李月玥（廣州計(jì)量檢測(cè)技術(shù)研究院，廣州 510030）

ATP熒光檢測(cè)儀校準(zhǔn)方法研究

李月玥（廣州計(jì)量檢測(cè)技術(shù)研究院，廣州 510030）

ATP熒光檢測(cè)儀是現(xiàn)場(chǎng)水質(zhì)污染及現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境物體表面細(xì)菌負(fù)載的快速檢測(cè)中逐漸普及的檢驗(yàn)儀器，在衛(wèi)生檢測(cè)領(lǐng)域中起著重要作用。本文依據(jù)ATP熒光檢測(cè)儀的工作原理，初步建立一套可靠的校準(zhǔn)方法，并對(duì)其線性誤差測(cè)量不確定度進(jìn)行分析。

ATP熒光檢測(cè)儀；校準(zhǔn)方法；測(cè)量不確定度

在衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)中，細(xì)菌污染檢測(cè)是常規(guī)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。目前，細(xì)菌定量檢測(cè)通常采用瓊脂平板計(jì)數(shù)法，由于其操作復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，很難滿足HACCP(Hazard Analysis and Critical Control Point) 體系中微生物污染的在線監(jiān)測(cè)[1]。20世紀(jì)80年代，英國首先研制ATP熒光檢測(cè)系統(tǒng)，隨后將其應(yīng)用于檢測(cè)微生物和食品殘?jiān)黐2]。

1 ATP熒光檢測(cè)儀工作原理

ATP熒光檢測(cè)儀依據(jù)ATP生物發(fā)光法的基本原理，即熒光素在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結(jié)合，在結(jié)合過程中發(fā)出熒光[3]。其反應(yīng)如下圖1所示。當(dāng)反應(yīng)中的熒光素-熒光素酶達(dá)到飽和反應(yīng)量時(shí)，ATP含量與所釋放的熒光光子量成正比。有研究表明，活細(xì)胞數(shù)量的對(duì)數(shù)值與ATP生物熒光值的對(duì)數(shù)值之間存在良好的線性關(guān)系[4]。因此，ATP熒光檢測(cè)儀以相對(duì)熒光強(qiáng)度（relative light units，RLU）數(shù)值表示樣品中ATP的總量，進(jìn)而反映樣品中活細(xì)胞數(shù)量。

2 校準(zhǔn)方法分析

根據(jù)ATP熒光檢測(cè)儀的性能和工作原理，認(rèn)為測(cè)量線性誤差及測(cè)量重復(fù)性是影響其分析結(jié)果的主要技術(shù)指標(biāo)，必須進(jìn)行校準(zhǔn)確認(rèn)。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATP熒光檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果受工作環(huán)境影響，特別是外界ATP干擾、環(huán)境溫度，以及測(cè)樣時(shí)間。因此，在測(cè)試時(shí)應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)室潔凈無ATP存在，環(huán)境溫度在（10 ～30）℃中某一設(shè)定溫度值下，測(cè)樣時(shí)間一致等條件。

根據(jù)實(shí)際情況，在儀器的量程范圍內(nèi)取4～5個(gè)測(cè)量點(diǎn)，使用無ATP超純水和ATP純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)確配置相應(yīng)濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。各測(cè)量點(diǎn)取10μL進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)樣時(shí)間為30 s，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值作為測(cè)量結(jié)果。按線性回歸法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和線性相關(guān)系數(shù)。按照公式（1）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量中間點(diǎn)的誤差，即為儀器的線性誤差。

為了得到儀器的測(cè)量重復(fù)性，在滿足測(cè)試條件的情況下，選取中間測(cè)量點(diǎn)重復(fù)測(cè)量6次（取樣量為10μL，測(cè)樣時(shí)間為30 s），計(jì)算測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%），即為儀器的測(cè)量重復(fù)性。計(jì)算公式如下：

3 線性誤差測(cè)量不確定度分析

使用一臺(tái)性能穩(wěn)定，量程為（0.01～10.0） fmol的ATP熒光檢測(cè)儀，取0.01fmol、0.5 fmol、1.0 fmol、2.0 fmol、5.0 fmol為測(cè)量點(diǎn)，采用上述方法進(jìn)行校準(zhǔn)。測(cè)量線性誤差的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)如表1所示，測(cè)量重復(fù)性的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)如表2所示。

表1 測(cè)量線性誤差的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)

表2 測(cè)量重復(fù)性的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)

3.1 數(shù)學(xué)模型

本文中線性誤差的計(jì)算方法如公式（1）所示，其數(shù)學(xué)模型為：

方差：

靈敏系數(shù)：

則：

3.2 測(cè)量結(jié)果的不確定度分析

ATP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度≥ 98%，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度小于2%（k=2），在2.0 fmol含量下，標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.02fmol。

3）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4）擴(kuò)展不確定度

在95%置信概率下取k=2，線性誤差測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為：

4 結(jié)論

目前，關(guān)于ATP熒光檢測(cè)儀的國家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范還未公布。本文根據(jù)ATP熒光檢測(cè)儀的工作原理，提出其測(cè)量線性誤差及測(cè)量重復(fù)性的校準(zhǔn)方法，并分析了線性誤差測(cè)量不確定度，對(duì)ATP熒光檢測(cè)儀的計(jì)量校準(zhǔn)具有重要的參考價(jià)值。

[1] Tanaka H, Shinji T, Sawada K, et al. Development and application of a bioluminescence ATP assay method for rapid detection of coliform bacteria[J]. Water Research, 1997, 31(8):1913-1918.

[2] Selan L, Berlutti F, Passariello C, et al. Reliability of a bioluminescence ATP assay for detection of bacteria[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30(7):1739-42.

[3] Mcelroy WD, Deluca MA. Firefly and bacterial luminescence: basic science and applications[J]. Journal of Applied Biochemistry,1983, 5(3):197-209.

[4] 廖如燕,陳胤瑜,華志濤,等.ATP生物熒光檢測(cè)法快速檢測(cè)水細(xì)菌污染的評(píng)價(jià)[J].旅行醫(yī)學(xué)科學(xué),2011,(6):5-11.

Calibration Method for ATP Fluorescence Detector

LI Yue-yue
(Guangzhou Institute of Measurement and Testing Technology, Guangzhou 510030, China)

The application of ATP fluorescence detector is more and more universal for the water pollution detection and the bacteria load on the object surface on the spot. It plays an important role in hygiene examination. Areasonable calibration method on the principle of ATP biological fluorescence method is established, and the measuring uncertainty of the linear error is analyzed.

ATP fluorescence detector; calibration method; measurement uncertainty

TH744.16

A

1672-6286(2016)8-0046-4

李月玥（1988-），女，河北保定人。碩士，主要從事化學(xué)及生物類儀器計(jì)量檢測(cè)工作和研究。