劉書貴，尹怡，李麗春，單奇，朱新平，馬麗莎，戴曉欣，鄭光明

(中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)種質(zhì)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(廣州)，廣東 廣州510380)

QuEChERS結合HPLC-MS-MS測定鯪體內(nèi)孔雀石綠及其代謝物殘留及消除規(guī)律

劉書貴，尹怡，李麗春，單奇，朱新平，馬麗莎，戴曉欣，鄭光明*

(中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)種質(zhì)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(廣州)，廣東 廣州510380)

通過對干燥劑、分散吸附劑的種類及質(zhì)量進行對比及優(yōu)化，對鯪體內(nèi)孔雀石綠(MG)及其代謝物的分散固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(QuEChERS-HPLC-MS/MS)聯(lián)用方法進行了優(yōu)化。方法以乙腈為萃取溶劑，無水硫酸鎂為干燥劑，乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)與石墨化炭黑(GCB)為分散吸附劑，電噴霧正離子模式(ESI+)，多反應監(jiān)測模式，內(nèi)標法定量。結果顯示，無水硫酸鎂對樣品中水分干燥效果良好，50 mg PSA+10 mg GCB可達到凈化效果。在優(yōu)化條件下，MG和無色孔雀石綠(LMG)在1～50 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關，相關系數(shù)r分別為0.999 21和0.999 37；方法檢測限(LOD,S/N=3)為0.5 μg/kg。采用該方法對鯪空白樣品進行檢測及加標回收率的測定，在2.0、10、25 μg/kg 3個濃度水平下，MG的加標回收率為82.5%～92.6%，LMG的加標回收率為84.6%～95.1%。將該方法用于鯪體內(nèi)MG及LMG殘留消除規(guī)律研究，得到MG和LMG的消除半衰期分別為13.6、178.3 h，表明MG在鯪體內(nèi)消除相對較快，但是其主要代謝產(chǎn)物LMG消除緩慢，直到40 d后低于檢測限。本研究可為鯪等水產(chǎn)品中MG和LMG的檢測提供支持技術，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供參考數(shù)據(jù)。 [中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2016,6(5):45-51]

QuEChERS；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；鯪；孔雀石綠；無色孔雀石綠；殘留；消除

孔雀石綠(C23H25ClN2, malachite Green, MG)又名堿性綠，是一類具有較強殺菌能力的染料類藥物，被廣泛用于紡織業(yè)、制陶業(yè)、皮革業(yè)及作為食品染色劑和細胞化學染色劑等[1]，應用于預防或治療水產(chǎn)動物多種疾病，如水霉病、爛鰓病和小瓜蟲病等，特別在治療水霉病上具有非常顯著的作用[2-3]。MG被水產(chǎn)動物吸收后，大部分會快速地代謝為親脂性的無色孔雀石綠(leuco-malachite Green, LMG)。由于MG及其代謝產(chǎn)物LMG在魚體內(nèi)殘留時間較長，且均具有高毒性、高殘留性和“三致”(致癌、致畸、致突變)等副作用[4-7]，為美國、日本和英國等國家所禁用[8-11]。

中國農(nóng)業(yè)部于2002年5月發(fā)布的《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》文件(農(nóng)牧發(fā)[2002]1號)中明確規(guī)定，所有可食用動物組織中不得檢出MG及LMG。但是由于MG抗菌效果好、價格便宜等原因，偶有部分養(yǎng)殖戶在鱖(Sinipercachuatsi)及其餌料魚鯪(Cirrhinusmolitorella)的孵化及養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用。若鱖食用了經(jīng)MG藥浴的鯪，有可能會造成其體內(nèi)MG及LMG的殘留。

目前水產(chǎn)品中MG及LMG的檢測方法主要依據(jù)國家標準GB/T19857—2005[12]，該方法萃取方式簡單、但耗時較長，某些水產(chǎn)品中色素和脂肪等雜質(zhì)無法有效去除。分散固相萃取法(QuEChERS)是一種快速、簡易的前處理方法[13]，即提取液中直接加入吸附劑粉進行凈化，離心后對上清液進行上機檢測。該方法最初用于多種農(nóng)藥在水果、蔬菜基質(zhì)中同時測定時的前處理[14-15]，近年來也用于動物源食品的前處理[16-17]。為了研究鱖體內(nèi)MG的可能來源，本研究首先以鯪為受試對象，用藥浴的方式模擬自然養(yǎng)殖條件，研究MG及LMG在鯪體內(nèi)的蓄積和消除規(guī)律，旨在為水產(chǎn)品中MG和LMG的檢測提供支持技術，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料與養(yǎng)殖場所

實驗用鯪(Cirrhinusmolitorella)由中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所良種基地提供，平均體重為(2.0±0.5)g，體長為(4.0±0.5)cm，約5 000尾，經(jīng)測定無MG及LMG殘留；養(yǎng)殖場所位于廣州市中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所內(nèi)的0.2 hm2池塘，掛網(wǎng)箱養(yǎng)殖。

1.1.2 試劑與藥品

MG和LMG標準品由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供，純度≥95%；孔雀石綠-D5(D5-MG)和無色孔雀石綠-D6(D6-LMG)標準品由德國Witega公司提供，純度>99%。乙腈和甲醇(色譜純，德國Merck公司)，甲酸(色譜純，日本TCI公司)，乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、中性氧化鋁(Alumina-N)、弗羅里硅土(Florisil)(Technologies，Agela公司)，無水硫酸鎂、無水乙酸銨、冰乙酸均為分析純，水為超純水。

1.1.3 主要儀器和設備

Waters e2695-Quattro Micro API三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters 公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela公司)；離心機(上海飛鴿公司)；勻漿機(德國IKA T18)；超聲波水浴(寧波新芝公司)；漩渦振蕩器(德國IKA MS3)。

1.2 殘留消除實驗

1.2.1 實驗分組及給藥

實驗魚購回后放入養(yǎng)殖網(wǎng)箱中，實驗設1個空白對照組與2個實驗組，暫養(yǎng)7 d。待鯪正常攝食后，將2個實驗組鯪分別置于質(zhì)量濃度理論值為1 000 μg/L孔雀石綠水溶液中藥浴1 min后撈出，并再次分別放入2個網(wǎng)箱中喂養(yǎng)。實驗期間水溫約為(28±2)℃，每天投喂3次飼料。

1.2.2 樣品采集

藥浴后于0、6、24、48、120、360、480、720、960、1 200和2 160 h取全魚樣品，每個時間點從2個實驗組中分別采3個平行樣，每個樣品重量以滿足檢測為宜，共6個平行。樣品于-20 ℃條件下保存，待測。根據(jù)實驗需要可能需要采集更長時間點樣品。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備液和標準工作液根據(jù)參考文獻[12]進行。

1.3.2 樣品前處理

稱取5.0 g已絞碎樣品于50 mL離心管中，加入200 μL混合內(nèi)標標準溶液，加入5 g無水硫酸鎂和11 mL乙腈，超聲波振蕩提取2 min，8 000 r/min勻漿提取30 s，4 200 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中；另取一50 mL離心管加入11 mL乙腈，洗滌刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，用玻璃棒搗碎離心管中沉淀，渦旋振蕩30 s，超聲波振蕩5 min，4 200 r/min離心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25 mL，搖勻備用。

準確移取5.00 mL樣液于磨口玻璃管中，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(1∶1，V/V)定容至2.00 mL后轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加入50 mg PSA+10 mg GCB，渦旋混合1 min，12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為XTerra MS C18柱，100 mm×2.1 mm(i.d.)，粒度3.5 μm。流動相A為乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L，pH=4.5)，流動相B為乙腈，流速0.20 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，梯度洗脫條件如表1。

表1 梯度洗脫條件

Tab.1 Conditions of gradient elution

序號No.洗脫時間/minElutiontime流動相A/%φ(A)流動相B/%φ(B)流速/(mL·min-1)Flowrate1020800.202*201000.203901000.204*1020800.20

注：*表示上一梯度結束立即改變流動相百分比。

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用大氣壓電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；電離電壓3.5 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速700 L/h；掃描模式為反應監(jiān)測(MRM)。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

MG和LMG在鯪體內(nèi)的殘留數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示。通過PKSolver 2.0軟件將濃度平均值-時間數(shù)據(jù)進行分析，計算出平均消除速率和消除半衰期。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

Tab.2 MS parameters

被測物Analytes母離子Parention子離子Production錐孔電壓/VDeclustingpoten-tial碰撞能量/eVCollisionenergy駐留時間/sDwelltimeMG329.0208.158350.2329.0313.0**58370.2LMG331.0239.140300.2331.0316.0**40200.2D5-MG334.0318.070350.2D6-LMG337.1322.060200.2

注：帶**的子離子用作定量分析。

2 結果與分析

2.1 提取方法的優(yōu)化

實驗中鯪作為鱖的餌料魚，因體積小，難以只取肌肉，所以多條餌料魚一起絞碎成肉糜。采用加入無水硫酸鎂的方式消除樣品中水分，使旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)效率比沒添加時提高40%。實驗表明采用該方式提取，蒸發(fā)效率更高，耗時更少。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS方法常用到的凈化劑有PSA、GCB、Alumina-N和Florisil等。本研究考察這4種吸附劑對目標化合物的吸附效果及回收率情況。取適量10 ng/mL MG及LMG的基質(zhì)混合標準工作液，與其內(nèi)標標準工作液混合配成標樣為5 ng/mL和內(nèi)標為2 ng/mL的混合標準液，分別加入50 mg PSA、GCB、Alumina-N和Florisil，經(jīng)振蕩離心后，過0.22 μm濾膜后上機測定，由圖1可知，除GCB外，經(jīng)PSA、Alumina-N和Florisil處理后MG和LMG的回收率均介于86.7%～95.4%之間，但Alumina-N和Florisil處理后的樣品色素、油脂等雜質(zhì)仍然較多。經(jīng)PSA處理后，能有效去除樣品中脂肪酸、有機酸、酚類及少量色素等極性雜質(zhì)[18]，但譜圖上依然有少許雜質(zhì)干擾。用GCB可以去除樣品中色素及非極性雜質(zhì)[18]，實驗發(fā)現(xiàn)前處理過程中加入適量GCB粉末，凈化效果更好。故本實驗選擇PSA和GCB混合粉末作為吸附凈化劑。

本研究對PSA和GCB的添加量進行優(yōu)化。結果顯示，添加量為5 μg/kg的MG樣品溶液中加入50 mg PSA+10 mg GCB即可達到凈化效果。若繼續(xù)增加PSA回收率仍然維持在84.5%～96.2%；若繼續(xù)增加GCB造成基質(zhì)效應增大直至檢測不到，添加GCB到50 mg后回收率如圖2。故實驗選擇50 mgPSA+10 mg GCB對樣品進行凈化。

圖1 不同吸附劑對MG及LMG回收率的影響Fig.1 Effects of different sorbents on the recovery of MG and LMG(n=4 )

圖2 繼續(xù)添加PSA或GCB對MG及LMG回收率的影響Fig.2 Effects of continuing adding PSA or GCB on the recovery of MG and LMG (n=4 )

2.3 無色孔雀石綠及孔雀石綠檢測色譜圖

如圖3所示，LMG和MG標準品基線走動平穩(wěn)，無雜峰干擾，保留時間分別為3.46和1.20 min。圖4中B1和B2分別為鯪藥浴30 d后LMG和MG在肌肉中的檢測色譜圖。

圖3 無色孔雀石綠和孔雀石綠標準品檢測色譜圖 A1：無色孔雀石綠色譜圖；A2：孔雀石綠色譜圖。Fig.3 Detection chromatograms of LMG and MG standards (10 ng·mL-1) A1: Detection chromatograms of LMG; A2: Detection chromatograms of MG.

圖4 藥浴30 d后鯪的無色孔雀石綠和孔雀石綠檢測色譜圖 B1：無色孔雀石綠色譜圖；B2：孔雀石綠色譜圖。Fig.4 Detection chromatograms of LMG and MG of Cirrhina molitorella medicated bath after 30 d B1: Detection chromatograms of LMG; B2: Detection chromatograms of MG.

2.4 標準曲線與線性范圍

在質(zhì)量濃度1～50 ng/mL范圍內(nèi)以響應值(Y)與標樣質(zhì)量濃度(X)繪制標準工作曲線，MG和LMG的標準曲線方程分別為Y=2.736 24X+0.234 70和Y=2.365 74X+0.274 30，相關系數(shù)r分別為0.999 21和0.99937，因而在該濃度范圍內(nèi)MG和LMG的濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性相關。信噪比(S/N)為3時計算檢測限(LOD)，結果得到MG和LMG的LOD均為0.5 μg/kg。

2.5 回收率和精密度

在加標水平2.0～25 μg/kg時，MG和LMG的回收率及相對標準偏差見表3。

表3 空白基質(zhì)加標回收率和精密度

2.6 鯪體內(nèi)MG及LMG隨時間的殘留變化情況

藥浴后鯪體內(nèi)MG和LMG在不同時間點的殘留量變化見表4和圖5。研究結果顯示，停止藥浴后，MG和LMG在鯪體內(nèi)呈現(xiàn)遞減趨勢。在0～6 h范圍內(nèi)，鯪體內(nèi)的MG和LMG的殘留量都急劇下降。MG由(36.40±3.45)μg/kg急劇下降到(7.30±4.12) μg/kg，LMG由(41.50±4.21) μg/kg 急劇下降到(13.90±2.76) μg/kg。隨后MG緩慢下降至2 d后低于檢測限，而LMG在鯪體內(nèi)的消除時間更長，呈現(xiàn)波動式下降至40 d后低于檢測限。本實驗MG在鯪體內(nèi)的消除半衰期為13.6 h，平均消除速率為3.81 μg/(kg·h)，而LMG的消除半衰期為178.3 h，平均消除速率為0.58 μg/(kg·h)，表明MG在鯪體內(nèi)消除相對較快，但是其主要代謝產(chǎn)物LMG消除緩慢，直到40 d后低于檢測限。

表4 鯪體內(nèi)MG和LMG的殘留量

注：ND表示未檢出。

圖5 MG和LMG殘留量的變化Fig.5 Changes of MG and LMG residues in Cirrhina molitorella (n=6)

3 討論

本研究中鯪在全魚絞碎成糜后存在大量水分，在前處理方法中添加干燥劑無水硫酸鎂，可有效消除樣品中的水分，與國標方法[12]相比，能夠有效提高旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)效率，縮短前處理時間。選擇凈化組合50 mg PSA+10 mg GCB，PSA能有效去除樣品中脂肪酸、有機酸、酚類及少量色素等極性雜質(zhì)[18]， GCB可以去除樣品中色素及非極性雜質(zhì)[18]，使儀器基線噪音降低，目標物的靈敏度上升。傳統(tǒng)的樣品前處理通常采用液液分配或固相萃取等方法凈化樣品，這些方法耗時長，有機溶劑消耗量大，不利于環(huán)保。與傳統(tǒng)方法相比，本研究方法節(jié)省了有機溶劑用量，縮短樣品前處理時間，方法快速、簡便、易行，可滿足復雜基質(zhì)樣品中的MG分析。

本實驗將鯪置于1 000 μg/L MG水溶液中藥浴1 min后撈出，因MG濃度較大、藥浴時間短暫，藥浴期間的樣品采集沒有進行。藥浴后樣品中MG在2 d后低于檢測限，而LMG在其體內(nèi)的消除時間更長至40 d后才低于檢測限。尹怡等[19]研究報道，將經(jīng) 1 mg/L MG 溶液浸泡 2 min 后的鯪連續(xù)喂鱖10 d后，到6 d時鱖體內(nèi)的LMG殘留量為(5.88±0.13) μg/kg，由此可知養(yǎng)殖過程中陽性餌料魚體內(nèi)的MG 會通過食物鏈傳遞給鱖，造成鱖體內(nèi) LMG 檢出。但由于受藥物濃度、藥浴時間或受試對象的種類等因素影響，MG及LMG在受試對象體內(nèi)的消除時間不盡相同。楊賢慶等[20]用 0.5 和 2 mg/L兩個質(zhì)量濃度的 MG 溶液分別對大、小規(guī)格淡水養(yǎng)殖羅非魚藥浴 1 h，同時用2 mg/L MG 溶液分別對小規(guī)格的淡水和小規(guī)格的咸淡水養(yǎng)殖的羅非魚藥浴 1 h，到第60天時所有組羅非魚肌肉中都檢測不到 MG，而LMG 依然可以檢到；大規(guī)格羅非魚MG和LMG代謝快于小規(guī)格的羅非魚；藥浴濃度與MG和LMG 殘留濃度及殘留時間呈正相關。劉永濤等[21]用7 mg/L MG 溶液對斑點叉尾魚苗浸泡5 min，斑點叉尾肌肉中45 d 時未能檢測到 MG，90 d 時未能檢測到 LMG。高露姣等[22]研究報道歐洲鰻鱺在200 μg/L的MG溶液中藥浴12 h，至清水中120 d時MG的殘留量為(6.0±4.7) μg/kg，LMG的殘留量為(12.0±6.7) μg/kg。因此魚的種類、大小以及藥浴時間等因素都會影響到MG的代謝及消除規(guī)律，但總體規(guī)律相似。

4 結論

本研究以無水硫酸鎂為干燥劑，經(jīng)50 mg PSA+10 mg GCB凈化，有效去除上機樣品中的基質(zhì)雜質(zhì)。優(yōu)化后的方法快速、簡單和準確，適用于基質(zhì)脂肪和色素含量大、水分含量多的樣本檢測。鯪體內(nèi)MG的殘留消除實驗表明，MG消除較快，代謝產(chǎn)物LMG在鯪體內(nèi)的消除期較長，直到40 d后低于檢測限。如果將含有MG或LMG的鯪喂養(yǎng)鱖，可能會造成鱖中MG或LMG的殘留，因此必須嚴禁MG在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。

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Studies on the residue and elimination rules of malachite green and its primary metabolite in mud carp (Cirrhina molitorella) by QuEChERS extraction and high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

LIU Shugui，YIN Yi，LI Lichun， SHAN Qi，ZHU Xinping，MA Lisha，DAI Xiaoxin，ZHENG Guangming*

(Ministry of Agriculture/Ministry of Agriculture Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Product (Guangzhou ),Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Pearl River Fisheries Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380，China)

QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) extraction and high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (QuEChERS-HPLC-MS/MS) were optimized by comparing and optimizing desiccants and adsorbents for determination of malachite green (MG) and its primary metabolite (i.e. leuco-malachite green, LMG) in mud carp (Cirrhinamolitorella) in the study. The extraction method of mud carp tissues adopted acetonitrile as extractants, anhydrous magnesium sulfate as a desiccant, and the mixture of primary secondary amine (PSA, 50 mg) and graphitized carbon blacks (GCB, 10 mg) as adsorbents. The identification of malachite green (MG) and leuco-malachite green (LMG) was achieved by using electrospray ionization in positive ion mode (ESI+) under multiple reaction monitoring mode. The quantitative analysis of MG and LMG was performed by the internal standard method. Under the optimized condition, MG and LMG showed a good linearity in their concentration range of 1～50 ng/mL with the correlation coefficient of 0.998 77 and 0.997 32, respectively. Both of their detection limits(LOD,S/N=3)were 0.5 μg/kg. The recoveries of MG and LMG at three spiked levels of 2, 10 and 25 μg/kg were ranged of 82.5%～92.6% and 84.6%～95.1% respectively. By applying the proposed method to study the residues and elimination rules of malachite green and its primary metabolite in mud carp, results showed that the elimination half life of MG and LMG were 13.6 and 178.3 h, respectively. It suggested that MG was depleted relative faster in mud carp. In contrast, the elimination of LMG, as the main metabolite of MG, was slower, and the content of LMG was below the detection limit until 40 d. The study would provide technical supports for detection of MG and LMG and reference data for quality safety of aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(5):45-51]

QuEChERS; HPLC-MS/MS;Cirrhinamolitorella; malachite green; leuco-malachite green; residue; elimination

ZHENG Guangming，zgmzyl1964@163.com

2016-05-21；接收日期：2016-07-28

水產(chǎn)品養(yǎng)殖禁限用藥物調(diào)查與產(chǎn)品安全性評估(GJFP201501001)；廣東省質(zhì)量安全專項項目

劉書貴(1985-)，男，助理研究員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全，liu19851218@126.com

鄭光明，研究員，研究方向為水產(chǎn)種質(zhì)資源學和水產(chǎn)品質(zhì)量安全，zgmzyl1964@163.com

S94

：A

：2095-1833(2016)05-0045-07