馬致潔+李奇+趙奎君+王伽伯++肖小河

[摘要]該文采用液相色譜質(zhì)譜方法測(cè)定服用何首烏大鼠的血清代謝指紋譜，同時(shí)利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法比較代謝譜差異并篩查顯著相關(guān)的生物標(biāo)志物，考察其動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。探討何首烏致大鼠肝臟損傷的代謝組學(xué)動(dòng)態(tài)變化，尋找其顯著相關(guān)的生物標(biāo)志物，并考察標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，以期為何首烏致肝損傷的內(nèi)在機(jī)制與臨床早期診斷提供依據(jù)。結(jié)果顯示給藥后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠的血清代謝輪廓存在一定的差異，經(jīng)比較分析，共篩選得到6個(gè)潛在生物標(biāo)志物：oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol 和 7ahydroxydehydroepiandrosterone，這些標(biāo)志物在何首烏致肝損傷動(dòng)態(tài)過程中呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。所篩選到的生物標(biāo)志物在給藥1周后含量即出現(xiàn)明顯變化，相比于ALT，AST來說更加敏感。一定程度上可揭示出何首烏造成肝損傷的動(dòng)態(tài)機(jī)制以及肝臟自我修復(fù)表現(xiàn)，對(duì)于監(jiān)測(cè)服用何首烏患者肝功能、早期發(fā)現(xiàn)何首烏肝損傷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和意義。

[關(guān)鍵詞]何首烏； 肝損傷； 代謝組學(xué)； 動(dòng)態(tài)變化； 早期診斷； 內(nèi)在機(jī)制

近年來，中藥引發(fā)的肝損傷事件較為頻繁，尤其是一些傳統(tǒng)不認(rèn)為是有毒的中藥如何首烏、決明子、大黃、柴胡、麻黃等的肝毒性問題日益突出[12]。何首烏始載于《開寶本草》，生何首烏性平，味甘、苦，歸心、肝、大腸經(jīng)；具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便的功效。制何首烏性微溫，味甘、澀，歸肝、腎經(jīng)；具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂等功效，含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣質(zhì)、磷脂和多糖等多種化學(xué)成分[3]。何首烏是傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，與人參、靈芝和冬蟲夏草并列為祖國(guó)“四大仙草”。而關(guān)于何首烏肝毒性的頻發(fā)趨勢(shì)更是愈演愈烈，檢索知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫2005年至2014年10年間共有183例關(guān)于何首烏肝毒性的報(bào)道。近年來，國(guó)內(nèi)外不斷有文獻(xiàn)報(bào)道因服用生、制何首烏或含何首烏相關(guān)制劑而導(dǎo)致黃疸、肝炎和肝功能異常等患者[45]。以至于2014年度國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品不良反應(yīng)中心公開通報(bào)口服何首烏及其成方制劑引起的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，并要求相關(guān)廠家根據(jù)品種實(shí)際和不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)情況完善藥品說明書的安全性信息等。

然而，何首烏致肝損傷的機(jī)制目前尚不明確，對(duì)其引發(fā)肝損傷的動(dòng)態(tài)過程也缺乏有效的數(shù)據(jù)，因此導(dǎo)致臨床上辨識(shí)和診斷較為困難。課題組前期對(duì)何首烏致肝損傷進(jìn)行了系列研究，臨床流行病學(xué)數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，何首烏致肝損傷與患者服藥劑量、時(shí)間、性別、年齡均缺少明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，具有特異質(zhì)屬性[6]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)何首烏本身也存在潛在肝毒性，為了充分暴露何首烏潛在毒性，前期課題組采用大劑量何首烏醇提物，考察其對(duì)大鼠多臟器的損傷作用，結(jié)果從組織病理上可以看出何首烏大劑量提取物對(duì)肝臟有明顯的損傷作用，但臨床常用的ALT，AST轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)并無顯著變化[7]。鑒于此，本文采用課題組前期實(shí)驗(yàn)的血清標(biāo)本，對(duì)何首烏致肝損傷的大鼠進(jìn)行動(dòng)態(tài)血清代謝組學(xué)研究，旨在描述何首烏造成肝損傷的動(dòng)態(tài)過程，運(yùn)用代謝組學(xué)的方法尋找動(dòng)態(tài)變化的生物標(biāo)志物，初步探討何首烏致肝損傷的體內(nèi)代謝機(jī)制，以期為臨床何首烏肝損傷的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供一定的依據(jù)，為臨床何首烏致肝損傷的臨床早期診斷提供輔助參考。

1材料與方法

11儀器與試劑高效液相色譜（Agilent 1200 HPLC，美國(guó)Agilent公司）四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Bruker microTOFQⅡ，德國(guó)Bruker公司），DataAnanlsis 工作站，Gradient A10 MillQ超純水器（法國(guó)Millipore公司），邁瑞B(yǎng)S300全自動(dòng)生化分析儀（上海富眾生物科學(xué)有限公司），冷凍離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)），微量分析天平（Mettler Toledo AL204 瑞士），渦旋混勻器（HYQ 2121A）。生首烏購(gòu)于北京綠野藥業(yè)有限公司（批號(hào)10050904），經(jīng)解放軍第三〇二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥塊根；甲醇（色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司）；去離子水經(jīng)（182 MΩ） Millipore MilliQ 系統(tǒng)（Millipore Co，美國(guó)） 超純水器凈化，其他試劑均為市售分析純。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測(cè)試劑盒（南京建成科技有限公司）。

12動(dòng)物SD大鼠，SPF級(jí)，體重160 g左右，雄性，共12只，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK軍2007004。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障動(dòng)物房，室溫（20±2） ℃，相對(duì)濕度60%～70%，通風(fēng)良好、環(huán)境安靜，室內(nèi)保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。

13試藥將生何首烏粉碎得粗粉，加6倍量的75%乙醇冷浸提取，共提取5次，每次48 h，合并醇浸提取液，濃縮并減壓干燥，制得干粉備用。每次給藥前按配制藥液，水浴加熱至37 ℃時(shí)使用。

14樣本收集給藥劑量為40 g·kg-1，按每200 g體重5 mL灌胃給藥，連續(xù)給藥28 d（4周）以制備肝損傷大鼠模型。給藥期間大鼠自由飲食，每日觀察給藥前后每只動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)、毛發(fā)變化、大小便形狀、顏色及有無異常分泌物等。給藥期間每7 d大鼠眼眶取血，分離血清后置于-80 ℃冰箱。

15樣品預(yù)處理與LCMS/MSQTOF檢測(cè)樣品預(yù)處理：將大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，復(fù)融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混勻，靜置，4 ℃下冷凍離心（1萬 r·min-1，10 min），取上清，并用022 μm微孔濾膜濾過，備用。

LCMS/MSQTOF檢測(cè)：采用Agilent ZORBAX SBC18（21 mm×150 mm，5 μm）色譜柱；柱溫25 ℃，流速025 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL，樣品溫度4 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)420 nm；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：水；梯度洗脫（0～5 min：甲醇30%～90%；5～51 min：甲醇90%；51～40 min：甲醇90%～30%）；離子源ESI±；毛細(xì)管電壓3 500V；相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)50～1 000；碰撞能7 eV；錐孔能5 eV；脫溶劑氣流量60 L·min-1；脫溶劑氣溫度180 ℃。

16數(shù)據(jù)處理與分析將所測(cè)數(shù)據(jù)采用DataAnalysis和Mzmine軟件進(jìn)行色譜峰識(shí)別，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP 11軟件，標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別（PLSDA）分析。運(yùn)用variable influence in the projection（VIP）方法來預(yù)測(cè)各個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)模型的貢獻(xiàn)值，VIP>1說明具有明顯的貢獻(xiàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為可能的潛在標(biāo)志物。再采用OneWay ANOVA的方法，根據(jù)P<005的原則，排除沒有顯著性差異的數(shù)據(jù)。最后在Human Metabolome Database，KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行匹配，并用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定位后，最終得到潛在的生物標(biāo)志物。

2結(jié)果

2結(jié)果

21何首烏致肝損傷大鼠的動(dòng)態(tài)血清PCA主成分分析本實(shí)驗(yàn)連續(xù)給藥4周，經(jīng)PCA分析各周大鼠的血清代謝物，結(jié)果表明：從第1周到第4周，大鼠血清代謝物呈現(xiàn)順時(shí)針的變化趨勢(shì)，也就是說何首烏擾亂了大鼠的體內(nèi)代謝平衡，從第1周的輕微擾亂到第4周的嚴(yán)重?cái)_亂，同時(shí)也體現(xiàn)出大鼠體內(nèi)生物代謝發(fā)生紊亂，從而反映到代謝物的不斷變化水平上。

22何首烏致肝損傷大鼠的動(dòng)態(tài)血清PLSDA分析為了進(jìn)一步闡明何首烏肝損傷大鼠血清代謝物的變化，本文在PCA模型基礎(chǔ)上擬合偏最小二乘法判別分析（PLSDA）模型，旨在發(fā)現(xiàn)各周大鼠血清之間的差異，以尋找引起肝損傷變化的因素。PLSDA分析也表明各周大鼠血清的代謝物呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，同時(shí)也反映出何首烏肝損傷大鼠體內(nèi)代謝的紊亂程度以及變化情況。從載荷圖中可以看出：圖中每一個(gè)“”代表一種代謝□給藥1周后；給藥2周后；給藥3周后；*給藥4周后。

物，其距離中心越遠(yuǎn)，說明該代謝物在各周大鼠中的差異性越大，也就是說此代謝物可能是何首烏導(dǎo)致大鼠發(fā)生肝損傷的生物標(biāo)志物，其隨著肝損傷的不斷惡化而相應(yīng)改變，在微觀水平上體現(xiàn)何首烏肝損傷大鼠體內(nèi)代謝的紊亂以及變化趨勢(shì)；再者，通過結(jié)合VIP變量權(quán)重分析，可以看出大鼠血清中的生物標(biāo)志物的變量權(quán)重，變量權(quán)重越大，說明該標(biāo)志物在各周大鼠血清之間的差異性也越大（圖4）。一般意義上認(rèn)為VIP>1為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該物質(zhì)對(duì)模型的構(gòu)建具有顯著的貢獻(xiàn)。本文則選取VIP>2的物質(zhì)作為潛在的生物標(biāo)志物，旨在發(fā)現(xiàn)與何首烏致肝損傷大鼠動(dòng)態(tài)血清變化高度相關(guān)的生物標(biāo)志物，同時(shí)也探索與肝損傷嚴(yán)重程度高度相關(guān)的生物標(biāo)志物。圖2何首烏致肝損傷大鼠的動(dòng)態(tài)血清PLSDA分析

23何首烏致肝損傷大鼠的動(dòng)態(tài)血清生物標(biāo)志物篩查通過檢索人類代謝物數(shù)據(jù)庫（HMDB），發(fā)現(xiàn)與何首烏肝損傷大鼠動(dòng)態(tài)血清變化（1～4周）內(nèi)顯著相關(guān)的6個(gè)生物標(biāo)志物，具體為oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol 和 7ahydroxydehydroepiandrosterone。這6個(gè)生物標(biāo)志物的VIP值均在20以上，且在各周大鼠的血清中呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)（表1）。如oleamide在第1周時(shí)含量最高，但從第2周時(shí)開始迅速下降；lysoPC（16∶0）從第2周時(shí)迅速升高，第3周時(shí)則出現(xiàn)明顯下降，第4周仍處于下降趨勢(shì)（圖5）。由此可見，何首烏致肝損傷大鼠在第1周到第4周時(shí)其中的標(biāo)志物呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，何首烏在引發(fā)大鼠肝損傷的過程中血清代謝物呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，但是常規(guī)肝功指標(biāo)ALT和AST對(duì)于何首烏引發(fā)的肝損傷不敏感，本實(shí)驗(yàn)中大鼠分別給予何首烏4周后ALT和AST未見明顯升高，而僅在第3天生首烏組一過性升高[7]，ALT和AST對(duì)何首烏引發(fā)的肝損傷不敏感，無法進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)。而本文動(dòng)態(tài)代謝組學(xué)研究表1何首烏致肝損傷大鼠動(dòng)態(tài)血清生物標(biāo)志物篩查

結(jié)果表明在第2周時(shí)大鼠體內(nèi)即發(fā)生輕微程度的代謝紊亂，體內(nèi)代謝物對(duì)何首烏肝損傷的敏感性高于臨床常用的ALT和AST肝功能生化指標(biāo)。

同時(shí)本文對(duì)何首烏造成大鼠肝損傷的1～4周進(jìn)行動(dòng)態(tài)血清代謝組學(xué)監(jiān)測(cè)，結(jié)合多維統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出高度相關(guān)的6個(gè)生物標(biāo)志物，分別為oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol和7ahydroxydehydroepiandrosterone，這些標(biāo)志物在肝損傷動(dòng)態(tài)期間也呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。其中，oleamide（油酸酰胺）屬于脂肪酸，作為動(dòng)物體內(nèi)的一種內(nèi)源性物質(zhì)，參與體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮受體激動(dòng)作用。有關(guān)研究表明[89]：oleamide在乙型肝炎病毒導(dǎo)致的肝癌患者的肝臟組織中含量相比于正常人群顯著降低，但是在酒精性肝硬化患者中則顯著升高。而該文研究也表明oleamide在何首烏致大鼠肝損傷的動(dòng)態(tài)過程中呈現(xiàn)總體下降的趨勢(shì)，其可作為體現(xiàn)肝臟病變的重要標(biāo)志物。lysoPC（16∶0）是一種溶血卵磷脂，是構(gòu)成生物膜的重要組分，起到細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的作用。Chamulitrat等研究發(fā)現(xiàn)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中肝臟的卵磷脂合成也受到抑制[10]，而溶血卵磷脂作為卵磷脂的亞型，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)體內(nèi)的溶血卵磷脂也會(huì)發(fā)生一定程度的紊亂。leukotriene A4（白三烯A4）可參與宿主防御反應(yīng)、直接過敏及炎癥相關(guān)反應(yīng)，是花生四烯酸代謝的中間體。其在體內(nèi)的生物合成與催化主要位于肝臟細(xì)胞的微粒體中[11]，一旦肝臟受到損傷，其含量水平必然會(huì)發(fā)生異常。transtetradec2enoic acid是體內(nèi)肝臟合成脂肪酸的中間體，至今為止尚未發(fā)現(xiàn)其與肝損傷有關(guān)的相關(guān)報(bào)道，本研究是首次發(fā)現(xiàn)該標(biāo)志物與何首烏造成的肝損傷密切相關(guān)。dihydrocortisol是膽汁酸合成的中間體、甾體激素代謝以及P450代謝的重要組分，至今也未有其與肝損傷相關(guān)的報(bào)道。7ahydroxydehydroepiandrosterone是肝臟P450酶催化脫氫表雄酮的主要代謝物[12]，有研究表明[13]其是體內(nèi)調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素水平的重要物質(zhì)。

所發(fā)現(xiàn)的代謝標(biāo)志物如lysoPC（16∶0）從第2周時(shí)迅速升高，第3周時(shí)則出現(xiàn)明顯下降，第4周仍處于下降趨勢(shì)，比ALT，AST更敏感，因此對(duì)于監(jiān)測(cè)服用首烏患者肝功能、早期發(fā)現(xiàn)首烏肝損傷具有潛在應(yīng)用價(jià)值和意義，后續(xù)將在人體標(biāo)本中進(jìn)行深入驗(yàn)證和檢驗(yàn)。

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[收稿日期]20160907

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373944）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2012KTCQ0313）

[通信作者]*王昌利，教授，主要從事中藥制劑工藝質(zhì)量評(píng)價(jià)體系研究，Email：wcl3433@163com；*宋逍，博士，副教授，主要從事天然藥物純化及新劑型的研究，Email：songxiao1999@sohucom

[作者簡(jiǎn)介]柏希慧，碩士研究生，主要從事中藥制劑工藝質(zhì)量評(píng)價(jià)體系研究，Email：295974924@qq