楊艷偉，周曉冰，呂建軍，霍桂桃，屈 哲，林 志，張 頔，王 雪

（中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京 100176）

轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米對食蟹猴小腸黏膜形態(tài)及上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量的影響

楊艷偉，周曉冰，呂建軍，霍桂桃，屈 哲，林 志，張 頔，王 雪*

（中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京 100176）

水稻是人類最重要的糧食作物之一，超過35億人依靠水稻提供每日熱量攝入量的20%[1]。水稻是世界三大主要糧食作物之一，在我國水稻作為第一大糧食作物，約占糧食總產(chǎn)量的40%[2-3]。我國水稻生產(chǎn)中的主要問題仍然是螟蟲，稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲嚴重影響水稻的產(chǎn)量[4]。然而，Bt水稻的成功研發(fā)為病蟲害的防治提供了新的途徑[5]。TT51是由我國華中農(nóng)業(yè)大學自主研發(fā)的水稻新品種，它是轉(zhuǎn)入了從蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)中分離得到的殺蟲蛋白基因cry1Ab/Ac，從而獲得了抗鱗翅目等昆蟲的特性，2009年獲得安全證書[6-7]。cry1Ab/Ac基因?qū)貰t殺蟲蛋白基因的一種，其核苷酸序列長度為1.83 kb，編碼含609個氨基酸的蛋白序列。

Bt蛋白的殺蟲機制是與鱗翅目昆蟲腸道的特異性受體結(jié)合，引起細胞膜穿孔，破壞細胞滲透平衡，細胞腫脹破裂，最終導致昆蟲停止進食而死亡[8]。由于人體腸道無這一特異性受體，因此普遍認為Bt蛋白對人體腸道無不良影響。但是，目前對于Bt蛋白能否通過腸道黏膜免疫毒性引起腸道損傷，進而透過黏膜進入循環(huán)的質(zhì)疑仍舊引起很多研究者的關注[9-10]。小腸上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞作為腸道黏膜免疫相關細胞的重要組成部分[11-12]，構(gòu)成腸道黏膜免疫系統(tǒng)的第一道防御屏障，在抗感染、調(diào)節(jié)上皮細胞的完整性和外來抗原的免疫應答方面起重要作用[13]。其數(shù)量的變化可以在一定程度上反映消化道的局部免疫狀況[14-15]。本研究擬觀察轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米對食蟹猴小腸黏膜形態(tài)、上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞數(shù)量的影響，以豐富轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米的食用安全性資料。

1 材料與方法

1.1 供試品與對照品

普通大米，來源于市售非轉(zhuǎn)基因普通大米。轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米，來源于華中農(nóng)業(yè)大學培育的TT51，種植于江西省某實驗基地。本課題組經(jīng)ELISA檢測，研究采用的普通大米中cry1Ab/Ac蛋白含量為0，轉(zhuǎn)基因大米中cry1Ab/Ac蛋白的含量約為2.5μg/g。普通大米與轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米的常規(guī)營養(yǎng)成分由北京科澳協(xié)力飼料有限公司檢測(見表1)。

表1 受試飼料的常規(guī)營養(yǎng)成分

1.2 實驗動物

普通級食蟹猴24只，雌雄各半，購自廣西雄森靈長類實驗動物養(yǎng)殖開發(fā)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK桂2011-0002。購入時年齡2～3歲，體質(zhì)量范圍2.85～3.75 kg。

1.3 儀器

櫻花Tissue-TekVIP6全自動組織脫水機，櫻花TEC5包埋機，櫻花IVS-410滑動式切片機，尼康80IBF-TUW生物顯微鏡等。

1.4 試劑

蘇木精和伊紅購自中杉金橋生物有限公司；Schiff試劑和過碘酸溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；甲醛、二甲苯、乙醇均購自北京化學試劑公司。

1.5 動物分組及處理

24只食蟹猴隨機分成3組，分別為普通大米對照組、轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米低劑量組、轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米高劑量組。轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米低和高劑量組動物分別飼喂以含17.5%、70%轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米為主糧的猴飼料，對照組均給予普通大米飼料。受試物每天給予2次，每次(100±10) g，共給予6個月，并設4周恢復期，恢復期各組動物給予普通大米飼料。實驗期間每天進行臨床癥狀觀察和攝食量檢測，每周進行體質(zhì)量稱量。在實驗期第1、3、6月和恢復期結(jié)束分別進行體溫、心電圖、血液學、血清生化、尿生化；實驗結(jié)束，稱取臟器質(zhì)量并進行組織病理學檢查。

在食蟹猴連續(xù)喂飼6個月后或恢復期結(jié)束時進行解剖。解剖前，靜脈注射3.5%的戊巴比妥鈉進行麻醉。麻醉完畢后放血處死，打開腹腔將腸道小心的從腸系膜上分離下來，小腸按解剖位置分為十二指腸、空腸、回腸。在十二指腸近端2 cm處、空腸中段、回腸遠端2 cm處分別剪取1 cm腸道用生理鹽水沖洗干凈迅速放入到10%中性緩沖福爾馬林溶液中。詳細記錄

4 5 4

吊蔓在第一長序開花時進行，可用塑料繩進行吊蔓，吊蔓時系根系的繩子不能勒得太緊，要有一定松度，以求它有生長空間。

大體病理學的發(fā)現(xiàn)。麻醉、采血和剖檢時，從最小編號開始每組取1只動物循環(huán)進行。

1.6 小腸黏膜形態(tài)觀察

1.6.1 制作石蠟切片及HE染色 制作石蠟切片程序：經(jīng)中性緩沖福爾馬林固定48h后取材，組織放入包埋盒流水沖洗15min。包埋盒放入櫻花Tissue-TekVIP6全自動組織脫水機中脫水，脫水程序為70% 乙醇3h，80%乙醇3h，95%乙醇2h，無水乙醇1h， 二甲苯1h ，浸蠟3h 。櫻花TEC5包埋機石蠟包埋，切片厚度約3～5μm，HE染色。

1.6.2 PAS染色 染色程序：石蠟切片二甲苯脫蠟15min，無水酒精脫水10min。蒸餾水水洗3min，過碘酸溶液5min，蒸餾水水洗2min，Schiff試劑陰暗處浸染10min。水洗10min，蘇木素染液2min，鹽酸酒精分化3 s，自來水返藍10min，無水乙醇脫水10min，二甲苯透明10min，中性樹膠封固。

1.6.3 顯微鏡觀察和計數(shù) 光學顯微鏡下詳細觀察小腸黏膜形態(tài)和計數(shù)每只食蟹猴的十二指腸、空腸、回腸上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞。具體方法：每個包埋塊選取5張切片(每隔10張取1張)，在10×40倍光學顯微鏡下計數(shù)。每張切片選擇5個視野，每視野選擇1根最長且腸上皮細胞排列整齊的絨毛，計數(shù)每100個腸黏膜上皮細胞間上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞的數(shù)量[16]。

1.7 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行。小腸上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞計數(shù)以(±s)表示。低、高劑量組與對照組之間進行比較采用單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果

2.1 一般常規(guī)檢查結(jié)果

飼喂6個月的結(jié)果顯示，除個別動物出現(xiàn)脫毛，各組動物臨床癥狀未見明顯異常，體質(zhì)量穩(wěn)步增長。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示：與普通大米對照組相比，轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米組動物的體質(zhì)量、攝食量、心電圖、血液學以及臟器質(zhì)量和系數(shù)等指標均未見統(tǒng)計學差異，組織病理學結(jié)果也未見異常，僅體溫、血清生化等個別指標差異有統(tǒng)計學意義。由于以上有差異的指標均在正常范圍內(nèi)，且無時間和劑量相關性，未發(fā)現(xiàn)相關的病理學變化，因此認為以上指標的變化不具有毒理學意義。

2.2.1 黏膜形態(tài) 光鏡下觀察各組腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，為單層柱狀上皮，細胞輪廓清晰，染色鮮明，排列規(guī)則。上皮細胞呈正常生長更新狀態(tài)。

2.2.2 上皮內(nèi)淋巴細胞 光鏡下觀察上皮內(nèi)淋巴細胞經(jīng)HE染色后散在分布于腸絨毛上皮細胞之間，多數(shù)位于上皮細胞基膜附近，少量見于上皮游離面。該細胞以小型細胞為主，胞核大而圓、深染，胞漿較少。多分布于上皮的基底膜附近，少量位于胞核水平以上及細胞頂端，也有游離到腔面和固有層的(圖1)。低、高劑量組與對照組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 不同劑量組上皮內(nèi)淋巴細胞相對數(shù)(%，與柱狀細胞的比率)

2.3 PAS染色結(jié)果

光鏡下觀察，杯狀細胞散在分布于柱狀細胞之間，呈高腳杯狀，杯狀細胞經(jīng)PAS 染色后呈酒紅色，其頂部胞質(zhì)為大量糖原顆粒擁塞而膨隆，底部纖細，有小而深染的不規(guī)則核與少量嗜堿性胞質(zhì)(見圖2)。低劑量組和高劑量組與對照組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義(見表3)。

表3 不同劑量組杯狀細胞相對數(shù)(%，與柱狀細胞的比率)

3 討 論

食蟹猴連續(xù)喂飼轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米6個月，與普通大米對照組相比，轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因組的一般常規(guī)檢查均未見明顯異常。小腸黏膜形態(tài)未見病理改變，低、高劑量組上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞的數(shù)量與對照組之間無明顯差異。轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米對食蟹猴小腸黏膜形態(tài)、上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞未見不良影響。

圖1 不同劑量組小腸上皮內(nèi)淋巴細胞(HE染色，10×20)

圖2 不同劑量組小腸杯狀細胞(PAS染色，10×20)

目前基因工程的快速發(fā)展，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物品種的食用安全性已成為許多國家科學家考慮的問題[17]。盡管目前商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因食品還未出現(xiàn)不良影響的報道，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品商業(yè)化前仍然應該進行詳盡的安全性評價。來源于蘇云金芽孢桿菌(Bt)的cry基因編碼Cry殺蟲蛋白，Cry蛋白對許多重要的農(nóng)作物害蟲，包括鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等都具有特異性的毒殺作用，而對人畜無害。該蛋白被鱗翅目等昆蟲攝食后，腸道上皮細胞的細胞膜形成小孔，擾亂細胞的滲透平衡，并引起細胞腫脹甚至裂解，從而導致昆蟲幼蟲停止進食而最終死亡。然而，cry基因并不是

水稻等植物細胞天然具有的，是通過基因工程方法轉(zhuǎn)入水稻基因組的，因此，其對人體健康的安全性必須得到評估[18]。Bt蛋白成為轉(zhuǎn)基因水稻中新致敏原的概率極低，盡管如此，人們對轉(zhuǎn)Bt基因水稻可能引發(fā)的過敏反應仍然持謹慎態(tài)度，這畢竟是關系到人類健康的重大問題。目前國內(nèi)外對轉(zhuǎn)Bt水稻的食用安全性研究主要集中在嚙齒類動物[19-21]，對于與人基因同源性較高的非人靈長類動物的研究很少。為更全面地反映轉(zhuǎn)Bt基因水稻的食用安全性，應加強這方面的研究，積極關注動物腸道變化。腸道是機體最大的免疫器官，對機體的營養(yǎng)、代謝、免疫發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)基因食品對腸道健康的影響會直接影響到宿主機體的健康狀況，通過對腸道健康的安全檢測可以在一定程度上監(jiān)測轉(zhuǎn)基因食品通過腸道引起的非期望效應，為轉(zhuǎn)基因生物的安全性提供有力保證。杯狀細胞是一種典型的糖蛋白分泌細胞，其分泌的黏蛋白分布于上皮表面，在一定程度上通過粘附阻擋病原生物和有害物質(zhì)的正面破壞，阻止毒素與上皮細胞接觸，對上皮有保護作用[22]。小腸上皮內(nèi)杯狀細胞在抗感染調(diào)節(jié)上皮細胞的完整性和外來抗原的免疫應答等方面起重要作用，其數(shù)量的變化可以在一定的程度上反映消化道的局部免疫狀況[23]。Bt蛋白作為一種在消化道發(fā)揮殺蟲效應的外源蛋白，可能會帶來致敏性和對胃腸道的影響。因此，本研究觀察食蟹猴連續(xù)喂飼轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米對小腸黏膜形態(tài)及小腸杯狀細胞數(shù)量的影響，進一步為轉(zhuǎn)基因組大米的食用安全性提供數(shù)據(jù)支持。

本研究采用的6個月試驗期限，屬于亞慢性毒性階段。為了進一步評價轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米對機體健康的影響，應積極開展致敏性篩選和其他免疫毒性研究，開展轉(zhuǎn)基因大米更長期限的食用安全性評價工作，同時深入考察Bt蛋白在動物體內(nèi)的具體代謝情況。另外，還可考慮結(jié)合體外細胞試驗，引入代謝組學、基因組學和蛋白組學等新技術(shù)，進行Bt蛋白或轉(zhuǎn)基因水稻的分子水平毒性試驗，進一步全面反映轉(zhuǎn)Bt基因水稻的安全性，并建立完善的風險評估機制，加快轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化進程，為人類健康提供保障。

(感謝中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心張琳、孫立、李欣、苗玉發(fā)、潘東升、劉麗、高錫強為本實驗提供的幫助)

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Consumptionof transgenic rice with the cry1Ab/Ac gene on intestinalmucosa, intraepithelial lymphocytes and goblet cellsin Cynomolgusmonkey

YANG Yanwei，ZHOU Xiaobing，LüU..Jianjun，HUO Guitao，QU Zhe，LIN Zhi，ZHANG Di，WANG Xue*
(Key Laboratory of Beijing for Nonclinical Safety Evaluation Research of Drugs, National Center for Safety Evaluationof Drugs, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100176, China)

目的： 研究轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米對食蟹猴小腸黏膜形態(tài)及上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量的影響。方法：以轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米為受試物，選用24只食蟹猴，雌雄各半，隨機分成3組，即普通大米對照組、轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米低、高劑量組。對照組、低劑量和高劑量組給予的猴飼料中轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米含量分別為0、17.5%和70%。每天飼喂2次，每次(100±10) g，持續(xù)6個月，恢復期4周。分別進行一般毒性指標的檢測：臨床癥狀觀察、體質(zhì)量、體溫、心電圖、血液學、血清生化、尿生化、臟器質(zhì)量以及組織病理學檢查。解剖取十二指腸、空腸、回腸進行HE染色和PAS染色，觀察小腸黏膜形態(tài)、上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞數(shù)目。結(jié)果：飼喂6個月后，與普通大米對照組相比，轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米低劑量組和高劑量組食蟹猴的一般常規(guī)檢查未見異常。小腸黏膜形態(tài)各組均未見病理改變，低、高劑量組的上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論：飼喂轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因大米6個月對食蟹猴小腸黏膜形態(tài)、上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞數(shù)量未見不良影響。

cry1Ab/Ac基因；上皮內(nèi)淋巴細胞；杯狀細胞；食蟹猴

OBJECTIVE:To investigate the effectof transgenic rice with the cry1Ab/Ac gene onmorphology of intestinalmucosa，cell numberof intraepithelial lymphocytes and goblet cellsin Cynomolgusmonkey.METHODS：Twenty-four cynomolgusmonkeys，halfmale and female，were randomly divided into 3 groupsincluding control group of ordinary rice，low dose group andhigh dose groups of transgenic rice with the cry1Ab/Ac gene.Monkeys were fed twice a day and each feeding was (100±10) g for 6months with 4 weeks recovery period.Monkeys were observed for general toxicity，clinical effects，body weight，body temperature，electrocardiogram，hematology，serum biochemistry，urinary biochemistry，organ weightandhistopathological examination.HE and PAS staining were done for duodenum，jejunum and lleum.Themorphology of intestinalmucosa，cell numberof intraepithelial lymphocytes and goblet cells were observed undermicroscope.RESULTS：After sixmonths，detectionof transgenic rice with the cry1Ab/Ac gene were 0，17.5% and 70%，in control，low dose andhigh dose groups，respectively.Compared with the control group，no abnormalitiesin toxicity，etc.were found in the treated groups.No pathological changes were observed in intestinalmorphology. Cell numberof intraepithelial lymphocytes and goblet cells were not statistically different between control and treated groups.CONCLUSION：Transgenic rice with the cry1Ab/Ac genehad no side effects on small intestinemucosalmorphology，cell numberof intraepithelial lymphocytes and goblet cellsin Cynomolgusmonkey.

cry1Ab/Ac gene；intraepithelial lymphocytes；goblet cells；Cynomolgusmonkey

R994.4

A

1004-616X(2016)06-0453-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.008

2016-08-28；

2016-10-28

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育國家科技重大專項(2012ZX 08011001)

作者信息： 楊艷偉，E-mail：yangyanwei@nifdc.org.cn。*通信作者，王 雪，E-mail：xue_wang@nifdc.org.cn