譚 雅

李宗軍

李 珂

吳根梁

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

?

適合牛肉嫰化的微生物菌株的分離、篩選與鑒定

譚 雅

李宗軍

李 珂

吳根梁

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為篩選得到適合嫩化牛肉的優(yōu)良菌株，從貴州傳統(tǒng)豆豉和甜酒曲分離得到產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌22株；以酶活值為主要指標(biāo)，牛肉的質(zhì)構(gòu)特性為參考指標(biāo)，對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)篩，最終確定D7為最優(yōu)菌株，酶活達(dá)71.68 U/g。結(jié)合16S rDNA序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，對(duì)目的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明：D7與解淀粉芽孢桿菌(JN700123.1)最為接近，相似度達(dá)99%，該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

蛋白酶；酶活；解淀粉芽孢桿菌；質(zhì)地剖面分析(TPA)；16S rDNA

隨著人們?nèi)馐辰Y(jié)構(gòu)的改變和生活水平的不斷提高，牛肉越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，而牛肉的嫩度是影響消費(fèi)者評(píng)定牛肉質(zhì)量最重要的一個(gè)因素[1]，所以肉類嫩化的相關(guān)研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一。在中國(guó)部分役用牛、水牛和山區(qū)放養(yǎng)的老齡黃牛也被適時(shí)地作為肉用，這類牛肉的質(zhì)構(gòu)特性相對(duì)較差，但對(duì)中國(guó)肉食結(jié)構(gòu)的改善是重要的補(bǔ)充。特別是在欠發(fā)達(dá)地區(qū)和中檔以下的餐廳具有較大的市場(chǎng)，采取科學(xué)、有效、安全的技術(shù)措施，改善這類牛肉的品質(zhì)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。牛肉嫩化的方法主要包括電刺激法[2]、機(jī)械嫩化法[3]、高壓嫩化法[4]、超聲波嫩化法[5]、外源酶嫩化法[6]等，從目前效果來(lái)看，外源性蛋白酶技術(shù)可使牛肉柔軟且易于咀嚼，能很好地提高牛肉的品質(zhì)。但是目前市場(chǎng)上，嫩肉粉魚(yú)龍混雜，產(chǎn)品質(zhì)量不一，組成成分各異，存在一定的安全隱患，動(dòng)植物來(lái)源的蛋白酶由于受到原料的限制，實(shí)際應(yīng)用因成本問(wèn)題而有一定的困難。微生物源的單一蛋白酶對(duì)于肉品的嫩化效果不一，難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化控制。而隨著肉品加工業(yè)的不斷發(fā)展，特別是肉類中式菜肴的工業(yè)化生產(chǎn)，希望有安全、高效、可控的優(yōu)質(zhì)肉類嫩化劑來(lái)保障菜肴工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)化。生物型嫩化劑是通過(guò)篩選特定的微生物，采用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)手段，獲得由多種蛋白酶組成的復(fù)合型酶制劑，在理論上可以對(duì)牛肉中的不同蛋白質(zhì)進(jìn)行可控的降解，從而提高牛肉的嫩度，改善牛肉的風(fēng)味及加工品質(zhì)，目前還鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)擬從貴州傳統(tǒng)豆豉和甜酒曲中分離篩選出產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌菌株，在特定條件下培養(yǎng)后，用發(fā)酵液處理黃牛肉后，經(jīng)質(zhì)構(gòu)特性分析，篩選出適合嫩化牛肉的優(yōu)良菌株，為開(kāi)發(fā)生物型牛肉嫰化劑提供優(yōu)質(zhì)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

豆豉：產(chǎn)自貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣；

甜酒曲：貴州省玉屏縣城關(guān)酒曲廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、氯化鈉5 g、氯化鈣0.1 g、L-酪氨酸0.1 g、瓊脂15 g、酪素5 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.2～7.4，112 ℃滅菌30 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、酵母膏2 g、蛋白胨0.2 g、氯化鈉2 g、氯化鈣2 g、磷酸氫二鉀5 g、磷酸二氫鉀1.25 g、硫酸鎂0.01 g、硫酸鐵0.001 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0,121 ℃下滅菌20 min；

酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基：酪蛋白10 g、氯化鈉5 g、磷酸氫二鈉2 g、瓊脂15 g、牛肉膏3 g、蒸餾水1 000 mL、0.4%溴麝香草酚藍(lán)溶液12.5 mL、pH 7.4、121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑藥品

DNA Marker、細(xì)菌提取試劑盒：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；

PCR相關(guān)試劑：美國(guó)Genview公司；

其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 設(shè)備與儀器

恒溫培養(yǎng)箱：SPX-250B5-II型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

搖床：SKY-2102C型，上海百典儀器設(shè)備有限公司；

顯微鏡：OLYMPUS型，北京瑞科中儀科技有限公司；

冷凍離心機(jī)：TGL-20M型，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；

無(wú)菌操作臺(tái)：SW-CJ-1FD型，蘇州江東精密儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：BlueStar型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

PCR儀：BIO-RAD型，深圳市宇德立生物科技有限公司；

電泳儀：DYCP-33B型，北京六一儀器廠；

質(zhì)構(gòu)儀：TA-XT.Plus型，北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的菌株的初篩 準(zhǔn)確稱取待分離食品樣品各10 g，放入盛有90 mL無(wú)菌生理鹽水并帶玻璃珠的250 mL三角瓶中，振搖約20 min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20～30 s，即成10-1稀釋液。取上述稀釋液用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋成10-2～10-76個(gè)梯度，豆豉取10-5～10-7，甜酒曲取10-3～10-5進(jìn)行平板涂布分離，每個(gè)梯度3個(gè)平行；涂布量0.1 mL，所得樣品于37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。

1.2.2 目的菌株的復(fù)篩 取初篩得到的菌株接種至5 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min搖床培養(yǎng)40 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，以0.5 cm直徑圓形濾紙片蘸上清液貼于酪蛋白平板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用量尺測(cè)量透明圈的直徑與菌落的直徑，根據(jù)平板上透明圈直徑和菌落直徑比值(H/C)的大小，篩選出產(chǎn)生較大水解圈的菌株。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵試驗(yàn) 將篩選菌株接種至5 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min搖床培養(yǎng)12～16 h，按5%接種量接種至50 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min搖床培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力。

酶活力測(cè)定按GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》的福林法執(zhí)行。

1.2.4 牛肉TPA質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定 將酶活力較大的菌株活化，以5%的量接種于50 mL滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min搖床培養(yǎng)48 h，5 000 r/min離心3 min，則上清液為粗酶液。取牛肩胛肉，切成2 cm的正方體，分裝到蒸煮袋中，在25 ℃的水浴鍋中將酶液倒入蒸煮袋對(duì)牛肉進(jìn)行浸漬，50 min后將樣品置于80 ℃水浴鍋中加熱，待中心溫度達(dá)到70 ℃后取出，冷卻樣品至4 ℃后，采用物性測(cè)試儀測(cè)定酶液浸漬后牛肉的質(zhì)構(gòu)特性[7]，測(cè)定樣品的硬度、彈性、凝聚性、膠著性、咀嚼性和回復(fù)性，測(cè)試完成后，采用spss18.0分析結(jié)果。參數(shù)[8]設(shè)定有一定調(diào)整，如下：探頭P/36R；測(cè)前2.00 mm/s，測(cè)中1.00 mm/s，測(cè)后2.00 mm/s，壓縮比50%，每組6個(gè)平行。

1.2.5 菌株的鑒定

(1) 形態(tài)學(xué)觀察：觀察菌株在平板和斜面上的培養(yǎng)特征，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色[9]，光學(xué)顯微鏡放大1 000倍觀察個(gè)體形態(tài)，進(jìn)行初步鑒定。

(2) 總DNA的提?。翰捎萌芫钙票赱10]和細(xì)菌DNA提取試劑盒結(jié)合的方法提取目的菌株總DNA。具體如下：取菌液0.6～3.0 mL，12 000 r/min離心1 min棄上清，加入1～2 mL的濃度為5 mg/mL的溶菌酶溶液，37 ℃的水浴鍋酶解破壁，酶解2 h左右，離心棄上清；加入600 μL Lysis Buffer A，漩渦重懸，加入20 μL Proteinase K 60 ℃水浴45～60 min，其間顛倒混勻數(shù)次；加入400 μL Lysis Buffer B 充分混勻；10 000 r/min離心10 min，將上清液倒入離心柱中，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入700 μL Wash buffer A(使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入700 μL Wash buffer B，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入500 μL Wash buffer B，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；再次12 000 r/min離心2 min，將離心柱置于新的離心管中，并打開(kāi)離心柱蓋，于室溫或37 ℃恒溫箱放置5～10 min，直至無(wú)明顯乙醇味；在硅基質(zhì)膜中加入50～200 μL TE buffer(事先預(yù)熱在55～65 ℃水浴鍋中)，置于室溫2 min，12 000 r/min離心2 min，管底即為基因組。

(3) PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定：反應(yīng)體系(25 μL)：10×PCR buffer(含25 mmol/L Mg2+)2.5 μL，dNTPs(10 μmol/L)0.5 μL，引物(20 μmol/L)各1 μL，Taq(2 U/μL)0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性50 s；53.5 ℃退火1 min；72 ℃延伸90 s；體系運(yùn)行30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min 30 s。將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

(4) 序列分析：將測(cè)序獲得的序列于NCBI中利用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)分析后，利用Lasergene軟件構(gòu)建目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離、純化與篩選

挑取出能產(chǎn)生水解圈的菌株，經(jīng)分離和純化共得到豆豉12株、甜酒曲10株，將這22株菌接種于酪蛋白平板中，其水解圈的比值見(jiàn)表1。將水解圈直徑和菌落直徑比值大于3的菌株進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定，由表1可知，分別選出豆豉(D5、D7、D9、D11、D12)和甜酒曲(J1、J3、J5、J6、J9)進(jìn)行下一級(jí)篩選。

2.2 蛋白酶活力的測(cè)定

2.2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖1) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的各點(diǎn)，添加趨勢(shì)線后得出回歸方程y=0.010 8x-0.076 8，利用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量(μg)，即吸光常數(shù)K值為99.7，利用K值，計(jì)算出酶活力值。

表1 透明圈與菌落直徑比值(H/C)表Table 1 The ratio of hydrolytic zone and colony area(H/C)

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 1 The standard curve of L-tyrosine

2.2.2 蛋白酶活力值 由表2可知，10株菌中，通過(guò)縱向比較，發(fā)現(xiàn)蛋白酶活力較大的菌分別是豆豉中的D7、D11和甜酒曲中的J5、J9，分別達(dá)到71.68，66.75，71.39，54.56 U/g。因此選取這4株菌對(duì)牛肉進(jìn)行浸漬，并測(cè)定其質(zhì)構(gòu)特性。

表2 菌的蛋白酶活力值Table 2 The protease activity value of strain

2.3 不同菌株產(chǎn)蛋白酶對(duì)牛肉的質(zhì)構(gòu)特性

經(jīng)試驗(yàn)得出，4種菌均能使牛肉的質(zhì)構(gòu)特性得以改善，見(jiàn)表3。其中菌D11處理組的硬度、膠著性和咀嚼性相對(duì)于空白組分別降低了8.5%，12.5%，13.8%；菌J9處理組硬度、膠著性和咀嚼性分別降低了19.3%，20.44%，29.4%；菌J5處理組硬度、膠著性和咀嚼性分別降低了23.4%，24.5%，25.12%；菌D7處理組硬度、膠著性和咀嚼性分別降低了31.37%，31.8%，38.2%；通過(guò)這4株菌處理后的牛肉在硬度、膠著性和咀嚼性中相對(duì)于空白組K顯著下降，變化均差異顯著(P<0.05)，這就表明酶液對(duì)牛肉的質(zhì)構(gòu)特性有一定的影響，但是在彈性、凝聚性和回復(fù)性中無(wú)明顯變化。通過(guò)4株菌處理后的牛肉硬度值從大到小的順序是D7、J5、J9、D11，膠著性從大到小的順序是D7、J5、J9、D11，咀嚼性從大到小的順序是D7、J9、J5、D11。綜合以上分析，菌D7對(duì)牛肉的嫩化效果最為突出，則確定D7為最佳的對(duì)牛肉嫩化的菌株，并進(jìn)行分子學(xué)鑒定。

2.4 D7的鑒定結(jié)果與分析

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與分析 觀察D7在平板和斜面上的培養(yǎng)特征，菌株在分離培養(yǎng)基平板上37 ℃培養(yǎng)(24±2) h呈白色，光滑濕潤(rùn)菌落，稍隆起，菌落中間有褶皺，在分離培養(yǎng)基斜面上呈薄膜狀，表面白色，見(jiàn)圖2。同時(shí)對(duì)D7進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡放大1 000倍觀察個(gè)體形態(tài)，為革蘭氏陽(yáng)性、有芽孢的桿狀菌，見(jiàn)圖3。但是并不能得出D7的種屬信息，因此需進(jìn)一步做分子生物學(xué)鑒定。

表3 不同菌株處理后質(zhì)構(gòu)特性的變化?Table 3 The different strains after processing quality and structure features of change

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 細(xì)菌D7平板和斜面培養(yǎng)特征Figure 2 Bacterial characteristics in plate and slant culture

圖3 D7革蘭氏染色圖Figure 3 Gram stain picture of D7

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與分析 以溶菌酶破壁和細(xì)菌提取試劑盒相結(jié)合的方法提取細(xì)菌D7基因組DNA，27F/1492R為引物擴(kuò)增細(xì)菌D7的ID區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)，條帶清晰(見(jiàn)圖4)，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度在1 500 bp左右。

將回收好的細(xì)菌PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司檢測(cè)基因序列，得到細(xì)菌準(zhǔn)確的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，得出細(xì)菌D7與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)序列相似性達(dá)99%，最后采用Lasergene軟件構(gòu)建目的菌株D7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖5。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)蛋白酶菌株的來(lái)源進(jìn)行了一個(gè)比較全面、細(xì)致的篩選，分離鑒定出能嫩化牛肉的優(yōu)勢(shì)菌株D7。該菌的酶活力值、對(duì)牛肉嫩化的效果相對(duì)于空白組都較好。經(jīng)16S rDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，鑒定菌株D7為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，但有關(guān)該菌的安全性及發(fā)酵工藝特性，還需要進(jìn)一步的研究，隨著研究的深入，該產(chǎn)品將具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖4 細(xì)菌D7 16s rDNA電泳圖Figure 4 16s rDNA electrophoretogram of bacteria D7

圖5 D7解淀粉芽孢桿菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Figure 5 Phylogentic tree of Bacillus amyloliquefaciensD7 based on 16S rDNA 參考文獻(xiàn)

[1] 張秋會(huì), 李苗云, 黃現(xiàn)青, 等. 肉制品的質(zhì)構(gòu)特性及其評(píng)價(jià)[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(3): 36-39.

[2] HWANG I H, DEVINE C E, HOPKINS D L. The biochemical and physical effects of electrical stimulation on beef and sheep meat tenderness[J]. Meat Science, 2003, 65: 677-691.

[3] HAYWARD L H, HUNT M C, KASTNER C L, et al. Blade tenderization effects on beef longissimus sensory and instron textural measurements[J]. Journal of Food Science, 1980, 45(4): 925-930, 935.

[4] 高海燕, 潘潤(rùn)淑, 馬漢軍. 超高壓技術(shù)對(duì)鵝肉嫩度的影響[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(8): 107-110.

[6] MORZEL M, GATELLIER P, SAYD T, et al. Chemical oxidation decreases proteolytic susceptibility of skeletal muscle myofibrillar proteins[J]. Meat Science, 2006, 73(3): 536-43.

[7] 郝紅濤, 趙改名, 柳艷霞, 等. 肉類制品的質(zhì)構(gòu)特性及其研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2009, 25(3): 125-128.

[8] 常海軍, 唐翠, 牛曉影, 等. 超高壓處理對(duì)牛肉肌內(nèi)結(jié)締組織膠原蛋白熱力特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(23): 28-31.

[9] 徐德峰, 李彩虹, 王雅玲, 等. 細(xì)菌革蘭氏染色探究式實(shí)驗(yàn)教學(xué)的設(shè)計(jì)和實(shí)施效果分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2013, 40(5): 871-876.

[10] 李琦, 張?zhí)m威, 韓雪, 等. 破壁方法對(duì)嗜熱鏈球菌SP1.1胞內(nèi)乳糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響及其條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(9): 183-187.

Separation, screening and identification of special microbial strain for beef meat tenderizer

TAN Ya

LIZong-jun

LIKe

WUGen-liang

(HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

In order to obtain microbial strain suitable for the tenderization of beef, a total of 22 bacteria of producing proteinase were isolated from traditional lobster sauce and wine song in Guizhou. With the screening by using microscopy, analyses of enzyme activities, and TPA value of beef with in treatment of fermented broth, a bacteria defined as D7 was found the optimal strain, and its enzyme activity was 71.68 U/g. The molecular biological identification results showed that it was very similar toBacillusamyloliquefaciens(JN700123.1), and the similarity was 99%, on the basis of molecular biology identification, using 16S rDNA sequences identification and phylogenetic analyses. Thus this strain was identified asBacillusamyloliquefaciens.

protease; enzyme activity;Bacillusamyloliquefaciens; texture profile analysis(TPA); 16S rDNA

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(編號(hào)：201303082)；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：2015NK2096)；湖南省科技項(xiàng)目(編號(hào)：2015WK3015)；湖南省科技廳科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(編號(hào)：2016NK2038)

譚雅，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

李宗軍(1967-)，男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院教授，博導(dǎo)。E-mail：hnlizongjun@163.om

2016—08—23

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.004