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退色瘧原蟲血片標(biāo)本的不同復(fù)染法比較

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目的探討已退色瘧原蟲血片復(fù)染的最佳方法。方法采用五種染色方法，用不同濃度的染液，不同的緩沖液及染色時(shí)間，進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果瘧原蟲血片標(biāo)本用傳統(tǒng)的單一染色法復(fù)染，效果均不佳。瑞氏與吉氏復(fù)合染色法，蟲體結(jié)構(gòu)清晰著色均勻。結(jié)論瑞氏與吉氏復(fù)合染色法復(fù)染退色瘧原蟲血片可滿足教學(xué)重復(fù)利用。

瘧原蟲血片，退色，復(fù)染

瘧原蟲標(biāo)本不易采集，而且長(zhǎng)期保存的標(biāo)本易退色。傳統(tǒng)的單一染色法存在某種缺陷：瑞氏染液染色法具有方法簡(jiǎn)便，染色快速的優(yōu)點(diǎn)，但保存的時(shí)間不長(zhǎng)；吉氏染液染色法，不容易褪色，但細(xì)胞漿與中性顆粒著色較淡，顏色分辨不清楚。為使退色標(biāo)本重復(fù)使用，滿足教學(xué)實(shí)驗(yàn)課的要求，并制作出高質(zhì)量的瘧原蟲標(biāo)本，作者對(duì)退色的瘧原蟲標(biāo)本進(jìn)行復(fù)染，摸索出瑞氏與吉氏復(fù)合染色法復(fù)染方法，效果較佳。

1 材料

退色瘧原蟲血片，二甲苯，2%鹽酸酒精，磷酸緩沖液，美藍(lán)，吉氏染液，瑞氏染液，吉氏生理鹽水染液，瑞氏-吉氏復(fù)合液。

2 方法

2.1 各種染液配制

按文獻(xiàn)方法配制磷酸緩沖液、瑞氏染液、吉氏染液、吉氏生理鹽水染液和瑞氏-吉氏復(fù)合液［1］。

2.2 瘧原蟲血片的退色

2.2.1 清除污垢

先選薄血膜較完整的退色瘧原蟲標(biāo)本片，將血片放入盛有二甲苯的染色缸1～2d，使膠溶解，蓋片脫落，然后取出血片，放入潔凈二甲苯染色缸中蘸洗幾次，用擦鏡紙擦凈，未加蓋片的舊血片，可直接投入二甲苯中2～3h除垢即可。

2.2.2 退色

將除去污垢的血片垂直浸入盛有2%鹽酸乙醇液的染色缸中，待血膜上原吉氏液顏色退凈后，用自來(lái)水沖洗10min晾干備用。

2.3 瘧原蟲血片的復(fù)染

2.3.1 吉氏（Giemsa）染液染色法 分別用pH6.8，pH7.2的磷酸緩沖液配制2%，3%，5%，10%的吉氏染液，在室溫約27℃下，將上述退色的血涂片分為十四組，用2%吉氏液分別染色30min、50min及1h,3%吉氏液分別染色30min和50min，5%、10%的吉氏染液各染色30min。用肉眼觀察染色情況，至顏色合適后用緩沖液沖洗，晾干鏡檢，結(jié)果顯示濃度為2%的吉氏染液染1h及3%吉氏染液染50min（緩沖液的pH為7.2）較其他各組好，但各期蟲體形態(tài)特征及顏色對(duì)比仍不能完全滿足教學(xué)，且有細(xì)胞粘連。而其他各組效果均不佳[2]。

2.3.2 吉氏（Giemsa）染液加美藍(lán)染色法 在上述方法下加適量美藍(lán)于吉氏染液中以復(fù)染舊片（即40ml吉氏染液原液加1g美藍(lán)，搖勻）。加適量美藍(lán)可使舊片血膜中顏色變淡的瘧原蟲胞質(zhì)恢復(fù)原色，如此著色較佳。但染色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。結(jié)果顯示此法復(fù)染血片效果不如單純吉氏染液染色法。

2.3.3 吉氏生理鹽水染液染色法 取吉氏原液5～7ml加0.85%生理鹽水（中性的）至100ml，染色0.5～1h。此法可使白細(xì)胞及瘧原蟲著色更為鮮明，被寄生紅細(xì)胞的薛氏點(diǎn)和門氏點(diǎn)亦更清晰。此法初染效果較好，但復(fù)染效果不佳。

2.3.4 瑞氏與吉氏復(fù)合染色 在室溫約27℃下用瑞氏染液先染5～10min，然后用pH分別為6.8和7.2的吉氏原液、3%吉氏液、5%吉氏液、10%吉氏液各染10min，30min，50min。結(jié)果顯示用pH為7.2的緩沖液，濃度為10%的吉氏染液染色30min后蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，效果較好，基本符合教學(xué)要求，缺點(diǎn)是顏色對(duì)比不非常鮮明。

2.3.5 瑞氏-吉氏復(fù)合液 在室溫約27℃下，用瑞氏-吉氏復(fù)合液各染10min，20min及30min。結(jié)果顯示：用此法染色20 min后各期蟲體形態(tài)特征清楚，結(jié)構(gòu)清晰，此時(shí)紅細(xì)胞為淺紅色，瘧原蟲胞漿為蘭色，細(xì)胞核為紅色，胞漿里的瘧色素為棕褐色。適合教學(xué)實(shí)驗(yàn)使用。

3 結(jié)果

我們采用5種方法，通過(guò)不同濃度，不同時(shí)間及pH值染色效果對(duì)比，在室溫約27℃下，用瑞氏-吉氏復(fù)合液染色20min效果較其他染色法效果好。由于瑞氏與吉氏復(fù)合染色實(shí)驗(yàn)所用的瑞氏染液偏于酸性，吉氏染液用pH7.0～7.2的緩沖液所稀釋，略偏堿性，此時(shí)瑞氏染液和吉氏染液互相彌補(bǔ)了對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色不足的缺陷，使蟲體結(jié)構(gòu)清晰，著色均勻，顏色鮮明，易于觀察，適合教學(xué)實(shí)驗(yàn)使用。該方法可以進(jìn)行大批染制。

4 體會(huì)

復(fù)染片必須潔凈無(wú)油，而且血膜上原吉氏液顏色需完全退凈。染色時(shí)應(yīng)根據(jù)瘧原蟲采集、使用時(shí)間的長(zhǎng)短，染液的質(zhì)量和配置的新舊、染液的稀釋度和進(jìn)行染色時(shí)的氣溫高低選擇染色時(shí)間。一般說(shuō)來(lái)，以染液稀釋的較淡，染色時(shí)間延長(zhǎng)些，效果較為滿意。稀釋染液用的緩沖液以pH7.2為佳。如果染色過(guò)深，可以適當(dāng)延長(zhǎng)沖洗時(shí)間予以糾正。沖洗時(shí)宜將緩沖液滴加在復(fù)染片上，切忌先傾去染液，以免染液殘?jiān)掣狡渖希绊懹^察。

［1］ 陳佩惠.人體寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，1988：217.

［2］ 王唯唯.瘧原蟲薄片標(biāo)本退色后的復(fù)染效果［J］.中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2002 ，20（6）：324.

Objective To explore the best ways for redyeing biology specimen of plasmodium blood smear. Methods The plasmodium blood smears were redyed by fi ve different ways in different density, pH and time, Results Compared with traditional single dying method, compound staining of Wright-Giemsa was well done with plasmodium polypide pigmented and clear structure. Conclusion Compound staining of Wright-Giemsa can be carried out to perform teaching process satisfactorily.

Plasmodium blood smear;Fade; Redyeing

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.32.102

132011 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院（丑莉莉）