臧貴勇，張祥令，楊燕平

(1.貴州省黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖與組織胚胎學(xué)教研室，貴州黔南 558000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴陽 550004)

快速Wright液與改進(jìn)的Wright液染色比較分析*

臧貴勇1，張祥令2△，楊燕平2

(1.貴州省黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖與組織胚胎學(xué)教研室，貴州黔南 558000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴陽 550004)

目的 提高血涂片的制作質(zhì)量，評價(jià)兩種方法鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的效果。方法 取人耳垂血液，改進(jìn)Wright染色，光學(xué)顯微鏡下觀察染色效果。結(jié)果 改進(jìn)Wright染色，血涂片300張，各種血細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。結(jié)論 該方法可提高血涂片染色質(zhì)量，利于長時(shí)間保存和使用。

教學(xué)；血液??；血涂片；改進(jìn)Wright染色；制作

血涂片常用于解剖組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作，應(yīng)用極其廣泛，特別是對各種血液病的診斷、治療有很大價(jià)值。血細(xì)胞具有重要的生理功能，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能是學(xué)習(xí)重點(diǎn)[1]。為了使醫(yī)學(xué)生在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中能夠觀察到染色效果好、結(jié)構(gòu)清晰、層次分明、不易褪色，長時(shí)間保存和使用的教學(xué)血涂片，使醫(yī)學(xué)生將來更好地服務(wù)于臨床和科研奠定基礎(chǔ)[2]，作者對其改進(jìn)制作教學(xué)血涂片方法進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Wright干粉、甲醇、甘油、甲醛液、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、快速Wright液等試劑均為國產(chǎn)分析純；顯微鏡為LEICA DFC公司產(chǎn)品；醫(yī)用采血針、75%乙醇棉球、洗耳球、染色架、特制蠟筆，清潔的載玻片和蓋玻片(將新玻片用洗潔精浸泡，自來水反復(fù)沖洗，載玻片置95%乙醇浸泡2 h，擦干備用)。

1.1.2 試劑的配制 改進(jìn)Wright配制配方：Wright粉劑0.1 g加甲醇60 mL充分研磨，直至溶解過濾，加入優(yōu)質(zhì)甘油1 mL，臨用前加甲醛液1 mL，常溫保存，配制周期1個(gè)月。磷酸鹽緩沖液pH 6.8：磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.3 g加磷酸氫二鈉(Na2HPO4)0.2 g加蒸餾水1 000 mL稀釋[3]。

1.2 方法 采血部位和涂血膜部位常為耳垂或左手指尖采血，通常以耳垂取血較好，因該處采血不易感染，先輕揉耳垂部位使血流通暢，再用75%乙醇棉球消毒局部皮膚，待乙醇干后快速刺破耳垂下緣，使血自然流出，第1滴血棄之不用(因?yàn)楹瑔魏思?xì)胞較多)。取米粒大小血滴在干凈的載玻片15～20 mm處，將接有血滴的載玻片平托于左手拇食指間，右手取另一潔凈而邊緣無破痕的玻片，然后將右手玻片在玻片面上推向前方。推好片后手持玻片在空氣中揮動，使血膜自然風(fēng)干，以免血細(xì)胞皺縮。天氣寒冷潮濕時(shí)，應(yīng)放于37℃溫箱中保溫促干，以免細(xì)胞變形縮小[4]。

1.3 固定染色 血膜干后，用特制蠟筆劃出染色區(qū)，以防染液滴加后溢流，將血膜平放在染色架上，一批血涂片滴加快速Wright氏染液，另一批血涂片滴加改進(jìn)Wright氏染液，分別滴加2～3滴在血膜上，至染液淹沒血膜全部，加入等量磷酸鹽緩沖液pH 6.8，用洗耳球輕輕吹，使之混勻。吹動染液及緩沖液，這樣不僅可使染液與血膜充分接觸，還可防止雜質(zhì)的沉降[5]。染色3～5 min，沖洗前在低倍鏡下觀察有核細(xì)胞是否染色清楚，核著色是否分明。傾去涂片的染液，自來水細(xì)流水充分沖洗，至血膜呈淡紅色，待自然干燥后，經(jīng)二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各透明10 min，進(jìn)行封固。

1.4 封固 用中性樹膠封固，即于顯微鏡下進(jìn)行鏡檢或直接鏡檢，待樹膠干燥后可長期保存使用。

2 結(jié) 果

改進(jìn)Wright染色，血涂片300張，各種血細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰?？焖賅right染色法，血細(xì)胞染色顆粒不明顯，顏色對比度不強(qiáng)(圖1)；改進(jìn)Wright染色，血膜外觀為淡紫紅色，在顯微鏡下紅細(xì)胞橘紅色圓盤狀；中性粒細(xì)胞核顆粒紫紅色，染色質(zhì)清楚，粗細(xì)松緊可辨；嗜酸性粒細(xì)胞顆粒橘紅色；嗜堿性粒細(xì)胞核藍(lán)紫色，顆粒呈深藍(lán)紫色；淋巴細(xì)胞核深藍(lán)紫色，胞質(zhì)淡藍(lán)色；單核細(xì)胞核藍(lán)紫色，胞質(zhì)灰藍(lán)色；血小板為不規(guī)則小體，成簇成堆分布，周邊淺藍(lán)色，中央細(xì)小的紫紅色顆粒。見圖2、3。

圖1 血涂片(快速Wright染色法×400)

圖2 血涂片(改進(jìn)Wright染色法×400)

A:紅細(xì)胞；B:中性粒細(xì)胞；C:嗜堿性粒細(xì)胞；↑：血小板。

圖3 血涂片(改進(jìn)Wright染色法×1 000)

3 討 論

3.1 改進(jìn)Wright氏染液的優(yōu)點(diǎn) 改進(jìn)Wright氏染液加入丙三醇，以增加表面張力，可防止甲醇揮發(fā)及被氧化成甲酸，可密封長期保存，臨用前加甲醛液，對細(xì)胞固定較好，特別適于顯示細(xì)胞特殊顆粒。因此染色后的血涂片各種血細(xì)胞在鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰、典型。特別是血小板形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯，血涂片中血小板的形態(tài)學(xué)及數(shù)量的改變對血小板病的診斷有重要意義。改進(jìn)的Wright染色血涂片通過近三年教學(xué)標(biāo)本的使用，未見褪色現(xiàn)象，得到指導(dǎo)老師和實(shí)習(xí)學(xué)生的好評。而快速Wright染色法，血片中血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)不典型，不利于教學(xué)片的使用。

3.2 血涂片的要求及注意事項(xiàng) 合格外周血涂片厚薄適宜，頭體尾分明，邊緣整齊，細(xì)胞分布均勻，兩側(cè)留空隙，染色效果好，細(xì)胞清晰可辨。因此血涂片制作好壞有以下影響因素：(1)載玻片的清潔是必要因素，經(jīng)過處理的載玻片既干凈又無脂痕，否則染色后玻片可見雜物或圓形空白區(qū)。(2)血滴大小是影響血涂片厚薄及大小的關(guān)鍵因素之一；若血滴過大,血涂片過厚,使細(xì)胞重疊縮小、不易觀察形態(tài);血液堆積在載玻片末端,使一些體積較大的細(xì)胞遺漏，若血滴過小,血膜太薄,白細(xì)胞多集中在邊緣,易導(dǎo)致細(xì)胞分布不均。(3)推片速度不可太快或太慢，應(yīng)一次推成，不可中斷或抖動[6]。(4)未干透血膜不能立即染色，否則染色時(shí)血膜易脫落；染色時(shí)間的長短與染液的濃度、室溫高低和有核細(xì)胞數(shù)量有關(guān)[7]。(5)加染液量應(yīng)適當(dāng)，涂片在加染液后勿使其干固，否則將發(fā)生不易去掉的沉淀；沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以自來水細(xì)流水充分沖洗；沖洗好的血涂片應(yīng)立放于支架上晾干；(6)染色偏酸偏堿時(shí)應(yīng)更換緩沖液；染色顏色偏深時(shí)，可用95%乙醇分色。

3.3 優(yōu)質(zhì)血涂片的意義 作為教學(xué)片使用的標(biāo)本，要求較高，顯示血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)要典型，胞質(zhì)內(nèi)嗜酸嗜堿性顆粒清晰。顯示血細(xì)胞中顆粒是識別和判斷及其功能狀態(tài)提供的研究方法，以便醫(yī)學(xué)生能夠更好的辨認(rèn)各類細(xì)胞，為以后學(xué)習(xí)其他醫(yī)學(xué)科打下基礎(chǔ)，也為科學(xué)研究提供了較好的方法。

[1]張立新，尚宏偉，路欣，等．血涂片制作與觀察在醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[J]．中國醫(yī)學(xué)裝備，2013，9(9)：37-38．

[2]黃健，麥婕，陳森洲．加強(qiáng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)踐教學(xué) 提高大學(xué)生創(chuàng)新能力[J]．中國高等醫(yī)學(xué)教育，2009(6)：6-7,59．

[3]張志梅，孫輝．兩種血涂片染色方法在教學(xué)和臨床應(yīng)用的比較[J]．中國醫(yī)藥指南，2010，8(17)：173-174．

[4]李璐．血涂片染色方法的改良[J]．華夏醫(yī)學(xué)，2011，24(3)：351-352．

[5]郭自力，李漢全．血涂片瑞氏染色的影響因素和解決方法[J]．高等函授學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，14(4)：48-49．

[6]杜卓民．實(shí)用組織學(xué)技術(shù)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：92-94．

[7]陳紆，陳大美．血涂片制作的幾點(diǎn)體會[J]．中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2008，17(4)：386．

?驗(yàn)交流·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.031

貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目(M2011-28)。 作者簡介：臧貴勇(1971-)，副教授，碩士，主要從事神經(jīng)及組織學(xué)技術(shù)研究。

R331.1

B

1671-8348(2017)05-0676-02

2016-07-11

2016-09-09)