毒，符芳等證明NDV-D90對肺癌A549細胞有很好的抑制能力[24-25]。NDV-D90能使BGC-823細胞產(chǎn)生合胞體結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)明顯的CPE。NDV-D90可在BGC-823細胞中大量增殖，病毒的最高滴度達到1010TCID50/0.1 mL。NDV-D90對BGC-823細胞有很強的細胞毒性，病毒感染時間越長，細胞的存活率越低。細胞的最低存活率達到18.5%。MOI越大，細胞凋亡出現(xiàn)的越快，細胞的存活率越低。在MOI為10時，BGC-823細胞一直處于抑制生長狀態(tài)，逐漸開始凋亡。MOI為0.01時，細胞剛開始出現(xiàn)了少量增長，然后出現(xiàn)了凋亡，并且與MOI為10時的細胞存活率相等，說明MOI值低的時候，病毒出現(xiàn)了大量復制，導致了低的MOI值也和高MOI值有相似的殺傷力。這也間接地說明了NDV-D90在BGC-823細胞復制能力很強。流式細胞術(shù)測得細胞的最大凋亡率為80%左右，且細胞的凋亡率隨著MOI的增大和感染時間的增長而變高，此結(jié)果與細胞毒性實驗結(jié)果一致。一般惡性腫瘤細胞具有侵襲轉(zhuǎn)移和遷移的能力。在侵襲轉(zhuǎn)移和遷移的過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶類（matrix metalloproteinases，MMPs）具有重要作用。MMPs能分解細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM），使細胞更容易從組織中轉(zhuǎn)移其他臟器及對周圍組織發(fā)生侵襲[29]。惡性腫瘤細胞能大量表達MMP-2和MMP-9，使腫瘤細胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。在腫瘤細胞侵襲實驗中，在侵襲小室中加入人工的ECM，觀察BGC-823細胞能穿過侵襲小室8 μm孔的細胞數(shù)，來說明NDV-D90對BGC-823細胞的抑制作用。經(jīng)NDV-D90處理的腫瘤與對照組相比，侵襲過8 μm孔的細胞數(shù)量明顯減少。以上數(shù)據(jù)都說明NDV-D90對人胃癌BGC-823細胞具有高效的殺傷能力且能抑制BGC-823發(fā)生侵襲。

隨著科學的進步，應用新城疫治療腫瘤的方法主要分為三類：一是單獨使用NDV作為抗腫瘤試劑，如MTH68/H和PV-701。此種方法已經(jīng)應用到了臨床Ⅰ期，初見成效。二是應用NDV與化學藥物聯(lián)合治療，如紫杉醇等。這樣可以減少副作用和用藥成本[30]。三是以NDV為基因載體，表達外源基因。如IL-2，IL-6，IFN-β，TNF-α等。

4 結(jié)論

NDV-D90對胃癌BGC-823細胞系具有高效殺傷和抑制其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的能力。在未來，NDV-D90可能成為一種重要的溶瘤制劑，用于解除胃癌患者的困擾。

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The Inhibition Effect of Newcastle Disease Virus D90 Strain on Human Gastric Cancer Cell BGC-823 in Vivo

Li Kunpeng1，Sui Hong2，Chai Zheng3，Guo Dianlei3，Zhang Xueyun4，Wang Xiangling3，Li Xi3，Yu Liyun1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；
2.Harbin Medical University Cancer Hospital；3.Harbin Veterinary Research Insitute，Chinese Academy of Agricultural Sciences；4.College of Life Science and Technology，Harbin Normal University）

In order to research the inhibition effect of the NDV-D90 on the cell BGC-823，the cytotoxicity test，tumor invasion assay and flow cytometry were performed.These studies showed that the strain NDV-D90 cells inhibited the replication and proliferation of BGC-823.The virus could replicate in the cell BGC-823.The NDV-90 mainly caused the BCG-823 necrosis and a small amount of apoptosis.

NDV D90 strain；Gastric cancer BGC-823 cell line；apoptosis；necrosis

S482

A

1002-2090（2017）01-0074-09

2015-11-16

黑龍江省自然科學基金（QC2012C011）。

李昆鵬（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院2012級碩士研究生。

余麗蕓，女，教授，碩士研究生導師，E-mail：xly_hou@yahoo.com.cn。