裴 颯 宋繼權(quán) 彭瑋慧 歐運(yùn)超

·論著·

補(bǔ)體C1q基因簇rs631090多態(tài)性與女性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究

裴 颯 宋繼權(quán) 彭瑋慧 歐運(yùn)超

目的： 確定補(bǔ)體C1q基因簇單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)與中國(guó)女性人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的易感性。方法： 111例女性SLE患者及120名女性正常對(duì)照者。提取樣本基因組DNA后，經(jīng)普通PCR擴(kuò)增目的基因，采用二代測(cè)序分析C1q基因簇上三個(gè)位點(diǎn)(rs631090、rs292001、rs294223)的基因型及等位基因分布。在不同的遺傳模式下分析三個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與SLE的相關(guān)性。結(jié)果： 位點(diǎn)rs631090(C1qB)病例組與對(duì)照組基因型頻率和等位基因分布比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034和P=0.008)。位點(diǎn)rs292001(C1qA)和rs294223(C1qB)的基因型頻率及等位基因分布結(jié)果在兩組間不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均大于0.05)。位點(diǎn)rs631090在顯性遺傳模型下CT/CC基因型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著保護(hù)性作用(OR=0.470，95%CI=0.268-0.823，P<0.05)。rs292001和rs294223在三種遺傳模型下分析均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P值均大于0.05)。結(jié)論： 在中國(guó)女性人群中rs631090位點(diǎn)SNPs與SLE相關(guān)，基因型CT/CC可能為女性SLE保護(hù)基因型。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 補(bǔ)體； C1q； 單核苷酸基因多態(tài)性

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種典型的自身免疫性疾病，常伴自身抗體及補(bǔ)體系統(tǒng)的變化。其發(fā)病機(jī)制主要依賴(lài)基因、環(huán)境因素以及原發(fā)性和繼發(fā)性免疫系統(tǒng)的異常等因素。世界流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率為(7.4～159.4)/10萬(wàn)人，而在發(fā)病人群中患SLE女性的數(shù)量遠(yuǎn)超男性，至少為9∶1，且多見(jiàn)于育齡期女性。C1q是構(gòu)成補(bǔ)體C1的重要成分，它通過(guò)協(xié)助溶解免疫復(fù)合物以及清除凋亡細(xì)胞碎片來(lái)發(fā)揮抗炎作用[1]。盡管目前關(guān)于C1q基因簇多態(tài)性與SLE之間關(guān)聯(lián)的研究很少，仍然有關(guān)于C1q缺陷導(dǎo)致SLE發(fā)病的病例報(bào)道[2]。近年來(lái)關(guān)于補(bǔ)體C1q基因簇多態(tài)性與SLE基因易感性的研究報(bào)道結(jié)果不盡相同。Clq基因簇由3個(gè)基因組成：ClqA、ClqB和ClqC，我們從111例女性SLE患者C1q基因簇上選取了三個(gè)位點(diǎn)：rs292001(C1qA)，rs631090(ClqB)和rs294223(ClqC)。通過(guò)基因測(cè)序分析確定其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是否和SLE存在相關(guān)性。本次實(shí)驗(yàn)采用了二代測(cè)序(next—generation sequencing，NGS)中最常用的illumina測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)的核心是邊合成邊測(cè)序，通過(guò)捕捉新合成的末端標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列。二代測(cè)序較一代測(cè)序其測(cè)序通量有了很大提升，且費(fèi)用更低、準(zhǔn)確率更高、速度更快[3]。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 病例組為女性SLE患者111例，病例收集于武漢大學(xué)中南醫(yī)院與武漢大學(xué)人民醫(yī)院2015年5月至2016年5月間的門(mén)診及住院患者，平均年齡(37.02±14.76)歲。所有患者均符合1997美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組120名為正常體檢者，并自行檢測(cè)篩查排除SLE、干燥綜合征、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等自身免疫病，且一、二、三級(jí)親屬無(wú)SLE患者，平均年齡(42.2±15.75)歲。所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的受試者均無(wú)關(guān)聯(lián)。兩組年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)了武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有的實(shí)驗(yàn)參與者均簽署了知情同意書(shū)。采集受試者外周靜脈血標(biāo)本5 mL進(jìn)行DNA提取和基因分型。

1.2 方法 (1)基因組DNA的提取:采集外周靜脈血保存于-20℃環(huán)境下；采用血液基因組DNA提取試劑盒法(天根生化科技公司，DP318；百泰克生物技術(shù)有限公司，DP6101)提取DNA，-20℃保存。(2)PCR擴(kuò)增目的基因:用于PCR的引物如下：rs292001上游引物為5＇-GCAGACCAGAAGGATCACA-3＇下游引物為5＇-TGGGCAAGTGTCTCAACC-3＇；rs631090上游引物為5＇-TAGCCCAGTAAATGTTGAGG-3＇，下游引物為5＇-TGAACCCCATGACAACCC-3＇；rs294223上游引物為5＇-CTCGAGCAGAGAGAAAGACT-3＇，下游引物為5＇-CCTCTGAGAAATGGGGACA-3＇，由武漢達(dá)邦生物科技有限公司合成。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s,72℃延伸30 s，循環(huán)35次，末次72℃延伸5 min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖上電泳，驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果后由武漢達(dá)邦生物科技有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，一代測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

圖1 rs631090位點(diǎn)，樣品27(含C/T等位基因)的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

圖2 rs292001，樣品29(含A/G等位基因)的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

圖3 rs294223，樣品31(含A/G等位基因)的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果，利用直接計(jì)數(shù)法對(duì)基因型與等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)，兩組之間基因型頻率及等位基因分布差異的比較利用軟件SPSS 16.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。運(yùn)用Logistic回歸模型控制年齡的影響，在不同的遺傳模式下(相加模型、顯性模型、隱性模型)分析基因多態(tài)性與SLE的相關(guān)性。OR值及95%的置信區(qū)間用來(lái)評(píng)估兩組基因型頻率及等位基因分布之間差異的影響。P<0.05(two-sided test)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組進(jìn)行H-W平衡檢驗(yàn)，三個(gè)位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)及對(duì)照組的分布均符合H-W平衡(P>0.05)，表示本次實(shí)驗(yàn)選取的樣本具有很好的代表性。

2.2 基因型頻率、等位基因分布及三種模型下Logistic回歸分析結(jié)果 rs292001、rs631090以及rs294223三個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因分布見(jiàn)表1，三種遺傳模型(相加模型、顯性模型、隱性模型)下對(duì)基因型相關(guān)性的分析見(jiàn)表2。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知： rs631090位點(diǎn)的等位基因C和T分布在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)，CC、CT、TT三種基因型在兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)。在顯性遺傳模型分析下，以TT基因型為參考，基因型CT/CC可能為SLE的保護(hù)型基因型，基因型TT有增加患SLE的風(fēng)險(xiǎn)(P=0.008，OR=0.047以及95%CI=0.268～0.823)。rs292001及rs294223的等位基因和基因型頻率在兩組間(實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述兩個(gè)位點(diǎn)分別在相加模型、顯性模型、隱性模型下對(duì)基因型相關(guān)性進(jìn)行分析，所示結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 rs631090、rs292001和rs294223位點(diǎn)基因型及等位基因在病例組和對(duì)照組間的分布

表2 三個(gè)位點(diǎn)在三種遺傳模型下的分析結(jié)果

3 討論

補(bǔ)體激活可分為3條途徑：經(jīng)典途徑、MBL途徑以及旁路途徑。C1q作為補(bǔ)體C1的一部分由18個(gè)多肽鏈構(gòu)成即6A，6B和6C[4]，它是經(jīng)典途徑(classical pathway,CP)的識(shí)別分子在CP的起始階段通過(guò)與免疫復(fù)合物、凋亡細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白等上面的配體結(jié)合來(lái)啟動(dòng)補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑。

在SLE活動(dòng)期，補(bǔ)體系統(tǒng)尤其是C3會(huì)沉積在各種器官的炎癥部位。補(bǔ)體缺陷可以促進(jìn)SLE的發(fā)生、發(fā)展，遺傳性補(bǔ)體缺陷患者SLE的發(fā)病率高于正常人群[5]。目前已確證40多個(gè)與SLE易感相關(guān)的遺傳因素，其中就包括補(bǔ)體成分缺陷(C1q，C4，C2)。研究表明，補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑中的早期成分(C1q、C2、C4)的遺傳性純合子缺陷與SLE的發(fā)生發(fā)展及病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。在SLE患者中，C1q自身抗體的產(chǎn)生可能會(huì)導(dǎo)致C1q缺陷。C1q自身抗體也是在SLE患者致病的免疫復(fù)合物中最先被發(fā)現(xiàn)。它被證實(shí)與狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)有關(guān)。而LN存在于30%～50%的狼瘡患者中。除ANA和dsDNA外，C1q、C3和C4以及C1q的抗體在血清中的濃度是診斷SLE很重要的免疫學(xué)指標(biāo)，尤其是對(duì)于LN。在SLE中，C1q缺失可能是C1q基因缺陷所致抑或者是C1q自身抗體的產(chǎn)生。已被證實(shí)補(bǔ)體C1q和C1q抗體的濃度在活動(dòng)期LN患者中會(huì)分別減少和升高。 C1q 除了參與SLE的發(fā)病，已有證實(shí)C1q在一定程度上與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、精神分裂癥以及衰老相關(guān)疾病如神經(jīng)退行性病變、肌纖維化等相關(guān)[7-10]。Rafiq等研究歐洲人群中的23個(gè)位點(diǎn)認(rèn)為，最有可能與SLE存在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)是rs294223(P=0.06)[1]。Martens等研究荷蘭北部的高加索人，103例靜止期SLE患者，經(jīng)系譜不平衡檢驗(yàn)(pedigree disequilibrium test,PTD)分析得rs631090與SLE存在明顯關(guān)聯(lián)(P=0.02)[11]；Radanova及其同事對(duì)保加利亞人群進(jìn)行研究(38例LN患者和185名健康對(duì)照)，rs631090與LN無(wú)相關(guān)性[12]。Mosaad等人在130例埃及青少年SLE患者(juvenile SLE,jsSLE)中證明位點(diǎn)rs292001的SNPs與jsSLE存在明顯相關(guān)性，且C1q蛋白的血清水平在jSLE中明顯低于對(duì)照組，治療前后的對(duì)比結(jié)果顯示在LN和腎病活動(dòng)期患者中可以觀察到C1q水平明顯回升[13]；同樣在土耳其人群中rs292001被證明SNPs與SLE存在基因易感性[1]。而且從Martens的研究中可知rs292001與重癥SLE存在關(guān)聯(lián)(Systemic Lupus Erythematosus International Collaborating Clinics (SLICC) damage index score>0;P=0.007)，但在波蘭SLE人群中并未呈現(xiàn)明顯關(guān)聯(lián)性[11]。在保加利亞人群中亦未證明rs292001SNPs與LN存在基因易感性[12]。以上研究結(jié)果不盡相同，推測(cè)可能與地域和種群差異、實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及樣本量等因素相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)中位點(diǎn)rs631090在病例組與對(duì)照組基因型頻率和等位基因分布比較，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034和P=0.008)。位點(diǎn)rs292001和rs294223的基因型頻率及等位基因分布結(jié)果在兩組間不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。位點(diǎn)rs631090在顯性遺傳模型下CT/CC基因型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著保護(hù)性作用(OR=0.470，95%CI=0.268～0.823，P<0.05)。rs292001和rs294223在三種遺傳模型下分析均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P>0.05)。rs631090位點(diǎn)在兩組間基因型頻率及等位基因分布的比較結(jié)果表現(xiàn)出明顯差異，推測(cè)其SNPs與中國(guó)女性SLE的發(fā)病可能存在關(guān)聯(lián)。而rs292001和rs294223的SNPs與中國(guó)女性SLE之間不存在基因易感相關(guān)性。

本研究主要結(jié)論如下：初步探究了C1q基因簇多態(tài)性與SLE基因易感性的關(guān)系。結(jié)果提示rs631090的單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)女性系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性相關(guān)。在中國(guó)女性SLE人群中TT基因型可能增加患SLE的風(fēng)險(xiǎn)，CC/CT基因型可能提供保護(hù)作用。這為以后的機(jī)制學(xué)研究提供了新的思路。因本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，地域范圍較窄，其結(jié)果有待更多的研究證實(shí)。

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(收稿：2016-08-25)

Association of rs631090 C1q gene cluster polymorphism with systemic lupus erythematosus among women population

PEISa,SONGJiquan,PENGWeihui,OUYunchao.

ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To investigate the association of C1q gene cluster polymorphisms with systemic lupus erythematosus (SLE) among Chinese women population. Methods: A case-control study including 111 SLE patients and 120 healthy individuals were designed. DNA of the subjects was extracted and amplified by polymerase chain reaction (PCR). The difference in frequencies of the three single nucleotide polymorphisms (SNPs) (rs631090, rs292001 and rs294223) alleles and the genotypes were further confirmed by the next-generation sequencing technology. Results: In rs631090 (C1qB), distributions of the genotypes or alleles between case and controls were significantly different (P=0.034 andP=0.008, respectively). The differences in the frequencies of the other two SNPs (rs292001 (C1qA) and rs294223 (C1qB)) alleles and genotype were statistically insignificant when the SLE patients were compared with controls in this study (all,P>0.05). Under dominant model, the CT/CC genotypes of rs631090 showed significant protective effect on SLE (OR=0.470, 95%CI=0.268-0.823,P<0.05). About rs294223 and rs292001, no association was detected using different genetic model (additive, dominant and recessive; all,P>0.05). Conclusion: Our findings indicate that the SNPs of rs631090 might be associated with the development of SLE among Chinese women population, and the genotype CT/CC of rs631090 may be the protective genotype for SLE.

systemic lupus erythematosus (SLE); complement; C1q; single nucleotide polymorphisms (SNPs)

湖北省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2013CFB263)

武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科，湖北省武漢市，430071

宋繼權(quán)，E-mail: songjiq@126.com