高琛琛 薛曉偉 劉玥宏 李利生 徐敬東

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系, 北京 100069)(2. 北京協(xié)和醫(yī)院病理科,北京 100005)(3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院,北京 100054)(4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，北京 100069)

組織學(xué)評(píng)價(jià)和免疫組織化學(xué)特征在生理學(xué)研究中非常重要，因而在保持組織標(biāo)本完整性和緊密性的基礎(chǔ)上選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ê荜P(guān)鍵。常用的組織固定液有卡諾液，Susa液，Helly干液，4%多聚甲醛，Bouin液等[1]。研究表明，結(jié)腸杯狀細(xì)胞內(nèi)含有大量的黏液顆粒，內(nèi)含黏蛋白分泌入腸腔，并在黏膜表層形成一層致密黏液層，作為腸道重要黏膜屏障之一，與其它細(xì)胞及不同機(jī)制共同參與維持腸道穩(wěn)態(tài)[2]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量、著色度的觀察與分析來(lái)對(duì)比不同標(biāo)本分別用卡諾液與甲醛固定液對(duì)黏液固定和著色度的區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常SD大鼠與便秘模型大鼠，6周齡，體質(zhì)量220～250 g，SPF級(jí)，購(gòu)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0001。

1.2 主要試劑

卡諾液，甲醛固定液，HE染液，高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染液。

1.3 便秘模型大鼠的制備

在常規(guī)飲食、環(huán)境、周齡等其他條件相同的基礎(chǔ)上，將用于模型制備的大鼠以地酚諾酯(長(zhǎng)春長(zhǎng)紅制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H22022037)70 mg/kg體質(zhì)量的濃度溶于1 mL生理鹽水，灌胃，每日1次，持續(xù)2周，致使其出現(xiàn)大便秘結(jié)，糞便數(shù)量減少，含水量減少等便秘癥狀。

1.4 大鼠結(jié)腸標(biāo)本的制作

將大鼠麻醉后取結(jié)腸組織，立即投入固定液，分別用卡諾液與甲醛固定液處理后通過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟得到組織蠟塊，經(jīng)修整切片(4 μm)后，分別用HE染液、高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染液染色固封得到結(jié)腸石蠟切片標(biāo)本，使用NikonDS-U3觀察結(jié)腸杯狀細(xì)胞和黏液細(xì)胞的形態(tài)學(xué)；取結(jié)腸放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛(pH7.2)中固定5 min后取出組織，切成1 mm3組織塊繼續(xù)固定。常規(guī)乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片(50 nm)，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色，透射電鏡(Hitachi，HT7700 日本)觀察結(jié)腸杯狀細(xì)胞和黏液細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并拍片。

1.5 結(jié)腸組織標(biāo)本的觀察與杯狀細(xì)胞指標(biāo)統(tǒng)計(jì)

1.5.1杯狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：通過(guò)Nikon DS-U3顯微鏡分別以×20、×100視野觀察正常大鼠與便秘模型大鼠的結(jié)腸標(biāo)本，并對(duì)比兩種固定方法和染色技術(shù)處理后杯狀細(xì)胞形態(tài)和杯狀細(xì)胞內(nèi)黏液顆粒及黏蛋白的分泌情況。通過(guò)電鏡進(jìn)一步觀察結(jié)腸黏液層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.5.2統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)：用NIS-Elemets BR4.10軟件，通過(guò)顏色強(qiáng)度設(shè)定統(tǒng)計(jì)8個(gè)不同視野下杯狀細(xì)胞的數(shù)量和著色度，所有結(jié)果均使用prism6.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 杯狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下，高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染液染色結(jié)腸標(biāo)本上皮組織中充滿大量杯狀細(xì)胞，邊界清晰，胞內(nèi)布滿紅染的黏液顆粒，亦可見(jiàn)被噴向腸腔的黏液(見(jiàn)圖1，A1、A2和B1、B2)；用卡諾液固定、高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染液染色的標(biāo)本杯狀細(xì)胞著色度明顯強(qiáng)于甲醛固定液處理標(biāo)本的杯狀細(xì)胞(見(jiàn)圖1，B1、B2和C1、C2)；甲醛固定液處理、HE染色標(biāo)本的杯狀細(xì)胞成空泡狀，胞核被染成深藍(lán)色，位于細(xì)胞底部，(見(jiàn)圖1，D1、D2)。電鏡下，便秘模型大鼠相比于正常大鼠，結(jié)腸黏膜表層黏液層變薄，分子篩樣[3]作用減弱，細(xì)菌易位，接近甚至直接接觸腸道黏膜上皮細(xì)胞，提示便秘模型的結(jié)腸黏液層與正常相比變薄且不完整(見(jiàn)圖2，A、B)。

2.2 杯狀細(xì)胞數(shù)量及著色度的比較

高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染色標(biāo)本中，如圖3，4和表1所示，與正常大鼠相比，便秘模型大鼠的杯狀細(xì)胞數(shù)量減少13.81%(P<0.05,見(jiàn)圖3A)，而其著色度顯著性增強(qiáng)(P<0.001,見(jiàn)圖3B)。便秘模型大鼠結(jié)腸標(biāo)本中，卡諾液處理與甲醛固定液處理的標(biāo)本相比，杯狀細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性差異(P>0.05,見(jiàn)圖4A)，但著色度明顯增強(qiáng)(P<0.05,見(jiàn)圖4B)。結(jié)果提示，卡諾液處理與甲醛固定液處理的正常大鼠結(jié)腸標(biāo)本的杯狀細(xì)胞數(shù)量及著色度對(duì)比結(jié)果無(wú)顯著性差異，而便秘模型組杯狀細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性差異，但是著色度有顯著性差異。

表1 正常與便秘模型大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量和著色度比較Table 1 Comparison of the number and color intensity of normal and constipation models colon goblet cells

注：與正常組比較，*P<0.05，***P<0.001.與甲醛固定液處理組比較，**P<0.01

Note：compared with the control group，*P<0.05，***P<0.001.Compared with the formaldehyde fixative fixed group，**P<0.01

圖3 正常與便秘模型大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞的特征比較注：A.結(jié)腸陷窩內(nèi)含有杯狀細(xì)胞的數(shù)量對(duì)比；B.杯狀細(xì)胞著色度的對(duì)比。與正常組比較，* P<0.05，***P<0.001.Fig.3 Comparison of the characteristic of colon goblet cells of normal and model rats Note：A. Comparison of the number of goblet cells along colonic depth. B. Comparison of percent of color intensity in goblet cells.Compared with the control group，*P<0.05，***P<0.001.

圖4 不同固定液處理的組織杯狀細(xì)胞特性比較注：A.杯狀細(xì)胞數(shù)量的對(duì)比；B.杯狀細(xì)胞著色度的對(duì)比,與正常組比較，**P<0.01.Fig.4 Comparison of the characteristic of colon goblet cells treated with different fixative Note:A. Comparison of the number of goblet cells. B. Comparison of the percent of color intensity in goblet cells.Compared with the control group，**P<0.01.

3 討論

腸黏膜與免疫屏障、腸道共生菌群、營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物等相互作用共同維持腸道穩(wěn)態(tài)[4]。由腸道杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白是腸道固有免疫第一防線黏液層的主要組成部分[5]，其中由杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白和一些其他活性物質(zhì)構(gòu)成的腸道黏液層，為腸道抵御內(nèi)源或外源性的刺激和微生物的侵襲提供了保障[6]，并有助于維持腸道共生菌群的平衡[7]。因此，杯狀細(xì)胞是維持腸道健康必不可少的保護(hù)者。研究表明[8]，杯狀細(xì)胞黏液必須伴隨水分的擴(kuò)散分泌入腸腔，本實(shí)驗(yàn)用以制備便秘模型大鼠的地芬諾酯，可以阻滯腸黏膜上的水通道，消除腸黏膜的蠕動(dòng)反射而減弱腸蠕動(dòng)，并使腸內(nèi)容物通過(guò)延遲，腸腔內(nèi)水分的吸收增加，腸道內(nèi)的水分減少，所以，便秘模型大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞與正常大鼠相比，不僅數(shù)量減少，而且黏液分泌減少，胞內(nèi)黏液顆粒密度增高，著色度加深，結(jié)腸黏液層厚度變薄，容易引起細(xì)菌易位(如圖2所示)。由此可見(jiàn)，杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白對(duì)于維持腸道穩(wěn)態(tài)不可或缺。另有研究表明[9]，結(jié)腸腸道杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白主要為MUC2黏蛋白，實(shí)質(zhì)為高度糖基化的糖蛋白，具有水溶性，這可能就是因?yàn)橛?%多聚甲醛處理標(biāo)本，致使表層黏液蛋白溶解其中，導(dǎo)致組織標(biāo)本中的黏蛋白含量降低，使其著色度降低；而卡諾液是由無(wú)水乙醇：氯仿：冰醋酸(6∶3∶1)組成，其不含蒸餾水[1]，可以完整地保存了標(biāo)本杯狀細(xì)胞及結(jié)腸黏液層中黏液蛋白含量，因而能夠看到黏膜表面紅染的黏液層。因此，在杯狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及黏液分泌的觀察中，用卡諾液處理標(biāo)本優(yōu)于甲醛固定液。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)杯狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及數(shù)量與著色度的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果提示卡諾液與甲醛固定液處理標(biāo)本的差異性。從而應(yīng)該注意的是，在不同實(shí)驗(yàn)，不同標(biāo)本的制備中，對(duì)于固定液的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象的特性而確定，同時(shí)，不可忽視應(yīng)用不同固定劑處理標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)可能有差異性。因此，要觀察結(jié)腸黏液分泌的標(biāo)本時(shí)，相較于甲醛固定、HE染色方法，卡諾液固定、高碘酸希爾法阿爾新藍(lán)染色處理標(biāo)本的方法更為合適。