隋春光

梁金鐘

王風青

(哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150076)

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植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑及其離心、冷凍干燥工藝研究

隋春光

梁金鐘

王風青

(哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150076)

以高產(chǎn)γ-氨基丁酸的植物乳桿菌Lp-S2為出發(fā)菌株，研制直投式發(fā)酵劑。并對發(fā)酵劑離心工藝及冷凍干燥工藝進行優(yōu)化。通過正交試驗確定植物乳桿菌Lp-S2 的離心工藝為：離心溫度4 ℃，離心時間30 min，轉速6 000 r/min，該條件下植物乳桿菌Lp-S2離心收得率為83.8%。通過單因素和正交試驗進行冷凍保護劑的優(yōu)化。冷凍保護劑的最佳組合是15%海藻糖，15%葡萄糖和10%脫脂乳粉。植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑，凍干存活率為39.2%，最佳預冷時間為6 h。直投式發(fā)酵劑活菌數(shù)達到1.5×1012CFU/mL。

直投式菌劑；植物乳桿菌；冷凍干燥；γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸(GABA)，是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在動物體內(nèi)，GABA是一種非常重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。對人體有鎮(zhèn)靜安神、降低血壓、改善腦機能和調(diào)節(jié)激素分泌等重要作用[1]。植物乳桿菌Lp-S2是本實驗室自主分離并保藏的菌株，具有發(fā)酵底物高產(chǎn)GABA的能力。由于該菌株具有這些特點，將其制備成直投式發(fā)酵劑，應用于發(fā)酵食品的制作具有重要的意義。

目前直投式發(fā)酵劑(directed vat set，DVS)的研究，主要集中在通過高密培養(yǎng)，提高凍干前菌體數(shù)量方面。通過篩選及優(yōu)化乳酸菌增殖培養(yǎng)基，優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵條件，通過細菌菌體發(fā)酵動力學技術，運用新型發(fā)酵技術，營養(yǎng)與代謝基礎上，恒定pH發(fā)酵、進行分批補料發(fā)酵等，達到高密度培養(yǎng)的目的[2-4]。乳酸菌高密度培養(yǎng)是制備直投式發(fā)酵劑的前提，通過高密度培養(yǎng)發(fā)酵得到大量的活性乳酸菌，然后將培養(yǎng)液中的菌體進行濃縮收集。由于離心收集法具有不易污染，設備及操作簡單等優(yōu)點，在實踐中被廣泛應用。在離心的工藝中，會產(chǎn)生機械力及摩擦產(chǎn)生的高溫，會對菌體造成損傷。另外，菌體在離心時會有少量的菌體殘留在上清液中。因此選擇合適的離心工藝參數(shù)，獲得理想的離心收得率是非常重要的。同時如何保證凍干后菌體的存活率也是直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)的關鍵。在冷凍干燥過程中，菌體細胞受到冷凍及真空干燥兩種物理過程，會導致蛋白質(zhì)變性，造成凍干后活菌數(shù)降低。如何將凍干工藝的傷害降低到較低的水平，盡可能保持菌體的生理活性及功能，這都是需要解決的問題。除了選擇菌體活菌數(shù)較多，活力較強的時間進行冷凍干燥外，加入凍干保護劑是較有效的解決方法。由于細胞大小和結構的差異，采用相同的保護劑所得到的保護效果也有差異，同時保護劑對微生物保護作用具有選擇性，這些都需要通過試驗來最終確定。由于凍干保護劑的研究一般屬于專利資料，同時研究報告[5-6]的結果一般存在很大差異。因此對直投式發(fā)酵劑的離心及冷凍干燥工藝進行研究，具有重要意義。

目前，對于GABA產(chǎn)生菌的研究[7-8]主要集中在優(yōu)化發(fā)酵條件提高GABA的產(chǎn)量，還未有學者研究高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌直投式發(fā)酵劑。因此，本研究擬通過對植物乳桿菌LP-S2高密度培養(yǎng)，實現(xiàn)菌體大量增殖，通過優(yōu)化離心工藝，對凍干保護劑進行篩選和優(yōu)化，對預冷時間進行優(yōu)化，最終制成具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的乳酸菌直投式發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

植物乳桿菌Lp-S2：本試驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸細菌液體培養(yǎng)基(MRS)：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、KH2PO42 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐溫80 1 mL、加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉等：分析純，天津市天力化學試劑有限公司；

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)：分析純，西安百川生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設備

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-160型，上海一恒科技有限公司；

超凈工作臺：YJ-875型，蘇州順鑫凈化科技有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDXZ-50KB型，上海申安醫(yī)療器械廠；

離心機：LG10-2.4A型，北京時代北利離心機有限公司；

超低溫冰箱：DW-FW351型，中科美菱低溫科技有限責任公司；

真空冷凍干燥機：FD5-3型，美國西盟國際公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌活菌數(shù)的測定 采用平板菌落計數(shù)法測定乳酸菌活菌數(shù)，在超凈工作臺內(nèi)，取1 mL菌液以加入到9 mL滅菌的生理鹽水中，依次遞增稀釋，選擇10-8，10-9，10-103個稀釋度。取1 mL稀釋液于無菌的空培養(yǎng)皿中，倒入15 mL溶化并冷卻至45 ℃的MRS培養(yǎng)基，放置于操作臺上混勻，每個稀釋度做3個平行樣，凝固后37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，選擇25～200個菌數(shù)的平板進行讀數(shù)，然后乘以稀釋倍數(shù)[9]。

1.2.2 植物乳桿菌高密度菌懸液的制備 將MRS培養(yǎng)基，分裝至10個250 mL的三角瓶中，裝液量150 mL，于121 ℃滅菌20 min。在超凈工作臺接種2%的種子發(fā)酵劑，恒溫37 ℃培養(yǎng)15 h制取菌懸液。

1.2.3 高密度菌懸液離心條件的研究 將得到的高密度菌懸液進行離心，在文獻[10]的基礎上，選擇不同的離心溫度、離心時間、離心機轉速進行正交試驗，每個因素選擇3個水平，因素和水平組合表見表1。

分別記錄離心前后活菌數(shù)，按式(1)計算樣品的離心收得率。將離心收得率做為衡量離心試驗效果的指標。

表1 L9(33)因素和水平組合表Table 1 Factor and level of L9(33) test

(1)

式中：

c——離心收得率，%；

m——沉淀中活菌數(shù)，CFU/mL；

n——離心前活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4 凍干保護劑優(yōu)化的研究 冷凍干燥過程一般工藝流程為：

高密度培養(yǎng)液→離心→菌泥→添加凍干保護劑→菌懸液→預冷→預凍→真空冷凍干燥→收集菌粉

將高密度培養(yǎng)液進行離心，倒掉上清液，將剩下的菌泥倒于無菌的培養(yǎng)皿中，菌泥與保護劑按1∶3體積比混勻，平衡30 min，制得菌懸液。用保鮮膜封好并扎口，將配置好的菌懸液在4 ℃進行預冷0～12 h進行成型，在-70 ℃超低溫冰箱中預凍14 h后置于真空冷凍干燥設備中，在真空度為3～5 Pa條件下冷凍干燥48 h左右得到凍干菌粉[11]。

選取海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糊精、γ-PGA、脫脂乳粉、谷氨酸鈉作為單一凍干保護劑，通過參考相關文獻[12]確定單一保護劑的濃度，分別測得凍干前后的活菌數(shù)并計算凍干菌體存活率。通過篩選得到較優(yōu)的3種凍干保護劑進行正交試驗，確定最佳的復合保護劑組合配方。冷凍干燥后菌體存活率按式(2)計算：

(2)

式中：

a——菌體存活率，%；

m1——凍干后總活菌數(shù)，CFU/mL；

m2——凍干前總活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5 預冷時間的優(yōu)化 預冷是在-70 ℃預凍之前，將菌懸液溫度降至4 ℃，并保溫一段時間。預冷能夠很好地提高乳酸菌的凍干存活率。一方面能將菌懸液各個位置的液體均勻地降到較低溫度，同時不形成冰晶。在下一步預凍工藝中能縮短菌懸液渡過最大冰晶生成帶的時間，減少大的冰晶形成，從而提高細菌的存活率。另一方面4 ℃預冷給細胞一個低溫適應過程，促使細胞做出適應低溫環(huán)境的一些生化變化，例如某些與抗凍相關蛋白的形成。試驗時，使用優(yōu)化后的復合保護劑配方制備菌懸液，然后分別預冷0，2，4，6，8，10，12 h后，采用相同的工藝進行冷凍干燥操作，測量每個樣品凍干存活率，確定最佳預冷時間。

2 結果與分析

2.1 離心條件試驗結果

在離心工藝中，影響菌體存活率主要有兩個方面因素：① 由于離心力作用產(chǎn)生的摩擦溫度及機械剪切作用因素，造成菌體死亡；② 離心工藝不可能把所有的菌體都離心到離心管底部，有少量菌體殘留在上清液中造成菌體損失。如果離心參數(shù)控制不當，菌體損失率和死亡率增高，必然造成菌體收得率降低，最終直接導致活菌數(shù)量降低，影響發(fā)酵劑的產(chǎn)品質(zhì)量[13]。選擇不同的離心溫度、離心時間、離心機轉速進行正交試驗。

以離心收得率作為衡量標準獲得的正交試驗結果分析見表2。由表2可知，對植物乳桿菌Lp-S2離心工藝影響大小的順序是離心溫度>離心時間>離心機轉速。最佳組合是A1B3C2，即離心溫度為4 ℃，離心時間為30 min，轉速為6 000 r/min時離心效果最佳。該條件下，進行3組平行驗證實驗。植物乳桿菌Lp-S2離心收得率平均達到83.8%。說明正交試驗效果較好。

表2 離心正交試驗結果表Table 2 Results of centrifugal orthogonal experiment

2.2 凍干保護劑優(yōu)化試驗結果

2.2.1 保護劑單因素試驗 本試驗選擇不同種類的保護劑溶液進行單因素測試。保護劑的種類和添加量見表3。結果顯示，加入單一保護劑對菌體在凍干過程中的保護作用差異十分明顯，凍干存活率從不加保護劑的0.16%提高到16.2%。在植物乳桿菌凍干工藝中，海藻糖是較優(yōu)的凍干保護劑，其次是葡萄糖和脫脂乳粉。

表3 單一保護劑對存活率的影響Table 3 Effect of single protectant on survival rate %

2.2.2 復合保護劑正交試驗 根據(jù)單因素試驗結果，選取凍干效果較好的海藻糖、葡萄糖和脫脂奶粉作為試驗因素進行正交試驗。復合保護劑因素水平表見表4。

表4 復合保護劑因素水平表Table 4 Compound protectant factor level table %

由表5可知，由海藻糖、脫脂奶粉和葡萄糖組成的混合保護劑對菌體的保護作用明顯強于單一成分的保護劑。所有組合的菌體存活率均大于單一因素測試中最高的16.2%，其中混合配方中最高的組合達到38.6%。直觀分析可知：海藻糖對復合保護劑效用的影響最大，葡萄糖也有顯著影響，脫脂奶粉影響最小。最佳的保護劑組合配方為A3B2C3，即海藻糖15%、脫脂乳粉10%、葡萄糖15%。進行3組平行驗證實驗，按此配比制備菌懸液然后凍干，顯示植物乳桿菌Lp-S2的凍干存活率平均為39.2%，高于正交試驗中得到的結果，正交試驗優(yōu)化的結果有效。

復合保護劑提高菌體存活率的原因主要是由不同種類的保護劑通過不同的方式保護菌體，復合保護后達到組合保護的效果。海藻糖、葡萄糖等低分子糖通過維持細胞膜結構的穩(wěn)定性，達到抑制膜內(nèi)結合水形成冰晶，減少細胞體的破壞。脫脂乳粉的蛋白是大分子物質(zhì)，可以減少乳酸菌細胞暴露于介質(zhì)和空氣的面積，并在乳酸菌細胞表面形成保護層，防止因細胞壁破碎而導致的細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，從而起到保護作用[14-15]。當共同使用3種保護劑時，菌體存活率明顯增大說明三者復配具有協(xié)同累加效應。

表5 保護劑正交試驗結果分析表Table 5 Results of freeze-dried protectants orthogonal experiment

2.3 預冷時間的確定

由圖1可知，預冷能有效提高菌體的凍干存活率。當預凍時間在2～6 h，菌體凍干存活率差異顯著(P<0.05)，菌體存活率隨預凍時間延長而增加。可能是通過將菌懸液的溫度均勻地降低到較低溫度，促進菌體的低溫適應性和應激反應，從而提高了菌體的凍干存活率[16-17]。在6 h以后，菌體凍干存活率差異不顯著(P>0.05)，菌體凍干存活率不再明顯增加，可能是與提高凍干存活率相關的低溫適應性生化反應基本完成有關[18]。試驗得出，預冷能有效提高菌體的凍干存活率，最佳預凍時間為6 h。

利用優(yōu)化后的離心和冷凍干燥生產(chǎn)的植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑，其活菌數(shù)達到1.5×1012CFU/mL。達到商品發(fā)酵劑的要求，具有較高的實際應用價值。

同一小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖1 預冷對存活率的影響Figure 1 Effect of pre-cooling onthe survival rate

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗確定了植物乳桿菌Lp-S2 的最優(yōu)離心工藝為：離心溫度4 ℃，離心時間30 min，離心機轉速6 000 r/min。該條件下植物乳桿菌Lp-S2離心收得率達到83.8%。通過正交試驗對復合保護劑進行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的復合保護劑配方：海藻糖15%、脫脂乳粉10%、葡萄糖15%。植物乳桿菌Lp-S2添加該復合保護劑后，凍干存活率達到39.2%。通過對預凍時間進行單因素試驗，得到最佳預冷時間為6 h。優(yōu)化后離心及冷凍干燥工藝得到的Lp-S2直投式發(fā)酵劑活菌數(shù)達到1.5×1012CFU/mL。符合商品發(fā)酵劑的要求。同時該發(fā)酵劑具有發(fā)酵底物高產(chǎn)GABA的效果，因此產(chǎn)品具有實際應用價值。下一步將對直投式發(fā)酵劑保藏過程相關參數(shù)進行探索，最終得到植物乳桿菌Lp-S2直投式發(fā)酵劑更完整的制備工藝。

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Study on centrifugal and freeze drying of Lactobacillus plantarum Lp-S2 DVS

SUI Chun-guang

LIANGJin-zhong

WANGFeng-qing

(HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China)

LactobacillusplantarumLp-S2 which has the ability to produce gamma-aminobutyric acid, was used as starting strain to develop Direct vat set(DVS). Then the centrifugation process and freeze-drying process were optimized. By orthogonal experiment the optimal conditions of centrifugation were identified as: centrifugal temperature 4 ℃, Time-consuming 30 minutes, centrifugal force 6 000 r/min. In this condition, the centrifugal recovery rate ofLactobacillusLp-S2 is 83.8%. The cryoprotectant was optimized by single factor and orthogonal test. The best combination of cryoprotectants was 15% trehalose, 15% glucose and 10% skim milk powder. The survival rate ofL.plantarumLp-S2 Direct Vat Set reached 39.2%. The optimum pre-cooling time was 6 h. The number of viable cells of the direct-acting starter was 1.5×1012CFU/mL.

directed vat set;Lactobacillusplantarum; freeze drying;γ-amino butyric acid

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團隊建設計劃項目(編號：2010td04)

隋春光，男，黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學院講師，博士在讀。

梁金鐘(1957—)，男，哈爾濱商業(yè)大學教授。 E-mail：Ljz2050@126.com

2016—09—03

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.040