宋培培等

摘 要 以新疆兩個(gè)主要世居民族（維吾爾族和漢族）大學(xué)生人群尿樣為研究對(duì)象，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)35名維吾爾族和37名漢族大學(xué)生人群尿樣進(jìn)行分析，考察兩民族大學(xué)生尿液代謝輪廓間的差異。采用正交信號(hào)校正-偏最小二乘法判別分析結(jié)果表明， 維吾爾族和漢族大學(xué)生人群尿樣代謝輪廓存在著明顯差異，聚類明顯。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和鑒定出9種差異代謝物，其中7種為內(nèi)源性代謝物，2種為外源性代謝物。研究表明，相關(guān)代謝組學(xué)研究可從源頭避免或減少非疾病因素引入的差異變量，除年齡、性別等因素外，還需充分考慮族別因素的影響。

關(guān)鍵詞 代謝組學(xué)； 氣相色譜-質(zhì)譜； 維吾爾族； 漢族； 尿液

1 引 言

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，已成為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的一個(gè)新的組學(xué)研究熱點(diǎn)[1，2]。在疾病代謝組學(xué)研究中，采樣環(huán)節(jié)起著舉足輕重的作用，生物樣本的代表性與所鑒定出的相關(guān)疾病生物標(biāo)志物的可靠性與準(zhǔn)確性有著直接關(guān)系。眾多因素影響著生物樣本中代謝物的組成與含量，如飲食習(xí)慣、外界壓力、抽煙與否以及參加鍛煉頻率與強(qiáng)度等，導(dǎo)致代謝組學(xué)研究結(jié)果有極大的可變性[3～9]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)嚴(yán)格控制外部生理?xiàng)l件，可最大化降低或消除這些因素的影響。但對(duì)人類相關(guān)疾病組學(xué)研究過(guò)程中，該方法并不可行。如Saito等[4]研究了血液基質(zhì)、年齡和性別對(duì)高加索人種代謝物輪廓的影響，證實(shí)這些因素均會(huì)導(dǎo)致個(gè)體間代謝物在種類和數(shù)量的不同；Lenz等[5]發(fā)現(xiàn)，由于英國(guó)和瑞典健康人群飲食和文化不同，導(dǎo)致尿液輪廓間存在差異，在瑞典健康人群中，Trimethy-lamine N-oxide含量高于英國(guó)健康人群；Dumas等[6]發(fā)現(xiàn)，由于飲食、基因和腸道微生物因素，日本、芝加哥和中國(guó)的健康人群的尿液輪廓存在差異。上述研究表明，人種、飲食文化等差異會(huì)對(duì)生物樣本中代謝物的組成與含量產(chǎn)生較大影響。新疆地理環(huán)境和自然生態(tài)條件復(fù)雜，民族分布及其生活方式獨(dú)特，地方性高發(fā)病種類繁多，并且表現(xiàn)出一定的民族性[10，11]。這除與民族遺傳等基因因素相關(guān)外，民族文化和飲食習(xí)慣的差異也是導(dǎo)致這種現(xiàn)象的一個(gè)重要原因。為深入研究新疆地方性高發(fā)病，在進(jìn)行相關(guān)代謝組學(xué)研究過(guò)程中，就必須充分考慮族別因素的影響。基于此，本研究以新疆兩個(gè)人口最多的世居民族維吾爾和漢族為對(duì)象，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)這兩個(gè)民族健康大學(xué)生尿樣進(jìn)行分析，探索由于族別因素導(dǎo)致的尿液輪廓間差異，并通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法發(fā)現(xiàn)和鑒別兩個(gè)人群尿樣中差異代謝物，為新疆多發(fā)性疾病早期診斷與相關(guān)標(biāo)志物的篩選提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

QP2010 Ultra GC-MS （日本Shimadzu公司），Coulter Avanti J-25 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）。

N，O-雙（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSTFA， 98%，Aladdin 試劑）；三甲基氯硅烷（TMCS）、甲氧基胺鹽酸鹽（98%，Alfa Aesar試劑）；吡啶（分析純，北京化工廠），十二酸（色譜純，上海試劑一廠）。

2.2 樣品處理

2.2.1 樣品收集

于新疆大學(xué)收集35例（男18、女17）維吾爾族和37例（男16、女21）漢族的大學(xué)生晨起尿樣，年齡19～28歲，志愿者身體健康，一星期之內(nèi)未服用任何藥物，24 h內(nèi)未飲用含咖啡因的飲品。72例樣本收集后，在2 h內(nèi)進(jìn)行處理，4℃下3000 g離心10 min，除去固形物，上清液置于-80℃保存。

2.2.2 樣品前處理 尿樣在室溫下解凍混合均勻，取200 μL上清液，按體積比1∶4加入冷丙酮800 μL，4℃靜置5 h，沉淀蛋白；在4℃下12000 g離心15 min，取上清液，冷凍真空干燥。在殘留干燥物中加入34 μL 15 g/L 甲氧胺鹽酸鹽，無(wú)水吡啶為復(fù)溶液，渦旋5 min充分溶解后，加入7 μL 5 mg/mL月桂酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)物），另加34 μL衍生化試劑（BSTFA∶TMCS=99∶1）超聲振蕩5 min，使之充分反應(yīng)。37℃衍生30 min，緩慢升溫至65℃， 衍生化反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫后進(jìn)行GC-MS分析。

為檢驗(yàn)儀器和分析方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)使用質(zhì)量控制（Quality control， QC）樣品，QC樣品由每例樣品各取適量混合而得，樣品檢測(cè)過(guò)程中，每檢測(cè)7個(gè)樣品后運(yùn)行1次QC樣品，以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度，280℃；分流比，100∶1；載氣，99.999%高純He，1.0 mL/min；色譜柱溫度，初始溫度60℃，保持2 min，以10℃/min由60℃提升至80℃，再以25℃/min升至160℃，以10℃/min升至280℃，保持2 min；進(jìn)樣量，0.1 μL。

EI離子源：溫度200℃；電子能量，70 eV；掃描方式，全掃描模式，掃描范圍m/z 50～600。譜庫(kù)：Wiley 229.L， Wiley 7.L和NIST 08.L。

2.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)首先采用GC-MS Solution軟件進(jìn)行預(yù)處理，以斜率1000 min，半峰寬為2進(jìn)行基線校正和自動(dòng)峰值檢測(cè)；以內(nèi)標(biāo)月桂酸為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理后， 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.5 Demo和 17.0 SPSS軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SIMCA-P 11.5 Demo軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正交信號(hào)校正-偏最小二乘法判別分析（Orthogonal signal correction filtered partial least-squares discriminant analysis， OSC-PLS-DA）。如圖1A所示，維吾爾族和漢族大學(xué)生尿樣聚類明顯，兩組樣本達(dá)到了良好分離（模型參數(shù)R2X=0.691，Q2（cum）=0.333），說(shuō)明兩組尿樣輪廓間存在顯著差異。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭噩F(xiàn)性是否良好和模型中的數(shù)據(jù)是否過(guò)擬合，避免監(jiān)督性學(xué)習(xí)方法獲得分類結(jié)果的偶然性，每個(gè)模型都經(jīng)過(guò)100次內(nèi)交叉驗(yàn)證（Cross validation，CV），結(jié)果見(jiàn)圖1B。CV以R2和Q2回歸線與y軸的截距值作為標(biāo)準(zhǔn)衡量模型是否過(guò)擬合。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Q2

為負(fù)值（0.232），證實(shí)所建模型不存在過(guò)擬合，模型有效，預(yù)測(cè)能力良好[12]，可應(yīng)用于維吾爾族和漢族大學(xué)生尿樣的聚類分析。

3.2 差異代謝物篩選

在OSC濾噪的PLS-DA模型中Variable importance in the projection （VIP） 是一種廣泛使用的變量挑選方法[12]，VIP間接反映了代謝物和所研究樣本之間的關(guān)系。本研究以VIP>1[13]和顯著性t檢驗(yàn)p<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)代謝物進(jìn)行了篩選，共鑒定出9種代謝物在維吾爾族和漢族大學(xué)生尿液中存在顯著性差異，所得結(jié)果按VIP由大到小列于表1。

為進(jìn)一步驗(yàn)證所鑒定的差異代謝物的可靠性，分別通過(guò)人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Human metabolomics databas，HMDB）、代謝物二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（Metabolite and tandem MS databas，METLIN）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)9種差異代謝物進(jìn)行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們均為尿液代謝物，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。其中7種差異代謝物為內(nèi)源性物質(zhì)（圖2），主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)代謝途徑。它們?cè)趦山M尿樣中的變化趨勢(shì)也并不相同，有升有降，而尿液中內(nèi)源性物質(zhì)的含量與飲食文化或基因等因素有著直接或間接的關(guān)系。乳酸丁酯和丙二醇為外源性代謝物，它們含量的高低與攝入的食物或香精有直接關(guān)系。上述結(jié)果表明，維吾爾族和漢族健康大學(xué)生人群尿樣中存在著多種差異代謝物，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因與民族文化，特別是飲食文化的差異有關(guān)。

特別需要說(shuō)明的是，在兩組尿樣中，α-N-苯乙酰-L-谷氨酰胺在維吾爾族大學(xué)生尿液樣本中含量明顯高于漢族大學(xué)生，其過(guò)度表達(dá)預(yù)示著患有肝脾氣虛癥的可能性更高[14]。但在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所采集的尿液樣本均來(lái)自于年輕的健康大學(xué)生人群，α-N-苯乙酰-L-谷氨酰胺含量偏高并不能說(shuō)明維吾爾族大學(xué)生比漢族人群患有肝脾氣虛癥的可能性更高，可能只是與民族文化和傳統(tǒng)或民族基因間差異有關(guān)，而且新疆實(shí)際情況也與這一可能性相反，乙肝攜帶率漢族高于維吾爾族[11]。上述實(shí)際結(jié)果說(shuō)明民族文化和傳統(tǒng)或民族基因的差異也會(huì)導(dǎo)致不同族別人群尿液樣本中代謝物的種類和含量存在著差異，會(huì)嚴(yán)重干擾相關(guān)疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定。

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