韓利蓉，宋江勤，郭飛波

(天門市第一人民醫(yī)院，湖北天門431700)

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PNPLA3基因I148M多態(tài)性對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期及Cyclin D1、p53表達(dá)的影響

韓利蓉，宋江勤，郭飛波

(天門市第一人民醫(yī)院，湖北天門431700)

目的 探討含patatin樣磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)基因I148M多態(tài)性對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期及Cyclin D1、p53表達(dá)的影響。方法 構(gòu)建PNPLA3基因I148M突變型(突變組)、PNPLA3基因I148M野生型(野生組)的肝癌細(xì)胞HepG2，以空載體細(xì)胞作為對(duì)照組，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期，Western blotting、熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞Cyclin D1、p53蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果 突變組G1期細(xì)胞所占比例明顯低于野生組和對(duì)照組，S、G2/M期細(xì)胞所占比例明顯高于野生組和對(duì)照組(P均<0.05)；野生組與對(duì)照組G1、S、G2/M期細(xì)胞所占比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。三組間Cyclin D1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，突變組p53蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生組和對(duì)照組(P均<0.05)，而野生組和對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 PNPLA3基因I148M多態(tài)性能夠誘導(dǎo)p53過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致肝細(xì)胞周期紊亂，最終發(fā)展成肝癌細(xì)胞。

肝癌；含patatin樣磷脂酶域蛋白3；基因多態(tài)性；細(xì)胞周期；細(xì)胞周期蛋白D1；p53

國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)，細(xì)胞周期阻滯與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1，2]。含patatin樣磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)屬于PNPLA家族成員之一，與傳統(tǒng)激素敏感性脂肪酶相比，PNPLA家族成員N末端均有一個(gè)patatin區(qū)域，使得其在體內(nèi)外均具有脂肪合成和分解功能，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝的主要基因之一[3～6]。Rametta等[7]對(duì)人類染色體上PNPLA3基因分析發(fā)現(xiàn)，I148M多態(tài)性位點(diǎn)與肝臟脂肪含量升高有關(guān)。Hoekstra等[8]研究亦證實(shí)，PNPLA3基因I148M多態(tài)性與肝纖維化有關(guān)，且是肝癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由于脂肪代謝紊亂是多種肝病甚至肝癌的發(fā)病基礎(chǔ)，推測(cè)PNPLA3基因I148M多態(tài)性可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。2014年7月～2015年4月，我們觀察了PNPLA3基因I148M多態(tài)性對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期及Cyclin D1、p53表達(dá)的影響。現(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2和PNPLA3基因I148M突變型、PNPLA3基因I148M野生型、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腺病毒，均購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、SDS-PAGE電泳分離蛋白均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；β-actin抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(羊抗鼠IgG抗體)、Cyclin D1單克隆抗體、p53單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司；Cyclin D1、p53、β-actin引物由美國(guó)金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)。ABI GeneAmp 9700 PCR儀、Odyssey成像系統(tǒng)及圖像分析軟件購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染 取人肝癌細(xì)胞株HepG2置于DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)3天，待細(xì)胞融合≥80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL消化，吸棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，混勻后加入新鮮培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔約2×105個(gè)，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。胰蛋白酶-EDTA消化后，加入RPMI 1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，分別加入含有PNPLA3基因I148M突變型腺病毒(突變組)、PNPLA3基因I148M野生型腺病毒(野生組)和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腺病毒(對(duì)照組)3×107IU。轉(zhuǎn)染24 h，加入聚凝胺使培養(yǎng)體系終濃度為6 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。以倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)綠色熒光作為轉(zhuǎn)染成功的標(biāo)志。

1.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，PBS沖洗2次，移液槍吹打成細(xì)胞懸液并置于離心管中，室溫下1 000 r/min離心10 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加中性乙醇1 mL，4 ℃固定過(guò)夜。24 h后，室溫下1 000 r/min離心10 min，PBS沖洗5 min×3次，吹打或細(xì)胞成懸液，加入適量碘化丙啶(PI，預(yù)先用PBS配制成1 mg/mL)和RNase，使其終濃度為50 mg/L，置于水浴鍋上37 ℃溫浴45 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，每次5×104個(gè)細(xì)胞。重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.4 PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白檢測(cè) 采用Western blotting技術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，接種于6孔板，每孔加入含1% PMSF的細(xì)胞裂解液100 μL，待細(xì)胞完全裂解后，15 000 r/min離心5 min，留取上清液。將上清液移至EP管中，加入等量上樣液，100 ℃煮沸5 min，使蛋白完全變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，100 mA、40 min電轉(zhuǎn)后將PVDF膜取出。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶2 000稀釋的PNPLA3單克隆抗體、1∶1 000稀釋的Cyclin D1單克隆抗體和1∶500稀釋的p53單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS沖洗3次，加入1∶10 000稀釋的二抗，室溫下震蕩3 h，PBS沖洗3次；熒光圖像掃描及條帶灰度值分析。PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白相對(duì)表對(duì)量為樣本條帶與β-actin條帶灰度值之比。

1.5 PNPLA3、Cyclin D1、p53 mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR技術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增：PNPLA3上游引物：5′-CGGAAGACTGTGTCGAGCAA-3′，下游引物：5′-GGATCAAGCGCACTGTGGA-3′；Cyclin D1上游引物：5′-CCGTGTGCTAGCATAGCGC-3′，下游引物：5′-TGCTGGTCAATGTGGCTA-3′；p53上游引物： 5′-GACGTT-

CGGTGTCAGTCTGCC-3′，下游引物：5′-TGGCTGCGACTACATTAGGAC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGCATGCTCGGCTGCGTCT-3′，下游引物：5′-GGTCTGAGGTTCAGCGTTGC-3′。PNPLA3擴(kuò)增條件：96 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min；Cyclin D1擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。p53擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。記錄各檢測(cè)指標(biāo)的CT值，重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算PNPLA3、Cyclin D1、p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞情況 攜帶不同基因型的腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高達(dá)90%，說(shuō)明表達(dá)目的基因的細(xì)胞株構(gòu)建成功。見插頁(yè)Ⅲ圖9。

2.2 各組細(xì)胞周期分布比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞周期分布比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與野生組比較，#P<0.05。

2.3 各組PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白及mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 各組PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與野生組比較，#P<0.05。

3 討論

PNPLA3基因?qū)儆趐atatin樣磷脂酶家族成員，具有非特異性水解酶的活性。PNPLA3基因多態(tài)性與人類非酒精性脂肪肝的遺傳易感性密切相關(guān)。近年研究顯示，PNPLA3基因多態(tài)性與多種肝臟疾病密切相關(guān)，其中I148M位點(diǎn)的多態(tài)性與肝臟脂肪含量顯著升高有關(guān)[9]。由于這種脂肪升高不受遺傳、體質(zhì)量、原發(fā)病和乙醇攝入的影響，故有學(xué)者認(rèn)為PNPLA3基因I148M多態(tài)性可能是導(dǎo)致肝臟病變的主要原因[10]。國(guó)外研究證實(shí)，PNPLA3基因I148M多態(tài)性不僅會(huì)增加肝臟脂肪含量，而且與肝臟組織學(xué)病變有關(guān)[11]。Pirazzi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3基因I148M多態(tài)性與肝纖維化有關(guān)，并可能參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生。關(guān)于PNPLA3基因I148M多態(tài)性誘導(dǎo)肝臟病變的機(jī)制目前尚不清楚，但可以肯定的是與脂肪代謝有關(guān)。Burza等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3蛋白能夠水解TG，其I148M位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致水解酶的活性喪失，證實(shí)I148M多態(tài)性可能通過(guò)抑制PNPLA3的活性而導(dǎo)致TG分解受阻，而TG蓄積極易導(dǎo)致肝臟脂肪含量增加。對(duì)PNPLA3蛋白三維結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，其148位點(diǎn)氨基酸更換并未改變活性中心和空間結(jié)構(gòu)，而是蛋氨酸的側(cè)臂遮蓋了活性中心與底物的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酶對(duì)TG水解活性降低[14]。但Valenti等[15]對(duì)小鼠PNPLA3基因敲除后并未獲得小鼠脂肪肝模型，也未對(duì)小鼠體內(nèi)TG的代謝造成影響。上述研究結(jié)果均提示PNPLA3基因I148M多態(tài)性對(duì)肝臟病變的影響作用機(jī)制較為復(fù)雜，需要深入研究。

細(xì)胞周期紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量和物質(zhì)代謝異常，最終引起細(xì)胞惡變[16，17]。Romeo等[18]認(rèn)為，肝癌細(xì)胞周期明顯異常，鉑類等抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)制就是改變腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞周期主要有G1、S、G2、M期，其中G1/S期和G2/M期在維持細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)方面最為重要。當(dāng)細(xì)胞通過(guò)G1/S期和G2/M期后，則無(wú)需依賴外界的分裂信號(hào)，能獨(dú)立完成細(xì)胞周期[19]。因此G1/S期和G2/M期被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)期。Cyclin D1、p53均屬于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，Cyclin D1是由人類CCND1基因所編碼的一類蛋白質(zhì)，其可通過(guò)結(jié)合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，磷酸化G1期周期抑制蛋白(Rb)，而磷酸化的Rb從其所結(jié)合的E2F轉(zhuǎn)錄因子上解離，從而推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入到S期。p53基因是細(xì)胞生長(zhǎng)周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能有關(guān)。Cyclin D1、p53是參與調(diào)節(jié)G1/S期、G2/M期最主要的蛋白，Cyclin D1、p53表達(dá)失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Valenti等[20]研究證實(shí)，肝癌組織Cyclin D1、p53蛋白表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，隨著治療的好轉(zhuǎn)，肝癌組織Cyclin D1、p53蛋白表達(dá)量逐漸降低。本研究結(jié)果顯示，突變組p53 mRNA及蛋白表達(dá)量均高于野生組和對(duì)照組，提示PNPLA3基因多態(tài)性可能通過(guò)影響肝癌細(xì)胞p53表達(dá)，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，突變組G1期細(xì)胞所占比例低于野生組和對(duì)照組，S、G2/M期細(xì)胞所占比例高于野生組和對(duì)照組，提示I148M多態(tài)性可能與細(xì)胞周期紊亂有關(guān)。Sookoian等[21]研究證實(shí)，肝細(xì)胞周期加速后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝異常，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且細(xì)胞周期的加速與肝癌細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，突變組p53 mRNA蛋白相對(duì)表達(dá)量高于野生組和對(duì)照組，而三組細(xì)胞Cyclin D1蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PNPLA3基因I148M多態(tài)性可能通過(guò)上調(diào)p53表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，并促使其向肝癌發(fā)展。

綜上所述，PNPLA3基因I148M多態(tài)性能夠誘導(dǎo)p53過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致肝細(xì)胞周期紊亂，最終發(fā)展為肝癌細(xì)胞。

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