Salman Naseer，Shahid Khan，M Imran，何冰，林佳

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C3啟動子克隆及熒光素酶報告基因載體構(gòu)建

Salman Naseer1，Shahid Khan1，M Imran1，何冰2，林佳2

（華北理工大學 1. 國際教育中心，2. 生命科學學院，河北 唐山 063000）

為克隆C3基因啟動子序列，構(gòu)建C3基因啟動子熒光素酶報告基因載體，運用PCR的方法從血液中提取到的基因組DNA中獲得目的基因，雙酶切后連接到熒光素酶報告基因載體上，構(gòu)建C3基因啟動子報告基因載體．構(gòu)建的pGL3-Basic-C3-promotor重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒SV40瞬時轉(zhuǎn)染Hela細胞，檢測熒光素酶活性．結(jié)果表明，PCR擴增出C3基因啟動子片段；雙酶切及測序鑒定重組體構(gòu)建正確；轉(zhuǎn)染Hela細胞后經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測確定重組體有啟動子活性．成功構(gòu)建了C3啟動子報告基因載體，在細胞系中進行初步活性分析得知所克隆的C3基因調(diào)控序列包含啟動子活性區(qū)域．

C3；啟動子；熒光素酶報告基因；載體構(gòu)建

人補體第三組分（Complement 3，C3）是補體系統(tǒng)的核心蛋白質(zhì)，它是1912年Ritg用蛇毒處理血清時發(fā)現(xiàn)的[1]．在補體各成分中，C3在血清中含量最高；在功能上，C3亦居于中心地位，它既是幾條激活途徑的交匯，又是C3b依賴性陽性反饋環(huán)路的基礎；同時，C3裂解片段及其結(jié)合蛋白復雜而多樣，在免疫防御、免疫調(diào)控以及免疫病理中發(fā)揮著重要作用[2]．研究發(fā)現(xiàn)，C3的表達受到營養(yǎng)狀況、激素水平和發(fā)展階段等生理因素的調(diào)控，且在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了C3表達水平的差異[3]．本實驗旨在尋找人C3基因上游調(diào)控序列啟動子區(qū)域，為深入研究人C3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供實驗基礎．

1　材料與方法

1.1基因組DNA的提取

由實驗參與人員提供人血液樣，采用人全血基因組DNA提取試劑盒（天根公司），按照說明書方法進行DNA提?。Y(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度及完整性，利用分光光度計測定產(chǎn)物在260 nm處的吸收值，以計算濃度．

1.2C3啟動子的PCR擴增

根據(jù)GenBank報道的C3啟動子序列，已知人的C3基因啟動子序列設計兩端引物上下游引物分別加入Nhe I和Hind Ⅲ 2個酶切位點．上游引物為：5′-ATACAGAGGAGTGAGCAGGTAAAG-3′（下劃線部分為Nhe I酶切位點），下游引物為：5′-GATAGTTCCCACCGCATTT-3’（下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點），PCR引物由北京諾賽基因組研究中心合成，PCR反應條件為預變性95 ℃ 2 min，94 ℃ 25 s，59 ℃ 1 min 40 s，72 ℃ 25 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)，4 ℃保溫．PCR產(chǎn)物大小為2 513 bp．

1.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用pGL3-Basic載體（見圖1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞，進行大量擴增，用質(zhì)粒提取試劑盒（Promega公司）大量制備pGL3-Basic質(zhì)粒，用ScanDrop 200（analytik Jena，德國）測定pGL3-Basic質(zhì)粒的純度和濃度．分別用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Hind Ⅲ對膠回收的C3啟動子PCR產(chǎn)物以及pGL3-Basic質(zhì)粒載體進行雙酶切4 h，膠回收酶切產(chǎn)物．將膠回收純化過的C3啟動子片段和pGL3-Basic質(zhì)粒載體在16 ℃連接過夜．

圖1　pGL3-Basic載體圖譜

取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞．經(jīng)過含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機挑選10個單菌落，經(jīng)含有氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)后用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，進行酶切和測序鑒定．

1.4C3啟動子活性的鑒定

將生長狀態(tài)良好的Hela細胞按1×104個細胞/孔的量在96孔板中接種，當細胞融合度達到60%之后，采用脂質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒、內(nèi)參載體質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染Hela細胞，設立空白載體為對照，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后收集，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入裂解液后室溫搖動10 min．按照雙熒光素酶檢測試劑盒（Dual Luciferase Assay System）操作說明書，利用化學發(fā)光儀測定螢火蟲熒光素酶發(fā)光值，并以空載體實驗組的比值做對照，分析啟動子活性．每組設立3個復孔，每次實驗重復3次，得到3個相對值，取其平均值．

2　結(jié)果

2.1C3啟動子序列的PCR擴增

以人基因組DNA為模板，用制備的引物進行PCR擴增．產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，結(jié)果見圖2．擴增出的條帶位于2 513 bp位置，無非特異擴增，經(jīng)測序鑒定為目的條帶．

2.2C3啟動子熒光素酶報告基因載體的雙酶切鑒定

酶切后重組體瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖3．由圖3可見，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nhe I和Hind Ⅲ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示，重組體在4.8 kb（載體片段位置）及2 500 bp左右（目的片段位置）各出現(xiàn)1條相應的條帶，進一步證明了C3啟動子序列已經(jīng)插入pGL3-Basic質(zhì)粒中．

圖2　C3啟動子PCR產(chǎn)物電泳圖

注：M為marker；1，2泳道為PCR產(chǎn)物．

圖3　酶切后重組體瓊脂糖凝膠電泳圖譜

注：M為marker；1泳道為酶切產(chǎn)物．

2.3C3啟動子熒光素酶報告基因載體的測序結(jié)果

用pGL3-Basic多克隆區(qū)域通用引物，北京諾賽基因組中心測序結(jié)果經(jīng)NCBI的Blast顯示，pGL3-Basic質(zhì)粒中插入的片段大小為2 513 bp，并且序列與C3啟動子序列完全一致（見圖4），表明pGL3-Basic-C3載體構(gòu)建成功．

圖4　C3啟動子片段測序結(jié)果

2.4C3啟動子熒光素酶報告基因載體活性分析

將重組體pGL3-Basic-C3-promotor與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染Hela細胞，48 h后收集細胞檢測熒光素酶活性，并將兩者比值作為衡量C3啟動子活性的依據(jù)，SV40作為內(nèi)參可以消除由于細胞數(shù)目及轉(zhuǎn)染效率等不同所帶來的組間差異．3次獨立重復實驗的統(tǒng)計圖見圖5．由圖5可見，pGL3-Basic-C3所檢測出的熒光素酶活性是對照組pGL3-Basic的5.3倍（=0.01），此結(jié)果提示C3片段有啟動子活性．

圖5　pGL-Basic-C3-promoter啟動子活性檢測

注：<0.05．

3　討論

報告基因是研究基因功能、基因與基因間調(diào)節(jié)、蛋白與基因作用以及非編碼對基因表達調(diào)控的重要手段．目前，雙熒光素酶報告系統(tǒng)是應用最為廣泛的報告基因系統(tǒng)．熒光素酶由于其表達量與發(fā)光強度相關,因而可以作為一種報告酶并被應用于測定原核及真核細胞中的基因表達量及啟動子活性．應用比較廣泛的雙熒光素酶報告載體——pGL3-Basic載體，可以準確快速地連接克隆靶基因，并使用特定檢測熒光素酶試劑盒和檢測儀來進行檢測[4]．因此，可使用該報告基因質(zhì)粒載體對人腫瘤組織或腫瘤細胞中重要的補體基因C3啟動子活性進行檢測，并作為監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要手段．

本研究采用基因重組技術將C3基因啟動子連接到具有多克隆位點的pGL3-Basic載體質(zhì)粒上，構(gòu)建能夠瞬時表達C3活性的重組質(zhì)粒，為研究抗腫瘤藥物的作用靶點提供了實驗平臺．同時檢測螢火蟲熒光素酶的活性來反應C3基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，可應用于批量篩選以C3基因為靶向的抗腫瘤藥物，具有靶點明確、高效快速及反應靈敏等特點．但本研究并沒有進行C3啟動子的功能分析，需要在后續(xù)實驗中繼續(xù)進行此方面的研究．

[1] Manning G，Whyte D B，Martinez R，et al．The protein kinase complement of the human genome[J]．Science，2002，298（5600）：1912-1934

[2] Cravedi P，Heeger P S．Complement as a multifaceted modulator of kidney transplant injury[J]．Journal of Clinical Investigation，2015，125（3）：1365-1365

[3] Cheung N K，Walter E I，Smith-Mensah WH，et al．Decay-accelerating factor protects human tumor cells from complement-mediated cytotoxicity in vitro[J]．Journal of Clinical Investigation，1988，81（4）：1122-1128

[4] Liu X J，Kong X X，Wang R，et al．Construction of pGL3-Basic-SREBP-1c-promoter reporter gene vector and detection of its function[J]．Basic & Clinical Medicine，2009，29（5）：495-498

Cloning of human C3promoter and construction of the promoter luciferase reporter gene vectors

Salman Naseer1，Shahid Kham1，M Lmran1，HE Bing2，LIN Jia2

（1. International Education College，2. College of Life Science，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

To clone the human C3gene promoter，and to construct the luciferase reporter gene vector containing the C3gene promoter sequence. The C3promoter fragment was amplified from genomic DNA by PCR. After digestion with restriction enzymes，the C3promoter was cloned into the luciferase reporter vectors. Then the recombinant vector was transiently transfected into Hela cell with pRL-SV40. The activity of luciferase was detected 48 hours later. The results showed that C3gene promoter，a fragment about 2 513bp，was amplified by PCR. Double digestion and sequencing revealed that the recombinant vector had a promoter activity. Conclusion the human C3promoter luciferase reporter gene vector was successfully constructed. The cloned C3gene fragment was demonstrated to contain the cis-regulatory elements.

C3；promoter；luciferase reporter gene vector；vector construction

1007-9831（2016）11-0041-04

Q78

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2016.11.011

2016-09-15

華北理工大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（X2015257）

Salman Naseer（1990-），男，巴基斯坦旁遮普人，在讀本科留學生．E-mai：Dr_Salmankhan@ymail.com

林佳（1982-），女，河北唐山人，講師，碩士，從事分子生物學研究．E-mail：linjia825@126.com