李博為 李舒麗 楊鈺琪 張偉剛 劉 玲 高天文 李春英

·論著·

白癜風(fēng)免疫微環(huán)境對(duì)黑素細(xì)胞CXCL10表達(dá)的影響

李博為 李舒麗 楊鈺琪 張偉剛 劉 玲 高天文 李春英

目的： 明確白癜風(fēng)免疫微環(huán)境對(duì)黑素細(xì)胞CXCL10表達(dá)的影響。方法： 采用qRT-PCR檢測(cè)進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織中的細(xì)胞因子；采用qRT-PCR及ELISA檢測(cè)白癜風(fēng)免疫微環(huán)境中上調(diào)的細(xì)胞因子對(duì)黑素細(xì)胞系PIG1 CXCL10表達(dá)和分泌。結(jié)果： 進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織中IFN-γ、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)上調(diào)；三者聯(lián)合刺激顯著上調(diào)PIG1細(xì)胞CXCL10 mRNA的表達(dá)以及蛋白分泌，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。結(jié)論： 白癜風(fēng)局部免疫微環(huán)境促進(jìn)黑素細(xì)胞表達(dá)及分泌CXCL10，可能參與白癜風(fēng)發(fā)病。

白癜風(fēng)； 免疫微環(huán)境； 黑素細(xì)胞； 趨化因子CXC配體10

白癜風(fēng)是一種局部或廣泛的黑素細(xì)胞被破壞的色素脫失性疾病，目前關(guān)于其致病機(jī)理尚不明確。現(xiàn)有研究表明，自身免疫在白癜風(fēng)發(fā)病中扮演重要角色，白癜風(fēng)患者體內(nèi)存在免疫細(xì)胞異常活化、自身抗體大量產(chǎn)生[1]。趨化因子是能夠吸引白細(xì)胞遷移的一類低分子量蛋白質(zhì)，在免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，趨化因子CXC配體10(chemokine C-X-C motif ligand 10，CXCL10)是其中重要的一員?，F(xiàn)有研究表明，白癜風(fēng)患者血清高表達(dá)CXCL10，其可能參與白癜風(fēng)發(fā)病和進(jìn)展[2]。然而，黑素細(xì)胞是否具有合成分泌CXCL10的功能尚未見報(bào)道。本研究旨在離體細(xì)胞水平研究白癜風(fēng)免疫微環(huán)境對(duì)黑素細(xì)胞CXCL10表達(dá)和分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 酶標(biāo)儀、PCR擴(kuò)增儀和熒光定量PCR儀為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)。人永生化黑素細(xì)胞系PIG1由美國(guó)芝加哥大學(xué)Caroline Le Poole教授饋贈(zèng)，254培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)于安美生物科技公司，反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II kit購(gòu)于大連Takara公司，PCR引物由大連Takara公司設(shè)計(jì)并合成，重組人IFN-γ、TNF-α和IL-1β刺激因子購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，CXCL10 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)RD公司。

1.2 方法

1.2.1 皮膚組織樣本處理 白癜風(fēng)患者皮損組織來源于我科皮膚病理中心，6例進(jìn)展期患者的診斷符合2003年中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚病專業(yè)委員會(huì)色素病組頒布的白癜風(fēng)臨床診斷分型標(biāo)準(zhǔn)修訂版[3]。6例正常皮膚樣本來源于同期接受美容手術(shù)患者的非曝光部位，且均無自身免疫性疾病及家族史。兩組樣本性別匹配，年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。標(biāo)本取材均經(jīng)患者及志愿者知情同意并經(jīng)過第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。正常皮膚和白癜風(fēng)患者皮損組織樣本從液氮罐取出，各取表皮面積相等的50 mg全層皮片于滅菌研缽中磨碎，呈粉末狀后加入1 mL Trizol在冰上裂解組織，提取總RNA。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 PIG1細(xì)胞用含5% FBS的254培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將PIG1細(xì)胞接種于6孔板，分為4個(gè)處理組，即單獨(dú)刺激3組和聯(lián)合刺激1組，血清饑餓16 h后，分別予以IFN-γ(10 ng/mL)、TNF-α(10 ng/mL)、IL-1β(10 ng/mL)、IFN-γ+TNF-α+IL-1β聯(lián)合刺激24 h后收集細(xì)胞和上清；另外，聯(lián)合刺激組進(jìn)行時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)，在處理后12、24、48和72 h收集細(xì)胞和上清，分別檢測(cè)CXCL10 mRNA表達(dá)及蛋白分泌水平。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA表達(dá) 所有皮膚組織和經(jīng)過不同細(xì)胞因子刺激后的細(xì)胞用Trizol試劑提取總RNA后，嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用qRT-PCR檢測(cè)IFN-γ、TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及CXCL10的mRNA水平，實(shí)驗(yàn)所用特異引物序列詳見表1。

表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.4 ELISA檢測(cè)CXCL10分泌 收集不同刺激處理預(yù)定時(shí)間的細(xì)胞上清，按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明配制好所用試劑，進(jìn)行加樣、加工作液、37℃孵育、加底物溶液和終止溶液后，即刻用酶標(biāo)儀在450 nm讀取數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行至少3次獨(dú)立重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用student-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織局部細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況 提取健康人和進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織RNA后采用qRT-PCR檢測(cè)多種相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)變化。結(jié)果顯示，進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織中IFN-γ、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著升高，而TGF-β、IL-17、IL-21、IL-22和IL-23 mRNA表達(dá)情況在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損和健康人之間沒有顯著差異(圖1)，表明進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織浸潤(rùn)的炎癥因子以IFN-γ、TNF-α及IL-1β為主，而非Th17型細(xì)胞因子。

圖1 進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織局部細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況(**P<0.01，***P<0.001)

2.2 細(xì)胞因子誘導(dǎo)PIG1細(xì)胞CXCL10 mRNA的表達(dá)情況 通過上述上調(diào)的細(xì)胞因子刺激PIG1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-1β單獨(dú)刺激并不能上調(diào)PIG1細(xì)胞CXCL10 mRNA的表達(dá)，TNF-α輕度上調(diào)CXCL10 mRNA，但無顯著差異，而IFN-γ及其與TNF-α、IL-1β聯(lián)合能顯著上調(diào)PIG1細(xì)胞CXCL10 mRNA表達(dá)(圖2a)。且三者聯(lián)合處理可以時(shí)間依賴方式增加PIG1細(xì)胞CXCL10 mRNA的表達(dá)(圖2b)。

2.3 細(xì)胞因子誘導(dǎo)PIG1細(xì)胞CXCL10的分泌情況 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了篩選出的三種細(xì)胞因子對(duì)PIG1細(xì)胞CXCL10的分泌情況。結(jié)果顯示，IFN-γ和TNF-α單獨(dú)刺激或者三者聯(lián)合刺激均能顯著促進(jìn)CXCL10分泌，但是IL-1β的單獨(dú)刺激仍然不能誘導(dǎo)其分泌(圖3a)。此外，我們檢測(cè)三種細(xì)胞因子聯(lián)合處理不同時(shí)間后CXCL10的分泌，發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合處理同樣以時(shí)間依賴方式增加PIG1細(xì)胞CXCL10分泌(圖3b)。以上結(jié)果提示，和CXCL10 mRNA上調(diào)一致，白癜風(fēng)患者皮損免疫微環(huán)境的異常促進(jìn)黑素細(xì)胞分泌CXCL10。

圖2 2a：細(xì)胞因子單刺激和聯(lián)合刺激PIG1細(xì)胞24 h后CXCL10 mRNA的表達(dá)情況(***P<0.001)；2b：IFN-γ，TNF-α及IL-1β聯(lián)合刺激PIG1細(xì)胞不同時(shí)間后CXCL10 mRNA的表達(dá)情況(*P<0.05，***P<0.001)

圖3 3a：細(xì)胞因子單刺激和聯(lián)合刺激PIG1細(xì)胞24 h后CXCL10的分泌情況(*P<0.05，***P<0.001)；3b：IFN-γ，TNF-α及IL-1β聯(lián)合刺激PIG1細(xì)胞不同時(shí)間后CXCL10的分泌情況(**P<0.01，***P<0.001)

3 討論

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，以表皮黑素細(xì)胞被破壞導(dǎo)致皮膚黏膜白斑為特征。黑素細(xì)胞被破壞的機(jī)制迄今尚未完全闡明，但比較公認(rèn)的是，T細(xì)胞免疫應(yīng)答是導(dǎo)致表皮黑素細(xì)胞免疫損傷的主要原因[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者的外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及比例發(fā)生變化[6]，且白癜風(fēng)患者皮損有大量促炎細(xì)胞因子及CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致黑素細(xì)胞免疫損傷。我們通過檢測(cè)白癜風(fēng)患者皮損局部細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)皮損以Th1型細(xì)胞因子IFN-γ為主，其次為促炎因子TNF-α及IL-1β，而Th17型細(xì)胞因子均無明顯升高。這為應(yīng)用于銀屑病患者的以拮抗Th17型細(xì)胞因子的生物制劑并不能有效緩解白癜風(fēng)病情提供了合理解釋，表明白癜風(fēng)與銀屑病患者存在不同的致病細(xì)胞因子表達(dá)譜。van den Boorn等[7]之前分離白癜風(fēng)皮損CD8+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些CD8+T細(xì)胞在抗原刺激活化后，可分泌較多的IFN-γ及TNF-α，認(rèn)為活化的CD8+T細(xì)胞是這些細(xì)胞因子的主要來源。

最近大量研究證實(shí)，IFN-γ、TNF-α及IL-1β均可誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌趨化因子促使T細(xì)胞向外周組織定向遷移。有學(xué)者報(bào)道，白癜風(fēng)患者皮損高表達(dá)IFN-γ誘導(dǎo)型的Th1趨化因子CXCL10，伴隨高表達(dá)其受體CXCR3的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)；并在小鼠模型中證實(shí)CXCL10驅(qū)動(dòng)黑素細(xì)胞特異的CD8+T細(xì)胞向皮損處定向遷移，介導(dǎo)黑素細(xì)胞損傷；此外，使用CXCL10中和抗體可以阻止色素脫失并促進(jìn)白癜風(fēng)小鼠復(fù)色[2]。近期，我國(guó)項(xiàng)蕾紅研究團(tuán)隊(duì)通過臨床樣本研究證實(shí)，白癜風(fēng)患者血清中高表達(dá)CXCL10，與VASI(Vitiligo Area Scoring Index)評(píng)分正相關(guān)，而且進(jìn)展期白癜風(fēng)患者治療后其血清CXCL10水平降低[8]。因此，闡明CXCL10的表達(dá)機(jī)制對(duì)理解白癜風(fēng)的發(fā)病進(jìn)展及治療策略選擇，均具有重要意義。以往研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10可由角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌[9，10]。黑素細(xì)胞是否分泌CXCL10尚不清楚。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、TNF-α及IL-1β均可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分泌CXCL10，且以三者聯(lián)合效果最為顯著。此外，我們注意到TNF-α單獨(dú)刺激24 h黑素細(xì)胞顯著促進(jìn)CXCL10分泌，但其mRNA水平僅輕度上調(diào)無顯著差異。Harris等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理3 h后CXCL10 mRNA水平顯著上調(diào)，8 h后降至與對(duì)照組無差異；而ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)8 h時(shí)CXCL10分泌明顯高于對(duì)照組，表明TNF-α刺激后，CXCL10 mRNA與蛋白水平并不完全一致，這一現(xiàn)象為我們的研究提供了一定的解釋。

綜合我們的研究及國(guó)內(nèi)外進(jìn)展，我們提出，白癜風(fēng)皮損局部浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞活化后可分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，形成局部免疫微環(huán)境，可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分泌CXCL10，借此募集表達(dá)其受體CXCR3的CD8+T細(xì)胞遷移至皮損，進(jìn)一步促進(jìn)IFN-γ、TNF-α等的分泌，形成正反饋環(huán)路，放大白癜風(fēng)皮損局部免疫反應(yīng)。

綜上，我們明確了白癜風(fēng)皮損以IFN-γ、TNF-α及IL-1β顯著上調(diào)的免疫微環(huán)境，進(jìn)一步在體外證實(shí)這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞合成并分泌趨化因子CXCL10，促進(jìn)白癜風(fēng)局部T細(xì)胞免疫應(yīng)答，參與白癜風(fēng)發(fā)病及進(jìn)展。

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(收稿：2016-09-07 修回：2016-09-27)

Effects of immune microenvironment on the expression of CXCL10 in melanocytes of vitiligo

LIBowei,LIShuli,YANGYuqi,ZHANGWeigang,LIULing,GAOTianwen,LIChunying.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effects of immune microenvironment on the expression of CXCL10 in melanocytes of vitiligo. Methods: Quantitative Real-Time PCR was performed to detect the expression of cytokines in skin lesions from progressive vitiligo patients. And then, a melanocyte cell line-PIG1 was stimulated by the cytokines that were up-regulated in vitiligo lesions and to measure the expression and secretion of CXCL10 in PIG1 cells. Results: The mRNA level of IFN-γ, TNF-α and IL-1β were up-regulated in the skin lesions of progressive vitiligo patients. When a combined stimulation with the three cytokines, the expression and secretion of CXCL10 in PIG1 cells were up-regulated significantly, in a time-dependent manner. Conclusion: Immune microenvironment in vitiligo can promote the expression and secretion of CXCL10 in melanocytes, which may contribute to the onset of vitiligo.

vitiligo; immune microenvironment; melanocytes; CXCL10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81602764, 81472893)

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032

李春英，E-mail: lichying@fmmu.edu.cn