段禮新　代云桃　孫超　陳士林

[摘要] 代謝組學(xué)是全局性研究小分子代謝物的一門科學(xué)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥復(fù)雜體系。代謝物是藥用植物代謝合成的產(chǎn)物，是中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著本草基因組計(jì)劃的實(shí)施和中藥合成生物學(xué)的發(fā)展，藥用植物代謝組學(xué)研究將會(huì)迎來蓬勃發(fā)展。該文介紹代謝組學(xué)技術(shù)近幾年的研究進(jìn)展，以及藥用植物代謝組學(xué)研究的主要內(nèi)容，包括藥用植物鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)，品種選育和抗逆研究，代謝途徑解析，代謝網(wǎng)絡(luò)、代謝工程研究及合成生物學(xué)研究。通過整合本草基因組，轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)等研究，最終為藥用植物品種選育、創(chuàng)新藥物研發(fā)和質(zhì)量安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 代謝組學(xué)； 藥用植物； 分析技術(shù)； 次生代謝； 代謝途徑

Metabolomics research of medicinal plants

DUAN Lixin1， DAI Yuntao2， SUN Chao3， CHEN Shilin2*

（1.Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100093， China；

2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China）

[Abstract] Metabolomics is the comprehensively study of chemical processes involving small molecule metabolites. It is an important part of systems biology， and is widely applied in complex traditional Chinese medicine（TCM）system. Metabolites biosynthesized by medicinal plants are the effective basis for TCM. Metabolomics studies of medicinal plants will usher in a new period of vigorous development with the implementation of Herb Genome Program and the development of TCM synthetic biology. This manuscript introduces the recent research progresses of metabolomics technology and the main research contents of metabolomics studies for medicinal plants， including identification and quality evaluation for medicinal plants， cultivars breeding， stress resistance， metabolic pathways， metabolic network， metabolic engineering and synthetic biology researches. The integration of genomics， transcriptomics and metabolomics approaches will finally lay foundation for breeding of medicinal plants， R&D， quality and safety evaluation of innovative drug.

[Key words] metabolomics； medicinal plants； analytic technology； secondary metabolism； metabolic pathway

doi：10.4268/cjcmm20162202

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，產(chǎn)生了數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)迥異的小分子代謝物。這些物質(zhì)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境方面發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)也是人類營(yíng)養(yǎng)成分和藥物的重要來源。藥用植物是人類數(shù)千年來篩選出來的用于防病、治病的植物，我國(guó)藥用植物有1萬(wàn)多種，約占中藥資源總數(shù)的87%[1]。藥用植物生物合成結(jié)構(gòu)多變、活性多樣的次生代謝產(chǎn)物，它們通常是中藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，是新藥、新化學(xué)實(shí)體的重要來源。同時(shí)，合成這些重要天然產(chǎn)物的基因，調(diào)控因子以及代謝網(wǎng)絡(luò)更是一個(gè)尚未有效開發(fā)的巨大資源寶庫(kù)。隨著本草基因組計(jì)劃（herb genome program，HerbGP）的實(shí)施[1]，無(wú)疑將吸引更多、更新的生命科學(xué)技術(shù)的跟進(jìn)，給藥用植物次生代謝研究注入強(qiáng)勁動(dòng)力。

代謝組學(xué)（metabolomics或metabonomics）旨在研究生物體或組織甚至單個(gè)細(xì)胞的全部小分子代謝物成分及其動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而在全局水平上解析代謝網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控[24] 。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)重要組成部分，是從整體的層面上研究代謝變化。代謝組學(xué)從2000年左右提出概念，到現(xiàn)在（特別是最近幾年）保持快速的發(fā)展勢(shì)頭（圖1）。代謝物是中藥發(fā)揮作用的載體，代謝組學(xué)在中醫(yī)藥復(fù)雜體系有著非常廣闊的應(yīng)用。截至寫稿前，代謝組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)表526篇相關(guān)中文文獻(xiàn)（CNKI檢索結(jié)果），在中藥材基原鑒別[5]，藥材道地性[6]，藥材的質(zhì)量控制[7]，中藥炮制[8]，中藥有效成分研究[9]，中藥復(fù)方配伍[10]，中藥藥效、藥理評(píng)價(jià)[11]，中藥代謝及毒理評(píng)價(jià)[12]，中藥方證[13]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用（圖2）。

數(shù)據(jù)以“metabolomics” 或 “metabonomics”為關(guān)鍵詞檢索ISI Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得。

圖1 代謝組學(xué)相關(guān)論文年發(fā)表數(shù)量統(tǒng)計(jì)

Fig.1 The annual number of metabolomics or metabonomics paper

數(shù)據(jù)以“代謝組學(xué)”為關(guān)鍵詞檢索CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)，限定“中藥”和“藥學(xué)”領(lǐng)域所獲得。

圖2 代謝組學(xué)在中藥學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域中文文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析

Fig.2 Statistic analysis of the applications of metabolomics/metabonomics in traditional Chinese medicine

藥用植物代謝組學(xué)是以藥用植物為研究對(duì)象，采用各種分析化學(xué)手段，全局性分析藥用植物小分子代謝產(chǎn)物，從整體上定性、定量測(cè)定基因或環(huán)境對(duì)代謝物的影響，從而解析代謝物的代謝合成途徑、代謝物網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制。研究通常結(jié)合基因組信息，各種分子生物學(xué)和組學(xué)手段，如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、分析化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)等手段。研究?jī)?nèi)容主要包括藥用植物的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)，藥用植物品種選育及抗逆研究，初生、次生代謝途徑解析，代謝網(wǎng)絡(luò)、代謝工程研究及合成生物學(xué)研究等幾個(gè)方面，最終為藥用植物品種選育、創(chuàng)新藥物研發(fā)和質(zhì)量安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。本文主要介紹代謝組學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展，及在藥用植物代謝途徑、代謝工程和合成生物學(xué)研究（圖3）。

圖3 藥用植物代謝組學(xué)研究

Fig.3 The metabolomics research of medicinal plants

1 代謝組學(xué)分析技術(shù)進(jìn)展

代謝組學(xué)研究的基本步驟包括：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，植物栽培，取樣，樣本制備，衍生化，檢測(cè)分析，數(shù)據(jù)分析，代謝途徑或代謝網(wǎng)絡(luò)分析。代謝物的種類和含量除受到遺傳和環(huán)境兩方面的影響，也與樣本提取和制備關(guān)系極大。好的代謝組學(xué)分析，要保持各種實(shí)驗(yàn)條件一致。例如在分析突變體和野生型材料時(shí)，突變體要回交數(shù)代，保持遺傳背景與野生型相同。還要在相同的條件下栽培，選取同一生理時(shí)期、相同組織部位的材料，代謝物提取方法要保持一致，這樣的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)才具有可比性。代謝組學(xué)技術(shù)在不斷發(fā)展，研究熱點(diǎn)多集中在各種新的分析檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)，海量數(shù)據(jù)處理軟件的研發(fā)以及代謝途徑、代謝網(wǎng)絡(luò)、代謝數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建等。下面重點(diǎn)介紹代謝組學(xué)技術(shù)近幾年的研究進(jìn)展。

多平臺(tái)整合代謝組學(xué)分析，代謝組學(xué)技術(shù)主要包括核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，NMR）平臺(tái)和質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）平臺(tái)。NMR具有簡(jiǎn)單的樣品預(yù)處理、較高的重現(xiàn)性和良好的檢測(cè)客觀性等優(yōu)勢(shì)，但是質(zhì)譜擁有較高的分辨率和靈敏度，對(duì)于植物這樣復(fù)雜的樣本尤其適合。由于植物代謝物種類十分龐大，據(jù)估計(jì)總數(shù)目在20～100萬(wàn)多種[14]。此外，代謝物極性相差巨大，有的初生代謝物與次生代謝物之間豐度相差超過105數(shù)量級(jí)。目前還沒有一種代謝組學(xué)分析方法能完全覆蓋所有的代謝物，單一的分析方法往往對(duì)不同的代謝物形成歧視效應(yīng)。多個(gè)分析平臺(tái)整合技術(shù)是目前單一分析技術(shù)的一種補(bǔ)充，達(dá)到對(duì)不同極性代謝物廣譜分析。Dai等利用NMR和LCDADMS 分析3種不同栽培品種丹參Salvia miltiorrhiza Bunge cv. Sativa （SA）， cv. Foliolum （SF） 和 cv. Silcestris （SI）的代謝譜，既能檢測(cè)到丹參中的28個(gè)初生代謝產(chǎn)物，包括碳水化合物、氨基酸、膽堿、TCA循環(huán)和，又能發(fā)現(xiàn)丹參中的次生代謝產(chǎn)物，如莽草酸途徑的丹參酚酸和重要的萜類成分[15] 。

擬靶向代謝組學(xué)分析，根據(jù)研究目的的不同，代謝組學(xué)研究策略分為非靶向代謝組學(xué)（nontargeted metabolomics）和靶向代謝組學(xué)（targeted metabolomics）。非靶向代謝組學(xué)也稱為發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)，預(yù)先不知道哪些代謝物會(huì)發(fā)生變化，通過比較2組樣本找出差異物質(zhì)，尤其適合代謝標(biāo)識(shí)物發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。其特點(diǎn)是分析通量高、覆蓋代謝物廣，但是數(shù)據(jù)穩(wěn)定性、重復(fù)性及定量線性范圍不如靶向代謝組學(xué)分析。靶向代謝組學(xué)特定針對(duì)一定數(shù)量的目的代謝物進(jìn)行分析，方法精度高、測(cè)量準(zhǔn)確，但是測(cè)定的代謝物范圍有限，依賴對(duì)照品。擬靶向的代謝組學(xué)分析方法是最近開發(fā)出來的一種方法，它結(jié)合非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。方法首先篩選非靶向代謝組學(xué)所能檢測(cè)到的所有峰信號(hào)，然后不依賴對(duì)照品建立這些峰的靶向分析方法。擬靶向代謝組學(xué)方法兼顧方法的精度和廣度。此外，擬靶向代謝組學(xué)分析可以克服非靶向代謝組學(xué)中多樣本質(zhì)譜峰提取、對(duì)齊等難點(diǎn)。目前建立了多種擬靶向代謝組學(xué)方法如擬靶向代謝組學(xué)（pseudotargeted metabolomics）分析方法[16]、廣泛靶向代謝組學(xué)（widely targeted metabolomics）方法[1718]，這些方法在篩選靶向物質(zhì)時(shí)，篩選方法雖然有所不同，但目的是一致的。

消除質(zhì)譜假陽(yáng)性研究策略。隨著高靈敏度、高分辨率色譜質(zhì)譜分析儀器的迅速發(fā)展，代謝組學(xué)分析可輕松地檢測(cè)數(shù)千種信號(hào)。與此同時(shí)也會(huì)不可避免地產(chǎn)生大量假陽(yáng)性信號(hào)。這些信號(hào)包括生物來源和非生物來源兩類。此外，即使對(duì)于生物來源的質(zhì)譜信號(hào)，它們的峰面積是否與代謝物濃度之間存在較好的定量關(guān)系？在缺少有效的數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)方法下，往往不容易篩選出真實(shí)的代謝標(biāo)識(shí)物，或者篩選到假陽(yáng)性代謝標(biāo)識(shí)物。筆者采用混合所有生物樣本的質(zhì)控樣本（quality control， QC）作為代謝物混合池，對(duì)QC進(jìn)行逐級(jí)稀釋，結(jié)合溶劑空白，提出5步峰過濾規(guī)則，區(qū)分假陽(yáng)性質(zhì)譜信號(hào)和評(píng)價(jià)每一個(gè)峰的定量能力（quantitative performance）。同時(shí)引入相對(duì)濃度指數(shù)（relative concentration index， RCI），結(jié)合QC梯度稀釋曲線，建立所有質(zhì)譜峰的定量校正模型。該模型不僅可以用于定量校正，而且可以將質(zhì)譜峰面積歸一化到RCI。該方法可以消除對(duì)照品組成的人工樣本中92.4%的假陽(yáng)性，消除生物樣本中71.4%的假陽(yáng)性質(zhì)譜峰信號(hào)[19]。

質(zhì)譜成像代謝組學(xué)分析技術(shù)，采用成像方式的離子掃描技術(shù)，原位分析代謝物在不同時(shí)間和空間的變化?？赏瑫r(shí)對(duì)多種分子進(jìn)行原位可視化分析，從而將代謝物與組織形態(tài)學(xué)高度關(guān)聯(lián)[20]。傳統(tǒng)的代謝組學(xué)分析通常只能在均一化的樣品或提取物中進(jìn)行，但是，植物的各種細(xì)胞分化后具有不同的功能，特定的細(xì)胞和組織具有不同的代謝物特征。如丹參酮二萜合成基因CPS1和KSL1在丹參根木栓層中特異表達(dá)，木栓層中特異積累紅色丹參酮類物質(zhì)[21]。Kotaro Yamamoto等[22]通過整合質(zhì)譜成像技術(shù)和單細(xì)胞質(zhì)譜代謝組學(xué)技術(shù)，研究長(zhǎng)春花莖的縱切面的質(zhì)譜成像圖，解析萜類生物堿合成的細(xì)胞特異性。單萜成分如馬錢子苷和次番木鱉苷定位在表皮細(xì)胞中，該結(jié)果和前人報(bào)道的一致。以前報(bào)道RNA原位雜交顯示大多數(shù)萜類生物堿在表皮細(xì)胞中合成，然而質(zhì)譜成像結(jié)果顯示多種萜類生物堿，如ajmalicine和serpentine，并沒有在表皮細(xì)胞中積累，而是在異型細(xì)胞和乳管細(xì)胞中積累。質(zhì)譜成像還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)離子m/z 337.19也同萜類生物堿共定位在表皮細(xì)胞、異型細(xì)胞和乳管細(xì)胞中，推測(cè)它可能為長(zhǎng)春堿類化合物或中間代謝物。作者還采用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)手段，比較4種組織細(xì)胞中的代謝物譜的差異，在主成分分析（PCA）模型中可以區(qū)分這4種不同類型的組織細(xì)胞，而且可以發(fā)現(xiàn)不同組織細(xì)胞中的差異代謝物。作者還通過單細(xì)胞質(zhì)譜分析，定量比較了4種組織細(xì)胞中萜類生物堿的含量和分布，PCA分析結(jié)果與質(zhì)譜成像結(jié)果相似，異型細(xì)胞和乳管細(xì)胞積累相似的化合物，而與表皮細(xì)胞和薄壁細(xì)胞中積累的代謝物有所不同。

2 藥用植物鑒別和質(zhì)量控制的代謝組學(xué)研究

我國(guó)藥材種類繁多，資源豐富，然而來源復(fù)雜，品種混淆厲害。僅《中國(guó)藥典》2000 年版收載的534種中藥材，即有143 種中藥為多基原（二基原以上）。中藥材基原品種的真?zhèn)?、正宗與否，關(guān)系到該味中藥的確切療效和療效的重現(xiàn)性，進(jìn)而直接影響到中藥制劑的質(zhì)量。即使是同種藥材，由于自然條件的不同，藥材產(chǎn)量和質(zhì)量也不相同，臨床療效也有相當(dāng)大的差異，由此產(chǎn)生了“道地藥材”。同時(shí)，野生與栽培藥材以及不同生長(zhǎng)年限的藥材也都表現(xiàn)出了質(zhì)和量上的差異。DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD，RFLP，很好地用于遺傳多樣性研究以及正品與偽品等種以上分類單元的鑒定。同時(shí)，由于DNA分子標(biāo)記不受生物體發(fā)育階段的影響，無(wú)法鑒別不同生長(zhǎng)年限的藥材，對(duì)同基原（基因型）的野生與栽培藥材的鑒別也存在一定困難。植物代謝組學(xué)主要是對(duì)特定條件下代謝表型（metabolic phenotypes 或 metabotypes）以及這些表型與基因型之間聯(lián)系的研究。植物次生代謝過程及代謝物的積累受到自身和環(huán)境中各種生物和非生物因素的調(diào)控，通過代謝組學(xué)研究不僅能夠深入理解植物與環(huán)境的相互作用，了解植物自身基因的功能，植物代謝網(wǎng)絡(luò)與代謝調(diào)控，還能揭示植物表型與植物生長(zhǎng)、發(fā)育及生物多樣性之間的關(guān)系。筆者將DNA分子標(biāo)記技術(shù)及代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，用來鑒別中藥材蒙古黃芪和膜莢黃芪。這2種黃芪植物形態(tài)非常相似，僅存在莢果有毛無(wú)毛的細(xì)微差別，它們的分類學(xué)地位仍然存在一些爭(zhēng)議。DNA分子標(biāo)記AFLP技術(shù)顯示蒙古黃芪和甘肅的膜莢黃芪聚在一起，說明蒙古黃芪與甘肅的膜莢黃芪親緣關(guān)系較近，結(jié)果支持蒙古黃芪是膜莢黃芪變種這一分類結(jié)果。而GCTOFMS代謝組學(xué)分析可以區(qū)分這2種黃芪，顯示2種黃芪的代謝組存在一定的差別。通過主成分分析，找到2個(gè)品種，不同生長(zhǎng)年限和地域差別的差異代謝物，這些代謝物可能與黃芪的生境相關(guān)[23] 。劉悅等[24]將代謝組學(xué)技術(shù)與DNA barcoding技術(shù)相結(jié)合，區(qū)分3種不同的沙棘，江孜沙棘Hippopahe gyantsensis Rousi、肋果沙棘H. neurocarpa S. W. Liu & T. N. He和西藏沙棘H. tibetana Schlechtendal。甘草為常用大宗藥材，藥食兼用品種，年需要量約6萬(wàn)噸左右。美國(guó)NIH中心的Slmmler等[25]采用基于DNA barcoding和代謝組學(xué)的方式，對(duì)甘草中3個(gè)種及其他種的變種共51個(gè)商業(yè)獲得的樣本進(jìn)行了分析。代謝組學(xué)分析采用1HNMR和LCMS結(jié)合的手段進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)采用非監(jiān)督方式主成分分析（PCA）和監(jiān)督性分析典型判別分析（CDA）。結(jié)果顯示，結(jié)合DNA barcoding和代謝組學(xué)技術(shù)，除了能明顯區(qū)分出甘草、脹果甘草、光果甘草3個(gè)種，還能區(qū)分出不同的雜種及不同種的混合物?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定柴胡有2個(gè)來源：柴胡Bupleurum chinense DC. 或狹葉柴胡B. scorzonerifolium Willd.的干燥根。按性狀不同，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”，其中“南柴胡”又稱紅柴胡。無(wú)數(shù)學(xué)者采用色譜含量測(cè)定或者色譜指紋的方法區(qū)分二者，但均未能明顯區(qū)分。秦雪梅教授和荷蘭萊頓大學(xué)Verpoorte教授小組[26]，采用基于核磁的代謝組學(xué)方法將2個(gè)種明顯分開，找到了區(qū)分2個(gè)種的化學(xué)標(biāo)志物?！氨辈窈焙懈吆康牟窈碥誥及其類似物，而“南柴胡”含有高含量的揮發(fā)油、柴胡皂苷b1及其相同骨架的皂苷。該結(jié)果體現(xiàn)了核磁技術(shù)在化合物結(jié)構(gòu)辨識(shí)方面和中藥品種鑒定方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

3 代謝組學(xué)與藥用植物代謝途徑研究

生物合成途徑是藥用植物次生代謝研究的核心內(nèi)容，相對(duì)初生代謝，次生代謝在植物進(jìn)化過程中呈現(xiàn)出代謝多樣性的特點(diǎn)，在植物類群中特異性分布。植物次生代謝一般通過關(guān)鍵的環(huán)化酶或合酶形成基本骨架，如萜類環(huán)化酶形成二萜、三萜的基本骨架，然后通過各種修飾酶，如P450氧化還原酶、UGT糖基轉(zhuǎn)移酶、OMT甲基轉(zhuǎn)移酶、鹵化酶等，增加基本骨架結(jié)構(gòu)的極性，引入雜原子等活性基團(tuán)，使得終端產(chǎn)物呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)多樣性的特點(diǎn)。由于極性的增加，使得終端產(chǎn)物可以積累在植物細(xì)胞中[27]。丹參酮是丹參中具有活血化瘀的重要藥效物質(zhì)，丹參酮屬于不飽和的二萜類天然產(chǎn)物。高偉等首次克隆并功能鑒定了丹參酮生物合成途徑中2個(gè)丹參酮特有的二萜關(guān)鍵環(huán)化酶SmCPS和SmKSL，通過RNA干擾的方法抑制了SmCPS的表達(dá)，導(dǎo)致丹參酮類成分在丹參毛狀根中明顯下降。不同于裸子植物，被子植物丹參酮二萜合酶為單功能酶，需要SmCPS和SmKSL協(xié)作催化GGPP到丹參酮二烯[28]。崔光紅等對(duì)丹參基因組序列中的7個(gè)二萜合酶基因進(jìn)行系統(tǒng)的功能鑒定，綜合利用基因表達(dá)譜、RNAi干擾，闡明SmCPS1控制著根部丹參酮類化合物的生物合成。通過代謝組學(xué)技術(shù)（LCMS和GCMS）對(duì)比轉(zhuǎn)基因RNAi干擾植株與野生型植株的代謝譜，通過主成分分析能夠非常清楚地區(qū)分這2組植株。LCMS代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)40個(gè)差異代謝物，通過比對(duì)自建的丹參次生代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)、精確相對(duì)分子質(zhì)量匹配、MS/MS分析、對(duì)照品比較，鑒定其中20個(gè)差異代謝物。從GCMS得到28個(gè)差異化合物，在NIST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，相似度在800 以上的有12個(gè)，對(duì)照品比對(duì)鑒定其中8個(gè)。結(jié)果顯示SmCPS1受到抑制后積累的大量二萜化合物底物，鑒定的20個(gè)代謝物均為典型的松香烷型丹參酮類結(jié)構(gòu)，另外3個(gè)為重排的松香烷型結(jié)構(gòu)，分別為przewalskin和salvisyrianone，以及二聚體neoprzewaquinone。通過代謝組學(xué)和RNAi干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)丹參酮類化合物的生物合成途徑并非簡(jiǎn)單的直線型模式，而是形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；通過RNAi干擾還發(fā)現(xiàn)大量未知的二萜類化合物[21，29]。

隨著首個(gè)藥用植物——丹參基因組框架圖的完成[30]，將進(jìn)一步推動(dòng)丹參成為模式藥用植物，也為系統(tǒng)揭示丹參次生代謝奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。目前，在多數(shù)植物無(wú)法進(jìn)行全基因組序列測(cè)定的情況下，轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)成為分離和克隆新基因及基因功能研究的重要手段之一[31]。Gao Wei 等使用UPLCDADQTOFMS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析銀離子誘導(dǎo)的丹參毛狀根，鑒定了5個(gè)明顯差異的丹參酮類代謝物。轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了6 358個(gè)差異基因，通過分析明顯上調(diào)的富集基因，預(yù)測(cè)了70個(gè)候選的轉(zhuǎn)錄因子和8個(gè)P450氧化還原酶，它們可能與銀離子誘導(dǎo)的丹參酮類物質(zhì)合成相關(guān)[32]。

傳統(tǒng)分子生物學(xué)手段克隆、驗(yàn)證代謝功能基因，是一份具有挑戰(zhàn)的工作?；诼?lián)鎖關(guān)聯(lián)分析的代謝組學(xué)分析成為大規(guī)模、高效定位代謝物合成基因的新手段。在植物學(xué)研究領(lǐng)域，全基因組關(guān)聯(lián)分析（genomewide association studies， GWAS）是在全基因組范圍內(nèi)篩選不同遺傳差異個(gè)體分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，分析表型相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)。GWAS廣泛用于人類疾病與植物復(fù)雜農(nóng)藝性質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的解析。GWAS結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)（metabolic GWAS， mGWAS）則用以解析代謝物合成的遺傳機(jī)制，即代謝合成及調(diào)控的基因位點(diǎn)。Chen 等對(duì)524份自然栽培水稻品種資源（含有642.877萬(wàn)的SNPs分子標(biāo)記）進(jìn)行LCMS代謝組學(xué)分析，得到840多種代謝物，并檢測(cè)到2 947個(gè)主效SNPs，共634個(gè)遺傳位點(diǎn)。通過遺傳和生化分析鑒定了其中5個(gè)黃酮合成的候選基因[3334]。黃瓜中的苦味物質(zhì)是一類稱為葫蘆素，高度氧化的三萜衍生物，葫蘆素類三萜普遍存在葫蘆科植物中，作為抗癌藥物使用。尚軼等通過GWAS分析115份黃瓜種子資源，發(fā)現(xiàn)了與黃瓜葉片苦味緊密連鎖的SNP位點(diǎn)，通過體外酵母表達(dá)鑒定了黃瓜中苦味物質(zhì)葫蘆素C合成的關(guān)鍵三萜環(huán)化酶。通過共表達(dá)分析，鑒定了一個(gè)存在黃瓜基因組中的基因簇（gene cluster）。組合表達(dá)三萜環(huán)化酶和下游的P450氧化還原酶，通過靶向代謝組學(xué)分析，最終鑒定了2個(gè)P450和1個(gè)?；D(zhuǎn)移酶的生化功能。此外，還解析了2個(gè)分別在葉和瓜里面特異調(diào)控葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子[35]。

4 代謝組學(xué)與藥用植物代謝工程和合成生物學(xué)研究

目前藥用植物鑒定的代謝途徑還不是很多，代謝網(wǎng)絡(luò)的研究鮮有報(bào)道。同位素標(biāo)記方法結(jié)合代謝組學(xué)分析，可以較好地研究次生代謝網(wǎng)絡(luò)。如添加穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記的甲羥戊酸（萜類合成前提）到植物，通過非靶向代謝組學(xué)手段比較同位素標(biāo)記的植株與野生型植株，可以研究植物萜類的代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)。藥用植物代謝工程主要通過基因工程的手段將代謝途徑中的關(guān)限速酶、代謝途徑轉(zhuǎn)移到工程化的酵母或植物細(xì)胞系，調(diào)節(jié)代謝的流向，針對(duì)性地提高目標(biāo)代謝物的含量?？拱┧幬镒仙即嫉拇x工程研究較多，Ajikumar等首先優(yōu)化大腸桿菌上游途徑IPP的生物合成，提高大腸桿菌IPP合成的8個(gè)步驟中的4個(gè)限速酶的表達(dá)量，使得大腸桿菌大量生成IPP。之后將植物中紫杉醇合成途徑中的GGPP合成酶和紫衫二烯（taxadiene）合酶導(dǎo)入到前面構(gòu)建的工程菌中，優(yōu)化催化酶的密碼子和表達(dá)水平，使得大腸桿菌中產(chǎn)生1 g·L-1的紫衫二烯，產(chǎn)量是沒有經(jīng)過優(yōu)化菌株的1 500多倍[36]。藥用植物合成生物學(xué)研究跨越了物種各自進(jìn)化的代謝途徑，通過挖掘代謝物合成的各種生物元件，通過人工組合、設(shè)計(jì)，產(chǎn)生非天然的產(chǎn)物或新的代謝途徑，再導(dǎo)入底盤細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)目的產(chǎn)物[37]。無(wú)論是代謝途徑解析、代謝工程研究或者合成生物的研究，代謝物分析，代謝組學(xué)分析都是必不可少的研究工具。

5 藥用植物分子育種與抗逆代謝組學(xué)研究

我國(guó)野生藥用植物種質(zhì)資源豐富，但是由于常年栽種和消耗使得許多藥用植物品質(zhì)出現(xiàn)下降，好的資源瀕于枯竭。傳統(tǒng)育種一般通過植物種內(nèi)的有性雜交進(jìn)行農(nóng)藝性狀或品質(zhì)的轉(zhuǎn)移與改良，如提高藥用植物的抗性，提高藥用植物有效成分的含量，提高產(chǎn)量等，這類方式存在育種周期長(zhǎng)、遺傳改良實(shí)踐效率偏低的缺陷。分子育種技術(shù)通過利用控制目標(biāo)性狀的功能基因和調(diào)控元件，可以有效提高目標(biāo)性狀改良的效率和準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了由表型選擇到基因型選擇的過渡[38]。作物分子育種研究較為深入，Wen Weiwei通過mGWAS方法，分析了種植在多個(gè)區(qū)域702個(gè)玉米品種的983個(gè)代謝物，定位了1 459個(gè)代謝物遺傳控制位點(diǎn)。通過突變和轉(zhuǎn)基因分析進(jìn)一步驗(yàn)證了其中的2個(gè)代謝基因，為分子育種提供了目標(biāo)[39]。代謝組學(xué)還廣泛應(yīng)用于植物抗逆、抗病的代謝機(jī)制研究[40]。唐惠儒小組[41]采用代謝組學(xué)研究了水分流失導(dǎo)致的逆境脅迫對(duì)丹參根中代謝產(chǎn)物的影響，以冷凍干燥為參照，比較了曬干和陰干2種干燥方法的影響。結(jié)果顯示水脅迫導(dǎo)致了丹參中代謝物輪廓發(fā)生顯著的變化，曬干和陰干均顯著提高了丹參酮含量，陰干提高了莽草酸途徑中酚酸類成分的含量，而曬干降低了該類成分的含量。CarmoSilva等[42]采用1HNMR和GCMS代謝組學(xué)方法，比較了干旱脅迫和正常水分條件下生長(zhǎng)的狗牙根Cynodon dactylon L.Pers.的化學(xué)物質(zhì)群，驗(yàn)證了氨基酸在干旱脅迫下發(fā)生累積外，還新發(fā)現(xiàn)了一種特殊的非蛋白質(zhì)氨基酸在干旱脅迫條件下特異地累積?？傊x組學(xué)作為一種手段可以廣泛地應(yīng)用于藥用植物研究的方方面面。

6 問題與展望

代謝組學(xué)是從整體上分析所有小分子化合物的一門技術(shù)，在中醫(yī)藥各個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。藥用植物蘊(yùn)含著結(jié)構(gòu)豐富，有應(yīng)用價(jià)值的天然產(chǎn)物，同時(shí)也意味著藥用植物擁有許多獨(dú)特的代謝基因，從基因資源和代謝多樣性角度上講，要比模式植物擬南芥和水稻更有研究?jī)r(jià)值。隨著合成生物學(xué)的興起，將會(huì)有更多的機(jī)會(huì)挖掘和利用藥用植物。無(wú)論是藥用植物的鑒別，質(zhì)量控制，代謝途徑解析，代謝工程和合成生物學(xué)研究，都離不開代謝物分析和代謝組學(xué)分析。然而代謝物的含量受到諸多因素的影響，包括遺傳、環(huán)境、存儲(chǔ)、制備、分析等各個(gè)環(huán)節(jié)的影響。同時(shí)，中醫(yī)、中藥是極其復(fù)雜的體系，很難單獨(dú)通過某一種技術(shù)，一個(gè)實(shí)驗(yàn)來說清楚，猶如盲人摸象，未來需要從更多層面上系統(tǒng)地解析中醫(yī)藥中的各種問題。比較模式生物，中醫(yī)藥代謝組學(xué)研究還缺乏基因組信息，缺少合適的遺傳材料、人工群體、自然群體等。隨著技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，代謝組學(xué)必將朝著更加精細(xì)化的方向發(fā)展，代謝物的定量、定性分析將更加準(zhǔn)確，各種原位分析，單細(xì)胞分析技術(shù)將更加成熟。

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