劉永濤，李樂，徐春娟，楊移斌，董靖，胥寧，楊秋紅，艾曉輝*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所， 湖北 武漢 430223；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430223；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院， 北京 100141; 4. 上海海洋大學(xué)， 上海 201306)

超高效液相色譜同時測定漁用飼料中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素

劉永濤1,2，李樂3，徐春娟4，楊移斌1，董靖1,2，胥寧1,2，楊秋紅1，艾曉輝1,2*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所， 湖北 武漢 430223；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430223；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院， 北京 100141; 4. 上海海洋大學(xué)， 上海 201306)

姜黃素是一種新的漁用飼料添加劑，但目前尚無測定魚飼料中姜黃素類化合物添加量檢測方法。本研究建立了魚飼料中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素同時測定的超高效液相色譜紫外法(UPLC-TUV)。方法采用乙醇作第一提取劑，乙腈為第二提取劑，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。以乙腈-0.1%乙酸水溶液(45∶55，V/V)為流動相，C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)為色譜柱，430 nm波長下進(jìn)行檢測。魚飼料中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素最低檢測限為10 μg/kg，定量限為25 μg/kg。在空白魚飼料中添加雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的水平在0.10～2.0 mg/kg時，平均回收率為87.68%～102.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.06%～8.01%。本方法為檢測魚飼料中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的添加量提供了一種技術(shù)手段。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016, 6(5):60-64]

漁用飼料；雙去甲氧基姜黃素；去甲氧基姜黃素；姜黃素；超高效液相色譜

雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素統(tǒng)稱為姜黃素類化合物[1]，3種化合物結(jié)構(gòu)相近，具有多種相似的藥理活性如具有保護(hù)腸黏膜、抗氧化、抗炎、抑菌、降血脂、保肝、利膽等[2]。但3種成分藥理活性又有所不同，姜黃素的抗氧化活性大于去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素，去甲氧基姜黃素降血脂的活性明顯高于姜黃素，雙去甲氧基姜黃素在利膽及對內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用方面，較去甲氧基姜黃素和姜黃素活性強(qiáng)[3-4]。姜黃素在促進(jìn)魚類生長、提高魚類消化酶活性和抗氧化力、增強(qiáng)免疫功能及改善肌肉品質(zhì)和魚體色澤等方面具有一定作用[5]。漁用飼料中添加姜黃素可顯著提高羅非魚(Oreochromisspp)、攀鱸(Anabastestudineus)、虹鱒(Salmogairdneri)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)的抗氧化能力[6-8]。姜黃素可以促進(jìn)大黃魚(Pseudosdaenacrocea)的生長、增強(qiáng)大黃魚皮膚與肌肉的著色[9]。飼料中添加姜黃素可以顯著提高草魚腸道中蛋白酶和淀粉酶的活性，促進(jìn)魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[10]。飼料中添加姜黃素還能夠預(yù)防魚腸炎病、小瓜蟲病、赤皮病等疾病[11]?？梢?，在漁用飼料中添加姜黃素類化合物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景，2014年農(nóng)業(yè)部已批準(zhǔn)姜黃素作為新飼料添加劑使用。

姜黃素作為一種新的漁用飼料添加劑，實際包含姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素等，天然提取的姜黃素中這3種成分比例相對穩(wěn)定，姜黃素含量約占70%，去甲氧基姜黃素含量約為10%～20%，雙去甲氧基姜黃素含量約為10%[12]。目前，有關(guān)同時測定雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素測定的方法多是針對姜屬植物[13-17]，尚未見有飼料中同時測定這3種成分的報道。因此，建立同時測定漁用飼料中這3種成分的含量方法，不僅檢測其含量是否符合飼料中姜黃素標(biāo)示添加量，同時還可以評判姜黃素飼料添加劑的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜帶雙通道紫外(TUV)檢測器(美國Waters公司)；Mettler-TOLEDO AE-240型精密電子天平(梅特勒-托利多公司)；HITACHI 20PR-520型自動高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；FS-1高速勻漿機(jī)(華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)；HQ-60-Ⅱ旋渦混合器(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；HGC-12氮吹儀(HENGAO T&D公司)。

雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司)；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.9%，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、乙酸、乙酸乙酯、正己烷(色譜純，美國J.T.Baker公司)；超純水由實驗室用美國Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)制備。

漁用膨化飼料購自武漢白沙洲農(nóng)副產(chǎn)品大市場，將漁用膨化飼料用粉碎機(jī)粉碎后過20目篩裝到封口塑料袋中，經(jīng)檢測不含雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的漁用飼料用于本實驗，常溫下儲存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確至0.001 g)雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素對照品，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃冰箱中冷藏保存。用乙腈逐級稀釋成500和25 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3 漁用飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

在5.0 g空白魚飼料中分別添加不同體積雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按1.5方法處理后，得到質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/kg漁用飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 方法回收率、精密度、最低檢測限和定量限

分別在漁用飼料空白樣品中添加4個濃度水平的雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品含量分別為0.10、0.50、1.00、2.00 mg/kg，每個含量水平做6個平行，每個平行設(shè)一個空白對照，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。定加標(biāo)樣品，以大于3倍和10倍信噪比分別計算雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素在魚飼料中的最低檢測限和定量限。

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取已粉碎并過20目的漁用飼料粉5.0 g置于50 mL離心管中，向離心管中加入20 mL乙醇，渦旋振蕩30 s，超聲提取5 min，室溫條件下，8 000 r/min離心5 min，將上層乙醇提取液轉(zhuǎn)移到125 mL棕色雞心瓶中，用20 mL乙醇重復(fù)提取一次，合并提取液至125 mL棕色雞心瓶中，將雞心瓶置40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將提取液濃縮至干，用6 mL乙腈分兩次將雞心瓶中的殘渣轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，將10 mL離心管置45 ℃氮吹儀上氮吹至干，用1 mL流動相定容，渦旋振蕩30 s，8 000 r/min離心5 min，離心后的液體過0.22 μm聚醚砜濾頭過濾到棕色進(jìn)樣瓶中，上UPLC-TUV測定。實驗操作在避光條件下進(jìn)行。

1.6 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)反相色譜柱；柱溫為30 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。等度洗脫條件：A相為乙腈，B相為0.1%乙酸水溶液，A相和B相的體積比為45∶55；紫外檢測波長為430 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

由于雙去甲氧基姜黃素在自然光照條件下不穩(wěn)定[4]，所以本實驗應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素不溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、乙腈等有機(jī)溶劑。本實驗分別選用乙酸乙酯、乙醇、乙腈作為提取溶劑，以提取回收率為評判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提取溶劑的篩選。結(jié)果表明，乙酸乙酯對雙去甲氧基姜黃素的提取率(約30%)較乙腈和乙醇的低，3種溶劑對去甲氧基姜黃素和姜黃素的提取率相當(dāng)，但乙腈和乙醇對3種姜黃素類化合物的提取率也僅為50%左右，因此，本試驗采用了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對3種姜黃素類化合物進(jìn)行定量，同時考慮到成本因素，最終選擇乙醇作為提取劑。實驗中發(fā)現(xiàn)如果將乙醇提取液直接濃縮至干后加入流動相溶解渣，樣品乳化現(xiàn)象嚴(yán)重。本實驗分別采用加入①2 mL水+6 mL乙酸乙酯，②6 mL乙腈進(jìn)行二次提取對樣品進(jìn)行凈化，結(jié)果表明，通過方法①用水溶解除去樣品中水溶性雜質(zhì)，再用乙酸乙酯進(jìn)行反萃取，將乙酸乙酯置氮吹儀上吹干后會在試管底部形成油滴，再加入定容溶液后樣品中會有小油滴存在進(jìn)而影響分析，如果采用正己烷去脂會使目標(biāo)物的回收率降低；通過方法②樣品經(jīng)乙腈二次提取，置氮吹儀上吹干后用流動相定容、離心，過濾后樣品澄清，經(jīng)UPLC-TUV檢測基線平穩(wěn)，目標(biāo)峰附近無雜峰干擾，因此，選擇了乙腈作為第二提取劑。本實驗也嘗試采用乙腈第一提取劑，乙醇作第二提取劑也能取得較好的樣品處理效果，從樣品處理效果和樣品制備成本綜合考慮最終選擇了乙醇作為第一提取劑，乙腈作為第二提取劑。

2.2 超高效液相色譜分析

分離雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的液相色譜流動相的報道有0.01 moL/L磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈[12]，乙腈-3%醋酸[13]，乙腈-4%冰醋酸[14]，甲醇-0.5%冰醋酸[15]，乙腈-0.5%冰醋酸[16]，甲醇水溶液-甲基叔丁基醚[17-18]，上述流動相大多成分復(fù)雜，配制繁瑣，分離測定上述3種姜黃素類化合物所需時間長(12～25 min)。本實驗采用具有更好的分離度、更高的靈敏度和更快的分析速度的超高效液相色譜[19]分離測定3種姜黃類化合物，以乙腈-0.1%乙酸(45∶55，V/V)為流動相(流動相成分簡單，配制方便)，一個樣品的分析時間僅為5 min，且能將雙去甲氧基姜黃素中另一種未知組分分離出來(圖1和圖3)，而上述報道的液相色譜法是無法將雙去甲氧基姜黃素中另一未知組分分離出來。

2.3 漁用飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)指數(shù)

將1.3制備的漁用飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度C和峰面積A作線性回歸，獲得魚飼料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素在0.01～10.00 mg/kg范圍內(nèi)均呈線性相關(guān)，相關(guān)指數(shù)R2≥0.998 8，結(jié)果見表1。

表1 雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)指數(shù)

Tab. 1 Matrix-fortified calibration curves and related coefficients for bisdemethoxycurcumin,demethoxycurcumin and curcumin

化合物Compound線性范圍/(mg·kg-1)Linearrange回歸方程Regressionequation相關(guān)指數(shù)R2Correlationcoefficient雙去甲氧基姜黃素Bisdemethoxycurcumin0.01～10.00A=309653C-1800.70.9996去甲氧基姜黃素Demethoxycurcumin0.01～10.00A=260877C-3340.60.9990姜黃素Curcumin0.01～10.00A=256059C-14903.00.9988

2.4 方法回收率、精密度、最低檢測限和定量限

如表2所示，本方法平均回收率為87.68%～102.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.06%～8.01%。標(biāo)準(zhǔn)

溶液、飼料空白及加標(biāo)樣品色譜圖見圖1～圖3。雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素在魚飼料中的最低檢測限均為10 μg/kg，定量限均為25 μg/kg。

表2 樣品中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

Tab. 2 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSD) of bisdemethoxycurcumin,demethoxycurcumin and curcumin in samplesn=6

圖1 100 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 1：雙去甲氧基姜黃素；2：去甲氧基姜黃素；3：姜黃素。下同。Fig. 1 Chromatogram of a mixture standard solution of 100 μg·L-11: Bisdemethoxycurcumin; 2: Demethoxycurcumin; 3: Curcumin. The same blew.

圖2 漁用飼料空白色譜圖Fig. 2 Chromatogram of fishery feed blank

圖3 50 μg·kg-1 姜黃素類化合物加標(biāo)色譜圖Fig. 3 Chromatogram of spiked sample with 50 μg·kg-1 curcuminoid

2.5 實際樣品分析

利用本方法對市售草魚育成配合飼料、鯽育成配合飼料、黃顙魚配合飼料共15個樣品進(jìn)行檢測，未檢出雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素。

3 結(jié)論

本方法中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素在0.01～10.00 mg/kg范圍內(nèi)均呈良好的線性相關(guān)，方法回收率高于87.68%，精密度小于8.01%，檢測限和定量限分別為10和25 μg/kg。本研究首次報道了漁用飼料中雙甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的測定方法，采用超高效液相色譜作為分析儀器，與普通的高效液相色譜相比，縮短了分析時間，提高了分析效率，適用于大批量漁用飼料的檢測。

[1] 王琰, 王慕鄒. 姜黃屬常用中藥的研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2001, 36(2): 81.

[2] 趙春萍, 荀文娟, 曹婷, 等. 姜黃素作為飼料添加劑的研究進(jìn)展[J]. 動物營養(yǎng), 2014, 12: 20-23.

[3] 韓剛, 崔靜靜, 畢瑞, 等. 姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素穩(wěn)定性研究[J].中國中藥雜志, 2008, 33(22): 2611-2614.

[4] 趙欣, 王愛里, 袁園, 等. 姜黃中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的光穩(wěn)定性分析[J]. 中草藥, 2013, 44(10): 1338-1341.

[5] 關(guān)燕云, 解文麗, 艾春香. 姜黃素的生理功能及 其在水產(chǎn)配合飼料中的應(yīng)用[J]. 中國飼料, 2015, 16: 11-15.

[6] 鄭清梅, 陳興發(fā), 溫小波. 姜黃素對羅非魚生長、消化和抗氧化能力的影響研究[C]//第七屆世界華人魚蝦大會論文集. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所， 2008.

[7] Manju M, Akbarsha M A, Oommen O V.Invivoprotective effect of dietary curcumin in fishAnabastestudineus(Bloch) [J].Fish Physiol Biochem, 2012, 38(2): 309-318.

[8] 史合群, 周永奎, 謝曉暉. 姜黃素的生理功能及其在水產(chǎn)飼料工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 飼料研究, 2013 (6): 9-11.

[9] 王進(jìn)波, 吳天星. 姜黃素在大黃魚飼料中的應(yīng)用效果研究[J]. 水利漁業(yè), 2007, 27(6): 105-106.

[10] 胡忠澤, 楊久峰, 譚志靜, 等. 姜黃素對草魚生長和腸道酶活力的影響[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2003 (11): 29-30.

[11] 牛生洋, 郝峰鴿, 許秋亞. 姜黃素的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 河南科技學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2008, 12, 36(4): 58-61.

[12] Revathy S, Elumalai S, Benny M, et al. Isolation, Purification and identification of curcuminoids from turmeric (CurcumalongaL.) by column chromatography[J].J Food Sci, 2011, 2(7): 21-25

[13] 趙欣, 袁丹, 王啟隆, 等. 姜黃提取物中姜黃素類成分定量分析方法研究[J]. 藥物分析雜志, 2005, 25(6): 643-647.

[14] 張韻慧, 張丹, 王妍, 等. HPLC內(nèi)標(biāo)法測定姜黃中姜黃素類成分的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2009, 44(18): 1423-1425.

[15] 孫靜, 孫艷濤, 張振秋, 等. 中藥莪術(shù)中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的含量測定[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2010, 8: 714-716.

[16] 蔡穎, 宋坤, 徐杰, 等. 不同來源莪術(shù)中姜黃素類成分的含量差異研究[J]. 藥學(xué)與臨床研究, 2014, 22(6): 502-505.

[17] 史晶晶, 馮素香, 郝蕊, 等. 姜黃提取物中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的含量測定[J]. 中醫(yī)學(xué)報, 2015, 30(6): 853-855.

[18] 張盼盼, 錢疆, 楊方, 等. 高效液相色譜法檢測食品中姜黃素類化合物[J]. 分析測試學(xué)報, 2013, 32(9): 1127-1130.

[19] 楊方, 張盼盼, 錢疆, 等. 高效液相色譜同時檢測淀粉類食品中添加的姜黃色素與類胡蘿卜素化合物[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2014, 26(6): 558-562.

[20] 朱瑞芝, 王凱, 吳新華, 等. 超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時快速測定煙葉中的幾種芳香酸和酚酸[J]. 分析試驗室, 2009, 28(10): 108-112.

Simultaneous determination of bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin and curcumin in fishery feed by UPLC

LIU Yongtao1, 2, LI Le3, XU Chunjuan4, YANG Yibin1, DONG Jing1, 2, XU Ning1, 2, YANG Qiuhong1, AI Xiaohui1, 2*

(1. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China;2. Hubei Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center，Wuhan 430223, China;3. Chinese Academy of Fishery Sciences， Beijing 100141, China; 4. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Since there is no analytical method for determination of 3 curcuminoids in fishery feed, it is necessary to establish an ultra-high performance liquid chromatographic (UPLC) method for simultaneous determination of bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin and curcumin in fishery feed. Ethanol was used as the first extraction solvent, and acetonitrile as the second extraction solvent, and matrix-fortified standard curve for quantification. Analytes were separated on C18column (2.1 mm× 100 mm) and detected at 430 nm wavelength by UPLC. The detection limits and quantification limits for bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin and curcumin were both 10 and 25 μg/kg in fishery feed. The average recoveries of bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin and curcumin in fishery feed were from 87.68% to 102.06% at the spiked level of 0.10 - 2.0 mg/kg. The relative standard deviations were from 1.06% to 8.01%. The present method provides a technical means for simultaneous determination of bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin and curcumin in fishery feed. [China Fishery Quality and Standard, 2016, 6(5): 60-64]

fishery feed; bisdemethoxycurcumin; demethoxycurcumin; curcumin; UPLC

AI Xiaohui, aixh@yfi.ac.cn

2016-06-14接收日期：2016-08-02

典型化學(xué)物污染淡水水產(chǎn)品質(zhì)量安全綜合防治技術(shù)方案(鄂、皖、川、渝片區(qū))(201503108-C-C-1);中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(2016JBF0104)

劉永濤(1979-)，男，副研究員，研究方向為水產(chǎn)動物藥理與水產(chǎn)品質(zhì)量安全，liuyt@yfi.ac.cn

艾曉輝，研究員，研究方向為水產(chǎn)動物藥理與藥殘控制技術(shù)，aixh@yfi.ac.cn

S94

：A

：2095-1833(2016)05-0060-05