宋培培等

摘 要 以新疆兩個主要世居民族（維吾爾族和漢族）大學生人群尿樣為研究對象，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對35名維吾爾族和37名漢族大學生人群尿樣進行分析，考察兩民族大學生尿液代謝輪廓間的差異。采用正交信號校正-偏最小二乘法判別分析結果表明， 維吾爾族和漢族大學生人群尿樣代謝輪廓存在著明顯差異，聚類明顯。實驗發(fā)現(xiàn)和鑒定出9種差異代謝物，其中7種為內(nèi)源性代謝物，2種為外源性代謝物。研究表明，相關代謝組學研究可從源頭避免或減少非疾病因素引入的差異變量，除年齡、性別等因素外，還需充分考慮族別因素的影響。

關鍵詞 代謝組學； 氣相色譜-質(zhì)譜； 維吾爾族； 漢族； 尿液

1 引 言

代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，已成為繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學之后興起的一個新的組學研究熱點[1，2]。在疾病代謝組學研究中，采樣環(huán)節(jié)起著舉足輕重的作用，生物樣本的代表性與所鑒定出的相關疾病生物標志物的可靠性與準確性有著直接關系。眾多因素影響著生物樣本中代謝物的組成與含量，如飲食習慣、外界壓力、抽煙與否以及參加鍛煉頻率與強度等，導致代謝組學研究結果有極大的可變性[3～9]。在動物實驗中，通過嚴格控制外部生理條件，可最大化降低或消除這些因素的影響。但對人類相關疾病組學研究過程中，該方法并不可行。如Saito等[4]研究了血液基質(zhì)、年齡和性別對高加索人種代謝物輪廓的影響，證實這些因素均會導致個體間代謝物在種類和數(shù)量的不同；Lenz等[5]發(fā)現(xiàn)，由于英國和瑞典健康人群飲食和文化不同，導致尿液輪廓間存在差異，在瑞典健康人群中，Trimethy-lamine N-oxide含量高于英國健康人群；Dumas等[6]發(fā)現(xiàn)，由于飲食、基因和腸道微生物因素，日本、芝加哥和中國的健康人群的尿液輪廓存在差異。上述研究表明，人種、飲食文化等差異會對生物樣本中代謝物的組成與含量產(chǎn)生較大影響。新疆地理環(huán)境和自然生態(tài)條件復雜，民族分布及其生活方式獨特，地方性高發(fā)病種類繁多，并且表現(xiàn)出一定的民族性[10，11]。這除與民族遺傳等基因因素相關外，民族文化和飲食習慣的差異也是導致這種現(xiàn)象的一個重要原因。為深入研究新疆地方性高發(fā)病，在進行相關代謝組學研究過程中，就必須充分考慮族別因素的影響?；诖?，本研究以新疆兩個人口最多的世居民族維吾爾和漢族為對象，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（GC-MS）對這兩個民族健康大學生尿樣進行分析，探索由于族別因素導致的尿液輪廓間差異，并通過生物統(tǒng)計學方法發(fā)現(xiàn)和鑒別兩個人群尿樣中差異代謝物，為新疆多發(fā)性疾病早期診斷與相關標志物的篩選提供參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

QP2010 Ultra GC-MS （日本Shimadzu公司），Coulter Avanti J-25 高速冷凍離心機（美國Beckman公司）。

N，O-雙（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSTFA， 98%，Aladdin 試劑）；三甲基氯硅烷（TMCS）、甲氧基胺鹽酸鹽（98%，Alfa Aesar試劑）；吡啶（分析純，北京化工廠），十二酸（色譜純，上海試劑一廠）。

2.2 樣品處理

2.2.1 樣品收集

于新疆大學收集35例（男18、女17）維吾爾族和37例（男16、女21）漢族的大學生晨起尿樣，年齡19～28歲，志愿者身體健康，一星期之內(nèi)未服用任何藥物，24 h內(nèi)未飲用含咖啡因的飲品。72例樣本收集后，在2 h內(nèi)進行處理，4℃下3000 g離心10 min，除去固形物，上清液置于-80℃保存。

2.2.2 樣品前處理 尿樣在室溫下解凍混合均勻，取200 μL上清液，按體積比1∶4加入冷丙酮800 μL，4℃靜置5 h，沉淀蛋白；在4℃下12000 g離心15 min，取上清液，冷凍真空干燥。在殘留干燥物中加入34 μL 15 g/L 甲氧胺鹽酸鹽，無水吡啶為復溶液，渦旋5 min充分溶解后，加入7 μL 5 mg/mL月桂酸標準溶液（內(nèi)標物），另加34 μL衍生化試劑（BSTFA∶TMCS=99∶1）超聲振蕩5 min，使之充分反應。37℃衍生30 min，緩慢升溫至65℃， 衍生化反應結束，冷卻至室溫后進行GC-MS分析。

為檢驗儀器和分析方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，本實驗使用質(zhì)量控制（Quality control， QC）樣品，QC樣品由每例樣品各取適量混合而得，樣品檢測過程中，每檢測7個樣品后運行1次QC樣品，以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度，280℃；分流比，100∶1；載氣，99.999%高純He，1.0 mL/min；色譜柱溫度，初始溫度60℃，保持2 min，以10℃/min由60℃提升至80℃，再以25℃/min升至160℃，以10℃/min升至280℃，保持2 min；進樣量，0.1 μL。

EI離子源：溫度200℃；電子能量，70 eV；掃描方式，全掃描模式，掃描范圍m/z 50～600。譜庫：Wiley 229.L， Wiley 7.L和NIST 08.L。

2.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)首先采用GC-MS Solution軟件進行預處理，以斜率1000 min，半峰寬為2進行基線校正和自動峰值檢測；以內(nèi)標月桂酸為標準進行歸一化處理后， 將數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 11.5 Demo和 17.0 SPSS軟件進行多維統(tǒng)計分析。

3 結果與討論

3.1 生物統(tǒng)計學分析

采用SIMCA-P 11.5 Demo軟件對所得數(shù)據(jù)進行正交信號校正-偏最小二乘法判別分析（Orthogonal signal correction filtered partial least-squares discriminant analysis， OSC-PLS-DA）。如圖1A所示，維吾爾族和漢族大學生尿樣聚類明顯，兩組樣本達到了良好分離（模型參數(shù)R2X=0.691，Q2（cum）=0.333），說明兩組尿樣輪廓間存在顯著差異。為了檢驗模型重現(xiàn)性是否良好和模型中的數(shù)據(jù)是否過擬合，避免監(jiān)督性學習方法獲得分類結果的偶然性，每個模型都經(jīng)過100次內(nèi)交叉驗證（Cross validation，CV），結果見圖1B。CV以R2和Q2回歸線與y軸的截距值作為標準衡量模型是否過擬合。本次實驗結果中Q2

為負值（0.232），證實所建模型不存在過擬合，模型有效，預測能力良好[12]，可應用于維吾爾族和漢族大學生尿樣的聚類分析。

3.2 差異代謝物篩選

在OSC濾噪的PLS-DA模型中Variable importance in the projection （VIP） 是一種廣泛使用的變量挑選方法[12]，VIP間接反映了代謝物和所研究樣本之間的關系。本研究以VIP>1[13]和顯著性t檢驗p<0.05為標準對代謝物進行了篩選，共鑒定出9種代謝物在維吾爾族和漢族大學生尿液中存在顯著性差異，所得結果按VIP由大到小列于表1。

為進一步驗證所鑒定的差異代謝物的可靠性，分別通過人類代謝組學數(shù)據(jù)庫（Human metabolomics databas，HMDB）、代謝物二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（Metabolite and tandem MS databas，METLIN）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等數(shù)據(jù)庫對9種差異代謝物進行檢索，結果發(fā)現(xiàn)，它們均為尿液代謝物，進一步驗證了實驗結果的可靠性。其中7種差異代謝物為內(nèi)源性物質(zhì)（圖2），主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)代謝途徑。它們在兩組尿樣中的變化趨勢也并不相同，有升有降，而尿液中內(nèi)源性物質(zhì)的含量與飲食文化或基因等因素有著直接或間接的關系。乳酸丁酯和丙二醇為外源性代謝物，它們含量的高低與攝入的食物或香精有直接關系。上述結果表明，維吾爾族和漢族健康大學生人群尿樣中存在著多種差異代謝物，導致這種現(xiàn)象的原因與民族文化，特別是飲食文化的差異有關。

特別需要說明的是，在兩組尿樣中，α-N-苯乙酰-L-谷氨酰胺在維吾爾族大學生尿液樣本中含量明顯高于漢族大學生，其過度表達預示著患有肝脾氣虛癥的可能性更高[14]。但在本實驗過程中所采集的尿液樣本均來自于年輕的健康大學生人群，α-N-苯乙酰-L-谷氨酰胺含量偏高并不能說明維吾爾族大學生比漢族人群患有肝脾氣虛癥的可能性更高，可能只是與民族文化和傳統(tǒng)或民族基因間差異有關，而且新疆實際情況也與這一可能性相反，乙肝攜帶率漢族高于維吾爾族[11]。上述實際結果說明民族文化和傳統(tǒng)或民族基因的差異也會導致不同族別人群尿液樣本中代謝物的種類和含量存在著差異，會嚴重干擾相關疾病生物標志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定。

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