陳 艷，張慧霞

（1.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001；2.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

基于TALE技術(shù)的哈薩克族食管上皮DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1高表達細胞株模型的構(gòu)建

陳 艷1，2，張慧霞2

（1.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001；2.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

食管癌(esophageal cancer)是全球第8大惡性腫瘤，80%發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。中國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一，每年死亡者約為15萬人，幾乎占全國惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/4[2]，占世界食管癌死亡人數(shù)的一半[3]。新疆哈薩克族居住區(qū)是我國食管癌六大高發(fā)區(qū)之一[4-5]，發(fā)病率高達155.9/10萬，死亡率(88.7/10萬)遠高于同地區(qū)其他民族(22.3/10萬)[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，DNA CpG島異常甲基化是腫瘤形成過程中的一個早期、頻發(fā)事件，能使腫瘤相關(guān)基因失去功能表現(xiàn)為表遺傳效應(yīng)，是腫瘤發(fā)生中的一個重要因素[7]，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase 1，DNMT1)是調(diào)節(jié)DNA甲基化最重要的酶，主要參與維持

甲基化[8]，其激活及過表達可以通過促進DNA高甲基化而導(dǎo)致腫瘤抑制基因表達沉默，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[9]。類轉(zhuǎn)錄激活因子(transcription-like effector，TALE)是植物致病菌黃單孢桿菌通過III型分泌系統(tǒng)注入到寄主細胞內(nèi)的一類具有DNA結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，根據(jù)其識別DNA序列的特征，近年來已迅速發(fā)展成有效的基因組編輯工具[10]。因此，本研究利用TALE技術(shù)構(gòu)建DNMT1高表達的哈薩克族食管上皮細胞株模型，為深入研究食管癌的發(fā)生機制提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 哈薩克族食管上皮細胞，來源于本課題組既往收集的哈薩克族食管癌患者的正常食管組織，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化法成功培養(yǎng)出了哈族食管細胞，并對培養(yǎng)出來的細胞進行了鑒定，經(jīng)鑒定上皮細胞來源大于95%[11]；EpicM-2培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Gibco公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) PCR酶(TaKaRa公司)；全蛋白提取試劑盒(上海生工)；DNMT1 抗體(Abcam公司)；Bsa I酶和T4 DNA連接酶(NEB公司)。

1.1.2 儀器 熒光倒置顯微鏡(Olympus)；CO2恒溫孵育箱(日本SANYO公司)；低溫離心機(日本SONY公司)；酶標儀(上海新振儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 哈薩克族食管上皮細胞常規(guī)培養(yǎng)于1× EpicM-2無血清培養(yǎng)基中，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的孵育箱中培養(yǎng)，當細胞生長匯合度至80%～90%時按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 DNMT1-TALE-VP64載體的構(gòu)建 由于TALEs的可編輯屬性，可在啟動子近端區(qū)域內(nèi)選擇一段DNA序列作為靶序列，進行TALE識別模塊構(gòu)建。以下序列為DNMT1基因轉(zhuǎn)錄起始位點附近序列(方括號是轉(zhuǎn)錄起始位點)。

gagatgcagtttctctatgttacctaggctggtctaaaactcctgggctcaagcgatcctcccaccctggcctcccaaagtgctgggatgacaggcgtgagccacgtggtg cttaaaaaaggcaacaaaaaaccccccacacactgggtatagaagtggcatgggcctctatacactgtgagattcttggtactagctacaaattctgtgtatactcaagattttcta gagtaggtgcaattaccccgttttacagatgaggacacagaggctgagccgtagtgacccacctaaggtcgtatagccagcaaatagatggaggttggattggaactgaggactt tactcaagggctctcacaaacccttgggggcttctcgctgctttatccccatcacacctgaaagaatgaatgaatgaatgcctcgggcaccgtgcccacctcccagcaaaccgtg gagcttggacgagcccactgctccgcgtggggggggtgtgtgcccgccttgcgcatg cgtgttccctgggcatggcc[G]GCTCCGTTCCATCCTTCTGCACA GGGTATCGCCTCTCTCCGTTTGGTACATCCCCTCCTCC CCCACGCCCGGACTGGGGTGGTAGACGCCGCCTCCGC TCATCGCCCCTCCCCATCGGTTTCCGCGCGAAAAGCC GGGGCGCCTGCGCTGCCGCCGCCGCGTCTGCTGAAGCCTCCGAGATGCCGGCGCGTACCGCCCCAGCCCGGGTG CCCACACTGGCCGTCCCGGCCATCTCGCTGCCCGACGATGTCCGCAGGCG。

在轉(zhuǎn)錄起始位點周圍600bp范圍內(nèi)搜索合適的TALE結(jié)合位置，排除如TATA-box等與轉(zhuǎn)錄關(guān)系的位點及潛在的CpG島甲基化序列，構(gòu)建靶點序列，然后按照C對應(yīng)HD，T對應(yīng)NG，A對應(yīng)NI，G對應(yīng)NN的關(guān)系設(shè)計對應(yīng)的TALE隊列。詳見表1。

表1 構(gòu)建DNMT1-TALE-VP64質(zhì)粒的靶向序列和TALE對列表

按照設(shè)計的WV0132、WV0133和WV072 TALE隊列從Addgene (http://www.addgene.org)模塊庫中選擇合適的模塊，通過Bsa I酶切作用和T4 DNA 連接酶連接獲得含有WV0132、WV0133和WV072的TALE隊列的表達質(zhì)粒，命名為pXanthoTMV.basic.puro-WV0132(以下簡稱WV0132)、pXanthoTMV.basic.puro-WV0133(簡稱WV0133)和pXanthoTMV.basic.puro-WV072(轉(zhuǎn)染載體pXanthoTMV.basic.puro后，陽性細胞具有嘌呤霉素抗性，簡稱WV072)。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定株篩選 將細胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞匯合率達80%～90%時(大部分細胞處于分裂期)常規(guī)消化，計數(shù)。按3×105/mL的密度接種于12孔板，每孔1mL。向一滅菌離心管中加入DNMT1-TALE-VP64質(zhì)粒DNA 2μg，補充相應(yīng)體積的Opti-MEM至50μL，混合均勻；將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取2μL在另一管中與48μL Opti-MEM混合，在室溫下溫育5min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000混合，室溫下溫育20min，形成

DNA與Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到12孔板中，輕搖混勻后，放至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染24h后，將培養(yǎng)基更換為含2μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。未轉(zhuǎn)染的細胞將在2～3 d后開始死亡。期間正常換液，保持嘌呤霉素的濃度，直到未轉(zhuǎn)染細胞全部死亡，待剩余細胞明顯長成克隆或長滿后進行傳代培養(yǎng)，以獲得足夠的細胞用于目的基因的表達檢測。

1.2.4 DNMT1mRNA表達水平的檢測 按Trizol (Invitrogen公司)提取試劑說明書抽提細胞內(nèi)總RNA，并確定RNA的純度及濃度。再按Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成(Q-DNMT1-F：GCAAG AAGTGAAGCCCGTAG，Q-DNMT1-R：TGAACGCTtaGCCTCTCCAT)。然后按SYBR?P remix Ex TaqTMII試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR實驗。PCR擴增條件：預(yù)變性95℃、30 s，變性95℃、5 s，退火和延伸60℃、34 s，共擴增40循環(huán)。采用2-△△CT法分析DNMT1在各不同轉(zhuǎn)染組的表達差異。

1.2.5 Western blot法檢測DNMT1蛋白表達水平 BCA法對所提取的蛋白進行定量分析。在提取的蛋白中加入5×SDS上樣緩沖液，混合均勻后，放入沸水中水浴5min，使蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)印PVDF膜，將膜用TBST漂洗3次，然后用5%的脫脂奶粉37℃緩慢震蕩2h，與DNMT1和β-actin一抗、二抗孵育，曝光。目的蛋白的相對表達量為目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，測得的數(shù)據(jù)-用(±s)表示，多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析，兩兩比較采用SNK(方差齊)或Games-Howell檢驗(方差不齊)，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率

以哈薩克族食管上皮細胞為轉(zhuǎn)染對象，經(jīng)熒光和白光拍攝后發(fā)現(xiàn)，該種細胞無自發(fā)熒光產(chǎn)生，避免了細胞背景對實驗的干擾(圖1A)。將帶有熒光標記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哈薩克族食管上皮細胞后，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞轉(zhuǎn)染效率較高(圖1B)。在細胞密度基本一致和轉(zhuǎn)染條件相同時，將帶有WV0132的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哈薩克族食管上皮細胞的轉(zhuǎn)染效率也較高(圖3C)，同時通過嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染后的細胞進行篩選也證明了該細胞轉(zhuǎn)染效率較高這一結(jié)果。

圖1 細胞轉(zhuǎn)染效率圖(以轉(zhuǎn)染W(wǎng)V0132質(zhì)粒為例，×200)

2.2 DNMT1過表達穩(wěn)定細胞株的篩選

圖2 嘌呤霉素對不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞篩選4 d后的細胞生長情況(×200)

見圖2。轉(zhuǎn)染24h后，在培養(yǎng)基中加入2μg/mL嘌

呤霉素對細胞進行篩選。對照組細胞不攜帶嘌呤霉素抗性標記，藥物篩選4 d后細胞全部死亡(圖2A)。實驗組和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組細胞攜帶嘌呤霉素抗性標記，篩選4 d后細胞生長狀況良好(圖2B和2C)。

2.3 DNMT1mRNA和蛋白表達水平的檢測

WV0133和WV0132質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞DNMT1mRNA和蛋白表達水平均高于正常細胞組(P<0.01)。陰性質(zhì)粒組與正常細胞組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖3。

表2 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后DNMT1mRNA和蛋白相對表達水平(±s)

表2 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后DNMT1mRNA和蛋白相對表達水平(±s)

與正常細胞組相比，**P<0.01.

圖3 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后DNMT1蛋白表達的電泳圖

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，外源基因轉(zhuǎn)染真核細胞的轉(zhuǎn)染技術(shù)也越來越多，其中最常見的是慢病毒感染法和脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染。慢病毒感染法雖可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但其在包裝過程中往往對基因長度有要求，一般要求基因長度在3 kb以下。而TALE技術(shù)則可用于任意目的基因的過表達，所過表達的對象是細胞內(nèi)源性的目的基因，沒有其他修飾和副產(chǎn)物的出現(xiàn)，特別適用于3 kb以上的大基因的過表達?，F(xiàn)代腫瘤學(xué)理論認為，腫瘤的發(fā)生不僅與遺傳學(xué)(genetic)有關(guān)，還與表觀遺傳學(xué)(epigenetics)有關(guān)，而表觀遺傳學(xué)機制中的DNA甲基化是目前研究最多和最清楚的機制之一，也是表觀遺傳修飾中最重要的修飾方式之一[12-13]。 DNA甲基化(DNAmethylation)是通過將S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，并在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5′位置的氫被活性甲基所取代，從而變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)[14-15]。DNMTs主要有DNMT1和DNMT3(DNMT3a和 DNMT3b)家族，而DNMT1是最早發(fā)現(xiàn)，也是哺乳動物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的主要類型。研究表明，外源性DNMT1在鼠和人的成纖維細胞內(nèi)表達后能夠促進細胞轉(zhuǎn)化，包括接觸抑制減少、甲基化水平上升、瘤源性增加以及紡錘體異常；而DNMT1在多種腫瘤中的高表達也成為其作為腫瘤表遺傳治療的重要靶點[16]。

因此，本實驗利用TALE技術(shù)，用TALE-VP64 (VP64是一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)與DNMT1基因啟動子序列結(jié)合以增強DNMT1基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而增加DNMT1基因表達，擬構(gòu)建哈薩克族食管上皮DNMT1高表達細胞株模型。實驗中，以帶有熒光標記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為對照組，實驗結(jié)果顯示，細胞轉(zhuǎn)染效率較高。通過在培養(yǎng)液中加入2μg/mL嘌呤霉素的方法，對轉(zhuǎn)染細胞進行篩選，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的細胞在此培養(yǎng)液中可以存活，而未轉(zhuǎn)染的細胞因不含嘌呤霉素抗性標記則死亡，篩選存活下來的細胞以克隆的方式進行擴大培養(yǎng)。采用qPCR和Western blot方法對各組細胞進行DNMT1基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平的檢測。檢測結(jié)果顯示，WV0133和WV0132質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞DNMT1mRNA和蛋白表達水平均顯著高于正常細胞組(P< 0.01)，其中，WV0132質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞DNMT1mRNA和蛋白表達水平較高。本研究結(jié)果提示，利用TALE技術(shù)成功構(gòu)建了哈薩克族食管上皮DNMT1高表達細胞株，為進一步深入研究食管癌的發(fā)生機制提供了研究工具。

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Constructionof esophageal epithelial cell withhigh DNAmethyltransferase 1 expression

CHEN Yan1，2，ZHANGhuixia2
(1.College ofmedicine, Jiaxing University, Jiaxing 314001, Zhejiang; 2.School of Publichealth, Xinjiangmedical University, Urumqi 830011, Xinjiang, China)

目的： 構(gòu)建哈薩克族食管上皮細胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)高表達細胞株模型。方法：將構(gòu)建的WV0133、WV0132和WV072質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哈薩克族食管上皮細胞，利用嘌呤霉素對DNMT1高表達細胞進行篩選，并通過熒光顯微鏡、實時熒光定量PCR(qPCR)和Western blot法檢測細胞轉(zhuǎn)染情況和目的基因DNMT1的表達情況。結(jié)果：WV0133 和WV0132質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞DNMT1mRNA表達水平是正常細胞組的1.786倍和2.721倍，DNMT1蛋白表達水平是正常細胞組的2.734倍和3.100倍，均顯著高于正常細胞組(P<0.01)。其中，WV0132質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞DNMT1mRNA和蛋白表達水平較高。結(jié)論：成功構(gòu)建了哈薩克族食管上皮DNMT1高表達細胞株模型，為深入研究食管癌的發(fā)生機制提供了研究工具。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1；食管上皮細胞；哈薩克族；TALE技術(shù)

OBJECTIVE:To construct esophageal epithelial cells which expresshigh levels of DNAmethyltransferase 1 (DNMT1).METHODS：Plasmids WV0133，WV0132 and WV0132 were constructed and transfected into esophageal epithelial cells.Transfectionof the cells was observed under the inverted fluorescencemicroscope.Cells that expressedhigh levels of DNMT1 were selected by puromycin.Expressions of DNMT1mRNA and protein were determined by using quantitative real-time PCR and Western blot. RESULTS：Compared with the normal cell group， themRNA expression levels were 1.786 times and 2.721 timesin the WV0133- and WV0132-transfected cells，respectively，and their protein expression levels were 2.734 times and 3.100 times，respectively.They were significantlyhigher than those in the normal cell group (P<0.01).CONCLUSION：An esophageal epithelial cell line which expressedhigh levels of DNMT1 was successfully constructed.The cell line can be a valuable tool to studymechanisms for esophageal cancer development.

DNAmethyltransferase 1；esophageal epithelial cell；Kazakh；TALEs

Q7；R73-35+4

A

1004-616X(2016)06-0428-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.003

2016-08-28；

2016-10-13

國家自然科學(xué)基金(81460502)

作者信息： 陳 艷，E-mail：ychen88@sina.com