劉 斌 李 靜 胡惠清 朱 里

·論著·

白芍總苷對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎的保護(hù)作用

劉 斌1李 靜1胡惠清1朱 里2

目的： 確定白芍總苷(Total Glucosides of Paeony,TGP)對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎的保護(hù)作用。方法： 利用2,4-二硝基氯苯(DNCB)建立Nc/Nga小鼠實(shí)驗(yàn)性特應(yīng)性皮炎模型。30只小鼠分為3組：正常對(duì)照組，模型組，實(shí)驗(yàn)組(TGP治療)，每組10只。實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌胃用藥2周，分別于第8 d、15 d測(cè)量各組小鼠背部皮損厚度和皮膚質(zhì)量，并利用ELISA法分別檢測(cè)第8 d、15 d血清中細(xì)胞因子IFN-γ，IL-4,IL-5和IgE的表達(dá)。結(jié)果： 白芍總苷治療第8 d、15 d，皮損厚度變薄及皮損皮膚質(zhì)量明顯減小(P<0.05)，血清細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IgE水平明顯低于模型組，IFN-γ水平明顯高于模型組(P<0.05)。結(jié)論： 白芍總苷可能通過促進(jìn)IFN-γ分泌，下調(diào)炎癥因子IL-4、IL-5水平以及抑制IgE表達(dá)從而對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎產(chǎn)生保護(hù)作用。

白芍總苷； 特應(yīng)性皮炎； 細(xì)胞因子； 小鼠

特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermatitis, AD)的病因尚未明確，可能與吸入性過敏原刺激、自身抗原、遺傳易感性、感染及皮膚功能下降等有關(guān)[1,2]。中藥治療AD具有獨(dú)特療效[3,4]，白芍總苷(Total Glucosides of Paeon, TGP) 是傳統(tǒng)中藥白芍根的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫平衡，抗炎及抗免疫學(xué)疾病的功效[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)，TGP在小鼠糖尿病腎損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及強(qiáng)制性脊柱炎等疾病中具有有效抑制炎性反應(yīng)的作用[7-9]。為探索TGP對(duì)于特應(yīng)性皮炎中炎癥反應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用Nc/Nga小鼠作為特應(yīng)性皮炎的模型，以觀察白芍總苷對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎皮膚情況以及血漿細(xì)胞因子的影響，旨在為探索白芍總苷對(duì)特應(yīng)性皮炎的影響以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 6周齡健康、清潔SPF級(jí)Nc/Nga小鼠30只(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，雄性，體質(zhì)量25～30 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，各組小鼠分籠飼養(yǎng)。白芍總苷(Sigma公司，美國)；干擾素γ (IFN-γ)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(Invitrogen公司，美國)；2，4-二硝基氯苯(DNCB)(Wako，日本)。

1.2 方法

1.2.1 特應(yīng)性皮炎動(dòng)物模型建立和給藥各組小鼠在清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。剔除小鼠背部面積約3 cm×3 cm皮膚，并于暴露皮膚處涂100 μL 1% 2，4-DNCB進(jìn)行誘導(dǎo)。1周后于背部剃毛處外涂50 μL 0.1% DNFB進(jìn)行激發(fā)，每周2次，誘發(fā)皮炎。于用藥后第8天再次給予50 μL 0.5% 2,4-DNCB激發(fā)1次[10]。小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、結(jié)痂等視為造模成功，造模成功24 h后實(shí)驗(yàn)組開始灌胃給予白芍總苷，每天給藥1次，按體重每次1 mL/100 g灌胃，共給藥14 d，模型組和空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水處理(圖1)。

1.2.2 皮膚質(zhì)量和皮膚厚度的測(cè)定在造模后第8 d和第15 d，用10 mm打孔器選取小鼠背部皮膚3個(gè)非重復(fù)部位打孔，用電子稱測(cè)量質(zhì)量，各組皮膚質(zhì)量取平均值；皮膚厚度：第8天和第15天，打孔方法相同，小鼠背部皮膚厚度(mm)利用皮膚測(cè)微儀測(cè)量，各組皮膚厚度取平均值。

1.2.3 IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE含量檢測(cè)分別于第8 d和15 d取小鼠眼眶靜脈血，抗凝血在4℃下2000×g離心30 min后凍存于-20℃冰箱待測(cè)，Elisa法檢測(cè)血漿中IFN-γ、IL-4、IL-5以及IgE水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚情況造模后，模型組小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑及血性滲出，并出現(xiàn)散在出血點(diǎn)和黃色斑塊，經(jīng)白芍總苷治療8天后，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚紅斑及滲出基本消失，并出現(xiàn)黃色厚薄不一的痂皮，治療15天后痂皮基本脫落并長(zhǎng)出新發(fā)(圖1)。

圖1 造模后第8 d 、15 d各組大鼠皮膚外觀

2.2 白芍總苷對(duì)小鼠皮膚質(zhì)量的影響造模成功后第8 d和15 d：模型組小鼠背部皮損處皮膚質(zhì)量分別為(58.4±1.9)mg和(49.5±2.1)mg，正常對(duì)照組為(29.7±1.9)mg和(30.8±2.1)mg。兩組比較，模型組皮損皮膚質(zhì)量明顯增多(P<0.05)，而用藥后實(shí)驗(yàn)組小鼠背部皮損皮膚質(zhì)量分別為(44.9±1.9)mg和(36.5±1.8)mg，較模型組明顯降低(P<0.05)。

2.3 白芍總苷對(duì)小鼠皮膚厚度的影響造模成功后第8 d和15 d：模型組小鼠背部皮損皮膚厚度為(805.3±38.4)μm和(609.5±33.7)μm，正常對(duì)照組為(381.7±29.3)μm和(378.4±28.1)μm。兩組比較，模型組小鼠皮膚厚度明顯增加(P<0.05)。用藥后實(shí)驗(yàn)組小鼠背部皮損皮膚厚度為(549.9±30.5)μm和(481.6±30.8)μm，較模型組明顯降低(P<0.05)。

2.4 白芍總苷對(duì)小鼠血漿IFN-γ、IL-4 、IL-5、IgE水平的影響造模后第8 d、15 d：模型組血漿細(xì)胞因子IFN-γ含量下調(diào)，用藥后實(shí)驗(yàn)組IFN-γ含量上調(diào)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞因子IL-4 、IL-5、IgE含量增高，用藥后含量均降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 造模后第8 d 和15 d白芍總苷對(duì)小鼠血漿IFN-γ、IL-4 、IL-5、IgE水平的影響

注：*P<0.05,與正常組比較；#P<0.05,與模型組比較

3 討論

免疫功能異常是引發(fā)AD的重要機(jī)制之一，研究證實(shí)，在AD患者體內(nèi)血漿免疫球蛋白E(IgE)和Th2型細(xì)胞因子水平均明顯提高[11]。眾所周知，Th1和Th2細(xì)胞因子之間相互拮抗，而IFN-γ是Th1群細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子之一， IL-4和IL-5則是Th2群細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子之一， Th1/Th2之間保持平衡對(duì)于機(jī)體免疫功能具有重要意義，Th1/Th2的平衡失調(diào)可導(dǎo)致一系列疾病，如過敏性疾病，免疫失調(diào)等[12,13]。而實(shí)驗(yàn)所研究的特應(yīng)性皮炎主要是Th2誘導(dǎo)的過敏性疾病，Th2分泌的IL-4及IL-5可促使淋巴B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，而Th1分泌的IFN-γ則可明顯抑制IgE的合成和發(fā)展，特應(yīng)性皮炎小鼠皮損的嚴(yán)重程度與IgE水平相關(guān)[14]。Sugiura等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)，特應(yīng)性皮炎Nc/Nga小鼠皮損中分泌IL-4和IL-5的細(xì)胞明顯增多，并且隨周齡增長(zhǎng)而增加。研究發(fā)現(xiàn)IL-12在免疫反應(yīng)中誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)，抑制IL-4和IL-5，從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)朝著Th1型方向發(fā)展[16]。IFN-γ可抑制Th2類細(xì)胞因子IL-4和IL-5的分泌，抑制其向Th2分化，促使免疫反應(yīng)向Th1分化，并可阻斷IgE的合成，下調(diào)嗜酸粒細(xì)胞的表達(dá)和浸潤(rùn)，以減輕特應(yīng)性皮炎的發(fā)生和發(fā)展[17,18]。因此，降低AD患者IgE表達(dá)水平、抑制Th2型細(xì)胞因子的分泌，抑制Th2型免疫反應(yīng)，使之朝著Th1方向發(fā)展，有望成為AD治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠首次DNCB刺激后，小鼠背部出現(xiàn)鱗屑、紅斑等現(xiàn)象，第2次刺激后，小鼠背部紅斑、鱗屑加重，第3次刺激后，小鼠背部嚴(yán)重紅斑及厚痂形成。實(shí)驗(yàn)組在用藥第8天及第15天均明顯減輕AD皮膚質(zhì)量和皮膚厚度。實(shí)驗(yàn)組在用藥第8天及第15天，血清IL-4、IL-5以及IgE水平顯著低于模型組，IFN-γ含量明顯高于模型組，提示白芍總苷對(duì)AD作用機(jī)制至少是通過抑制小鼠皮損和血清中Th2類細(xì)胞因子水平，提高Th1類細(xì)胞因子表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1和Th2平衡從而起抑制特應(yīng)性皮炎的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，白芍總苷對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎具有抑制作用，可通過上調(diào)Th1分泌的IFN-γ，抑制Th2分泌的IL-4、IL-5，進(jìn)而抑制IgE合成和表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡從而對(duì)特應(yīng)性皮炎產(chǎn)生一定的治療作用，這為臨床特異性皮炎治療的研究提供了新的方向。

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(收稿：2016-05-03 修回：2016-08-27)

Effect of the total glucosides of paeony on experimental atopic dermatitis in mice

LIUBin1,LIJing1,HUHuiqing1,ZHULi2.

1.DepartmentofDermatology,TheNinthHospitalofWuhanCity,Wuhan430080,China; 2.DepartmentofDermatology,HuaZhongUniversityofScienceandTechnology,UnionHospitaloftongjiMedicalCollege，Wuhan430030,China

ZHULi,E-mail:wqlb3344@163.com

Objective: To determine the effect of total glucosides of paeony (TGP) on atopic dermatitis in mice. Methods: An atopic dermatitis model was established on the back of NC/Nga mice with DNCB. Thirty mice were divided into 3 groups: control group, model group and TGP group (10 mice in each group). The mice of TGP group were treated by TGP for 14 days. The levels of serum cytokines including IL-4 and IL-5, IFN-γ and IgE were detected with ELISA kit at day 8th and 15th. Results: TGP could significantly decrease the skin thickness and weightness at 8 days and 15 days (P<0.05). The levels of IL-4,IL-5 and IgE were significantly decreased , while the level of IFN-γ was increased in TGP group, compared with other groups. Conclusion: TGP has protective effects on atopic dermatitis in mice, which may be through inhibiting production of IgE, IL-4 and IL-5, and promoting the secretion of IFN-γ.

total glucosides of paeony; atopic dermatitis; cytokines; mice

1武漢市第九醫(yī)院皮膚科,430080 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科,武漢，430030

朱里，E-mail: wqlb3344@163.com