王樂(lè)樂(lè)，劉江正，劉萌萌，孔德欽，張 濤，于衛(wèi)華，劉 瑞，張曉迪，王 欣，海春旭*

（第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032）

鎘暴露致大鼠腎損傷的量效關(guān)系及其機(jī)制

王樂(lè)樂(lè)，劉江正，劉萌萌，孔德欽，張 濤，于衛(wèi)華，劉 瑞，張曉迪，王 欣，海春旭*

（第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032）

鎘污染的危害已經(jīng)成為全球普遍關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題。腎臟是鎘中毒的靶器官，是鎘毒性防治研究的重點(diǎn)[1-2]。研究進(jìn)展表明，鎘暴露產(chǎn)生的毒性與氧化損傷有關(guān)。而氧化應(yīng)激或損傷主要與活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平密切相關(guān)，活性氧既有內(nèi)源性的也有外源性的，但均與線(xiàn)粒體的功能和結(jié)構(gòu)具有內(nèi)在聯(lián)系。目前鎘致腎線(xiàn)粒體損傷的機(jī)制還不太清楚，故本研究采用CdCl2對(duì)SD大鼠進(jìn)行28 d染毒試驗(yàn)，旨在觀察大鼠亞急性鎘暴露致腎損傷的量效關(guān)系和毒理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)F20100208)；尿素氮(urea)、肌酐(creatinine，苦味酸法)測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司；DHE、MitoSOX、蛋白酶抑制劑Cocktail和染核試劑Hoechst 33528購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白購(gòu)自美國(guó)Boehringer公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo公司；兔抗 SOD1、SOD2購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；兔抗GPx-1抗體購(gòu)于Bioworld公司；兔抗CAT抗體購(gòu)于Protein Tech公司；兔抗Bcl-2購(gòu)于Cell Signal Technology公司；兔抗Bax抗體購(gòu)于Santa公司。

日立7020全自動(dòng)生化檢測(cè)儀購(gòu)自日立公司；全波段酶標(biāo)儀為T(mén)ECAN公司產(chǎn)品；正置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。透射電鏡觀察在口腔醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。Mini-Protean電泳系統(tǒng)、蛋白半干轉(zhuǎn)裝置及凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物與飼養(yǎng) SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量100～150 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(陜)2014-0490，動(dòng)物房溫度為(24±2)℃，相對(duì)濕度為50%±10%。

1.2.2 動(dòng)物分組和處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(去離子水)；低劑量鎘(1mg/kg CdCl2)處理組；中劑量鎘(3mg/kg CdCl2)處理組；高劑量鎘(5mg/kg CdCl2)處理組。灌胃體積為10mL/kg。灌胃順序按照對(duì)照組、低、中、高劑量順序依次進(jìn)行，給藥劑量根據(jù)文獻(xiàn)并結(jié)合課題組前期工作和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。每天灌胃1次，連續(xù)染毒4周后，禁食12h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉，麻醉后腹主動(dòng)脈取血。用經(jīng)高溫處理過(guò)的器械剪取雙側(cè)腎臟，稱(chēng)濕質(zhì)量，計(jì)算腎臟系數(shù)(雙側(cè)腎臟濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)。取左腎分為3部分(主要為腎皮質(zhì))，分別制作冰凍切片、石蠟切片(4%甲醛固定)和透射電鏡標(biāo)本(2%戊二醛固定)。右腎于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)含量檢測(cè) 未經(jīng)抗凝的全血經(jīng)3 500 r/min離心10min后，取上部血清，用日立7020全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清中BUN和SCr含量。

1.2.4 HE染色[3]腎組織用4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、包埋、切片、脫蠟、HE染色、脫水、封片后于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 透射電鏡觀察 腎皮質(zhì)切成1mm3左右的立方體，置于2%戊二醛中固定，制作腎臟電鏡切片，透射電鏡下觀察各組大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞的超微病理變化。

1.2.6 腎皮質(zhì)ROS水平檢測(cè) 采用熒光探針DHE檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平[4]，采用MitoSOX用于檢測(cè)線(xiàn)粒體內(nèi)ROS水平[5]，具體方法如下：制備厚度為10μm的腎組織冰凍切片，置于濕盒中，將10μmol/L DhE、5mmol/LmitoSOX分別按1∶1 000、1∶500的比例用PBS稀釋?zhuān)?0μmol/L的Hoechst按1∶500的比例加入稀釋過(guò)的兩種染料中混勻，向每張切片上的腎組織滴加混合液150μL，在37℃孵箱中避光孵育40min，PBS洗3次，甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.7 腎組織SOD1、SOD2、CAT、GPx-1和GRP78、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的測(cè)定 用眼科剪將100mg腎皮質(zhì)部分剪碎，置于玻璃勻漿器中，加入1mL裂解緩沖液(1mL RIPA裂解液+20μL礬酸鈉+5μL Cocktail)，冰上充分勻漿，4℃裂解30min，勻漿液于4℃、10 000 r/min離心20min，取上清，留取20μL用

作BCA蛋白定量，余下部分加入等體積2×SDS和5μL二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，100℃煮沸5min，分裝后保存于-80℃ ，用于常規(guī)Western blotting測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

對(duì)照組大鼠攝食、攝水情況均正常，鎘暴露組大鼠隨CdCl2劑量升高逐漸出現(xiàn)食欲減退、皮毛粗糙、情緒暴躁等現(xiàn)象。染毒期間各組大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間的變化如圖1所示。與對(duì)照組比較，各鎘暴露組大鼠體質(zhì)量及腎臟臟器系數(shù)(表1)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖1 大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)曲線(xiàn)

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化和造模結(jié)束時(shí)的腎臟臟器系數(shù)(n=10)

2.2 腎功能變化

通過(guò)測(cè)定血清中BUN和SCr的含量評(píng)價(jià)大鼠腎功能[6]。CdCl灌胃4周后，血清中BUN含量隨鎘暴露劑量升高逐漸增加(r=0.463)。其中，5mg/kg CdCl2暴露組與對(duì)照組相比，BUN含量顯著升高(P<0.05)，提示出現(xiàn)腎功能損傷。但各劑量組SCr含量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 鎘暴露對(duì)大鼠腎功能的影響(n=10)

圖2 腎臟病理變化(HE染色)

2.3 腎組織病理學(xué)觀察

HE染色見(jiàn)圖2。對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球形狀規(guī)則，毛細(xì)血管網(wǎng)輪廓清晰。腎小管輪廓

清楚，游離面刷狀緣清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，管腔干凈。隨著CdCl2染毒劑量增加，腎臟病理?yè)p傷進(jìn)行性加重。1mg/kg CdCl2處理組腎小球結(jié)構(gòu)尚完整，腎小管略腫脹，間質(zhì)充血。3mg/kg CdCl2處理組腎小球腫脹，結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，細(xì)胞數(shù)目增多，排列紊亂，球囊間隙幾乎不見(jiàn)；腎小管明顯腫脹，管腔狹窄，上皮細(xì)胞壞死脫落堆積于管腔；腎間質(zhì)充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。5mg/kg CdCl2處理組腎小球腫脹，細(xì)胞數(shù)目增多，毛細(xì)血管網(wǎng)出現(xiàn)裂隙；腎小管廣泛性病變，排列紊亂、腫脹、管腔狹窄幾乎不見(jiàn)，上皮細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)消失，脫落細(xì)胞堆積于管腔，伊紅染色陽(yáng)性；腎間質(zhì)充血嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯增加。

2.4 腎皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的變化

超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果見(jiàn)圖3。鎘暴露主要引起腎小管上皮細(xì)胞損傷，尤其是線(xiàn)粒體損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)腫脹、變形、空泡樣變，線(xiàn)粒體嵴紊亂、模糊甚至消失，損傷程度隨CdCl2染毒劑量的增加而逐漸加重。

圖3 腎皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)觀察

2.5 腎組織細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化

DHE和MitoSOX染色結(jié)果如圖4所示，隨CdCl2染毒劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸增加，線(xiàn)粒體內(nèi)ROS水平增加更為明顯。

圖4 腎臟冰凍切片

2.6 腎組織中SOD1、SOD2、CAT和GPX1蛋白的表達(dá)

如圖5所示。與對(duì)照組比較，鎘暴露組隨CdCl2劑量升高，存在于線(xiàn)粒體嵴的抗氧化酶SOD2(r=0.854)與存在于細(xì)胞質(zhì)中的CAT(r=0.975)和GPX1(r=0.918)蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P均<0.05)；其中，1mg/kg CdCl2處理組GPX1蛋白表達(dá)量增加明顯(P<0.05)；3mg/kg CdCl2處理組CAT蛋白和GPX1蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)；5

mg/kg處理組SOD2、CAT、GPX1蛋白表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)。而存在于細(xì)胞質(zhì)中的SOD1表達(dá)則逐漸下調(diào)(r=-0.987，P<0.05)。

圖5 Western blotting測(cè)定腎皮質(zhì)抗氧化酶表達(dá)水平

2.7 腎組織中GRP78、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

通過(guò)Western blotting檢測(cè)各劑量組腎皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)水平[7]，促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。結(jié)果見(jiàn)圖6。與對(duì)照組相比，GRP78表達(dá)水平隨CdCl2劑量升高而增加(r= 0.913，P<0.05)；1和3mg/kg CdCl2處理組Bax表達(dá)顯著增加(r=0.226，P<0.05)；Bcl-2表達(dá)隨CdCl2劑量增加逐漸降低(r=-0.85，P<0.05)，但Bax/Bcl-2隨劑量增加而增加(r=0.83，P<0.05)，見(jiàn)圖7。

圖6 Western blotting測(cè)定腎皮質(zhì)GRP78、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平

圖7 Bax/Bcl-2值的變化

3 討 論

人體非必需重金屬元素鎘(Cd)，作為已確定的人類(lèi)致癌物，容易進(jìn)入空氣、水源、土壤、動(dòng)植物等造成環(huán)境污染，并經(jīng)呼吸道、消化道、皮膚等途徑間接進(jìn)入人體，導(dǎo)致CdCl(Cd2+)中毒的發(fā)生。Cd2+經(jīng)呼吸道或消化道攝入后進(jìn)入血循環(huán)，血漿中的游離Cd2+隨血液循環(huán)被輸送到全身各臟器的組織細(xì)胞中，從而對(duì)肝臟、腎臟、骨骼、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[8-9]等造成不同程度的損害。有研究顯示，腎近端小管S1段可能是鎘沉積的主要靶點(diǎn)，體內(nèi)約30%的鎘沉積于腎小管區(qū)[10]，也有研究認(rèn)為，Cd2+導(dǎo)致的骨軟化癥

等嚴(yán)重后果是繼發(fā)于腎小管病的[11]，這些使腎臟成為Cd2+對(duì)人體毒性作用的主要靶器官和研究熱點(diǎn)。

本研究選取腎臟作為研究重點(diǎn)，經(jīng)CdCl2灌胃染毒，并通過(guò)HE染色和檢測(cè)大鼠血清腎功能指標(biāo)BUN和SCr的結(jié)果，證明鎘暴露可以造成大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷。且隨著CdCl2染毒劑量的增大，腎臟病理?yè)p傷進(jìn)行性加重。證明了鎘暴露導(dǎo)致的腎臟損傷具有劑量依賴(lài)性。

同時(shí)，通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹變圓、嵴消失、空泡樣變等損傷，且隨著染毒劑量增大，損傷程度也加重，提示Cd2+造成的大鼠腎毒性的關(guān)鍵靶點(diǎn)是線(xiàn)粒體。

線(xiàn)粒體作為生物體細(xì)胞的重要組成部分，其承擔(dān)的呼吸作用是為機(jī)體提供ATP和維持各項(xiàng)生命活動(dòng)所必需的[12]，線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的損傷，從而引發(fā)臟器損傷甚至全身疾病。

有研究證明Cd2+只有在進(jìn)入細(xì)胞后才產(chǎn)生毒性[13]，細(xì)胞凋亡是Cd2+細(xì)胞毒性的主要事件。因此本研究還測(cè)定了腎組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)隨CdCl2劑量增加逐漸降低(r=-0.85，P<0.05)，1和3mg/kg CdCl2處理組促凋亡蛋白Bax表達(dá)逐漸增加(r=0.226，P<0.05)，5mg/kg CdCl2處理組表達(dá)增高，但較前組表達(dá)低(P>0.05)。通常采用Bax/Bcl-2的值來(lái)觀察細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然Bax在5mg/kg CdCl2處理組表達(dá)較前減少，但Bax/ Bcl-2 依然隨CdCl2染毒劑量的增大而增加，提示腎組織細(xì)胞的凋亡程度可能存在劑量依賴(lài)性地增加。

目前關(guān)于Cd2+毒性的具體機(jī)制尚不清楚[14]，但大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在鎘暴露導(dǎo)致的腎損傷中起著重要作用[15]。氧化應(yīng)激損傷主要表現(xiàn)為生物大分子(如DNA、蛋白質(zhì)和脂類(lèi))的結(jié)構(gòu)及功能的損傷。盡管Cd2+只有一個(gè)氧化態(tài)，不能直接產(chǎn)生自由基，但是Cd2+可通過(guò)從金屬依賴(lài)性抗氧化酶(如SOD)中置換金屬，干擾這些酶類(lèi)的作用[16]，也可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)含巰基的物質(zhì)(如谷胱甘肽GSH、金屬硫蛋白MT等)[14]，間接促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，使機(jī)體氧化還原平衡被破壞[17]，可導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙[18]，抑制呼吸作用，誘發(fā)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化等[19]，直至引起機(jī)體不可逆的損傷。

本研究通過(guò)DHE和MitoSOX染色以及Western blotting觀察到，腎組織的ROS水平呈劑量依賴(lài)性地增加，而抗氧化酶類(lèi)的表達(dá)呈現(xiàn)不同趨勢(shì)。SOD作為清除自由基的主要酶類(lèi)，存在于細(xì)胞質(zhì)中的抗氧化酶SOD1表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，這證明Cd2+腎毒性可能引起氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而引起主要抗氧化酶SOD1表達(dá)下調(diào)。而存在于線(xiàn)粒體嵴的抗氧化酶SOD2蛋白表達(dá)隨鎘暴露劑量增加明顯上調(diào)，提示，線(xiàn)粒體盡管已經(jīng)出現(xiàn)形態(tài)和功能損傷，但可能還處在氧化應(yīng)激損傷代償性修復(fù)范圍。此外，SOD主要清除超氧陰離子自由基,而CAT，GPX1主要清除過(guò)氧化氫(H2O2)等[17],，SOD1表達(dá)下調(diào)證明鎘暴露后細(xì)胞清除的能力下降，可能是由于細(xì)胞內(nèi)ROS主要是大量堆積，超過(guò)了氧化應(yīng)激損傷代償性修復(fù)范圍，而H2O2等還未超過(guò)代償范圍，從而使抗氧化酶SOD1與CAT、GPX1的表達(dá)呈現(xiàn)不同趨勢(shì)。但其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

研究中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，腎皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)水平隨鎘暴露劑量增加而進(jìn)行性上調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Cd2+中毒致腎損傷中可能發(fā)揮作用。

隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，Cd污染已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全球性環(huán)境問(wèn)題，Cd導(dǎo)致的食品污染更是已成為嚴(yán)重公害，尤其是Cd2+中毒尚無(wú)有效的治療方案[15]。本研究觀察到亞急性鎘暴露造成的大鼠腎損傷存在劑量依賴(lài)性，氧化應(yīng)激包括線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是Cd2+中毒損傷的關(guān)鍵機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于尋找切實(shí)有效的治療Cd2+中毒的藥物和干預(yù)措施提供了思路，有著一定的現(xiàn)實(shí)意義。

[1] JohrIn，Jacquillet G，Unwin R.Heavymetal poisoning：the effects of cadmium on the kidney[J].Biometals，2010，23(5)：783-792.

[2] Yangh，Shu Y.Cadmium transportersin the kidney and cadmium-induced nephrotoxicity[J].Int Jmol Sci，2015，16(1)：1484-1494.

[3] Wang Y，Wu Y，Luo K，etal.The protective effects of selenium on cadmium-induced oxidative stress and apoptosis viamitochondria pathway inmice kidney[J].Food Chem Toxicol，2013，58：61-67.

[4] Wang C，Blough ER，Arvapalli R，etal.Metabolic syndrome-induced tubulointerstitial injury：Role of oxidative stress and preventive effects of acetaminophen[J].Free Radic Biolmed，2013，65：1417-1426.

[5]mitchell T，Sabah，Laakman J，etal.Role ofmitochondrialderived oxidantsin renal tubular cell cold-storage injury[J].Free Radic Biolmed，2010，49(8)：1273-1282.

[6] Latchoumycandane C，Nagy LE，McIntyre TM.Chronic ethanol ingestion induces oxidative kidney injury through taurine-inhibitable inflammation[J].Free Radic Biolmed，2014，69：403-416.

[7] Xu W，Neckers L.Gr(i)p the ER to stress outmelanoma[J].

Cancer Cell，2016，29(6)：769-771.

[8] Chen S，Ren Q，Zhang J，etal.N-acetyl-L-cysteine protects against cadmium-induced neuronal apoptosis by inhibiting ROS-dependentactivationof Akt/mTOR pathway inmouse brain[J].Neuropath Appl Neuro，2014，40(6)：759-777.

[9] Zhai Q，Narbad A，Chen W.Dietary strategies for the treatmentof cadmium and lead toxicity[J].Nutrients，2015，7(1)：552-571.

[10] Bernhoft RA.Cadmium toxicity and treatment[J].Sci World J，2013，2013：1-7.

[11] Babah，Tsuneyama K，Kumada T，etal.Histopathological analysis forosteomalacia and tubulopathy in itai-itai disease[J].J Toxicol Sci，2014，39(1)： 91-96.

[12] Adiele RC，Stevens D，Kamunde C.Features of cadmium and calcium uptake and toxicity in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)mitochondria[J].Toxicol in Vitro，2012，26(1)：164-173.

[13] Jorge-Nebert LF，Galvez-Peraltam，Landerofigueroa J，etal.Comparing gene expression during cadmium uptake and distribution：untreated versus oral Cd-treated wild-type and ZIP14 knockoutmice[J].Toxicol Sci，2014，143(1)：26-35.

[14] Prozialeck WC，Edwards JR.Mechanisms of cadmium-induced proximal tubule injury：newinsights with implications for biomonitoring and therapeuticinterventions[J].J Pharmacol Exp Ther，2012，343(1)：2-12.

[15]matovi? V，Buha A，Bulat Z，etal.Cadmium toxicity revisited：focus onoxidative stressinduction and interactions with zinc andmagnesium[J].Arch Toxicol，2011，62(1)：65-75.

[16] Wang J，Zhuh，Liu X，etal.N-acetylcysteine protects against cadmium-induced oxidative stressin rathepatocytes[J].J Vet Sci，2014，15(4)：485.

[17] 海春旭.自由基醫(yī)學(xué)[M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2006.

[18] Ben P，Zhang Z，Xuan C，etal.Protective effectof l-theanine on cadmium-induced apoptosisin PC12 cells by inhibiting themitochondria-mediated pathway[J].Neurochem Res，2015，40(8)：1661-1670.

[19] Luevano J，Damodaran C.A review ofmolecular events of cadmium-induced carcinogenesis[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol， 2014，33(3)：183-194.

Dose-dependent inductionof renal injury by cadmium in rats

WANG Lele，LIU Jiangzheng，LIUmengmeng，KONG Deqin，ZHANG Tao，YU Weihua，LIU Rui，ZHANG Xiaodi，WANG Xin，HAI Chunxu*
(Departmentof Toxicology, School of Publichealth, Fourthmilitarymedical University, Shaanxi Key Lab of Free Radical Biology andmedicine, Xi'an 710032, Shaanxi, China)

目的：探 討不同劑量氯化鎘(CdCl2)染毒對(duì)大鼠腎損傷的量效關(guān)系及其機(jī)制。方法：雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為0、1、3和5mg/kg CdCl2染毒組，每天灌胃1次。連續(xù)染毒4周后檢測(cè)血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)水平評(píng)價(jià)腎功能；HE染色觀察腎臟病理?yè)p傷；透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化；DHE及MitoSOX熒光探針檢測(cè)腎組織中活性氧(ROS)含量變化；免疫印跡檢測(cè)SOD1、SOD2、GPx-1、CAT、Bax、Bcl-2以及GRP78蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，鎘暴露后大鼠體質(zhì)量及腎體比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；隨CdCl2劑量增加，血清BUN含量逐漸增加(r=0.463，P<0.05)；腎臟病理?yè)p傷進(jìn)行性加重，出現(xiàn)腎小球腎小管腫脹，腎小管管腔狹窄、上皮細(xì)胞壞死脫落堆積于管腔、管腔內(nèi)可見(jiàn)管型，腎間質(zhì)充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷，腫脹、變形、空泡樣變程度逐漸加重；腎組織中ROS含量逐漸增加；抗氧化酶SOD2、GPx-1和CAT表達(dá)逐漸增加(r依次為0.854、0.975、0.918，P均<0.05)，SOD1表達(dá)逐漸減少(r=-0.987，P<0.05)；腎臟組織促凋亡蛋白Bax表達(dá)在0～3m g/kg C dCl2處理組逐漸增加(r=0.226，P<0.05)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)逐漸減少(r=-0.85，P<0.05)，Bax/Bcl-2呈劑量依賴(lài)性升高(r=0.83，P<0.05)； 同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)也隨CdCl2劑量增加而升高(r=0.913，P<0.05)。結(jié)論：不同劑量鎘暴露致雄性SD大鼠腎臟損傷存在劑量效應(yīng)關(guān)系，其作用機(jī)制可能是鎘暴露導(dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，從而引起氧化應(yīng)激，進(jìn)一步引起凋亡和組織損傷。

鎘暴露；腎損傷；劑量效應(yīng)關(guān)系；氧化應(yīng)激；活性氧

OBJECTIVE:This study was designed to investigate the dose-dependent relationship and the possiblemechanisms of renal injury by cadmium in rats.METHODS：Fortymale rats were randomly divided intofour groups (0，1，3 and 5mg/kg CdCl2) groups.The rats were intra-gastrically administrated CdCl2daily to investigate the inductionof renal injury.Blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) weremeasured to evaluate renal function.Kidney tissues were stained withhematoxylin-eosin (HE) and observed forhistopathological changes.Transmission electronmicroscopye was used to detect ultrastructural abnormalities.Levels of ROsin kidney was detected by DHE andmitoSOX staining.The levels of SOD1，SOD2，GPx-1，CAT，Bax，Bcl-2，GRP78 weremeasured by Western blotting.RESULTS：After exposure to CdCl2for 4 weeks，the relative kidney weights showed no significant difference among the 4 groups.As the dose of CdCl2increased，the levels of BUN elevated gradually (r=0.463，P<0.05).Pathological damages to kidneys were progressively aggravated.Swelling of glomerulus and renal tubule，and necrosis of tubular epithelial cells were observed under lightmicroscopy.And it was also observed that the lumina of renal tubules contained necrotic epithelial cellular debris and casts.Interstitialhyperemia and inflammatory infiltration were found as well.The ultrastructure ofmitochondria in the epithelium of proximal convoluted tubule showed swelling，deformation and vacuolation in a dose-dependentmanner.The level of kidney ROS elevated gradually.Levels of SOD2，GPx-1 and CAT

cadmium exposure；renal injury；dose-dependent；oxidative stress；reactive oxygen species

R994.6

A

1004-616X(2016)06-0446-07

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.007

2016-07-19；

2016-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(81473010)；陜西省自然科學(xué)基金(2016JM8024)

作者信息： 王樂(lè)樂(lè)，E-mail：diana1147824730@163.com。*通信作者，海春旭，E-mail：cx-hai@fmmu.edu.cn

were upregulated (r=0.854，0.975，0.918，P all<0.05) while SOD1 were downregulated (r=-0.987，P<0.05) as the dose of CdCl2increased.Meanwhile，levels of the apoptosis-promoting Bax increased (r=0.226，P<0.05) while the antiapoptotic Bcl-2 decreased (r=-0.85，P<0.05) and the ratio of Bax/Bcl-2 increased (r=0.83，P<0.05).The levels of GRP78 also increased when the dose of CdCl2increased (r=0.913，P<0.05).CONCLUSION：The results demonstrate that there was a dose-dependent toxic effectof CdCl2on renal structure and function.Moreover，oxidative stressmight be the keymechanism involved in the toxicity of cadmium because of increased antioxidase expression and levels of ROS.