符策君，張小波，李權

(海南省人民醫(yī)院，?？?70311)

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先天性巨結腸病變腸段CAD、S-100蛋白表達及其臨床意義

符策君，張小波，李權

(海南省人民醫(yī)院，?？?70311)

目的 探討組織蛋白酶D(CAD)、S-100蛋白在先天性巨結腸(HD)發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作用機制。方法 選擇HD患兒41例(HD組)，分別取病變腸段的狹窄段、移行段、擴張段；另取10例因腸穿孔或腸梗阻行結腸造瘺術患兒的病變結腸組織(對照組)。免疫組化染色后，觀察兩組病變腸段CAD、S-100蛋白陽性表達，并比較兩組肌間神經(jīng)從、成熟神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量。結果 HD組狹窄段和移行段CAD陽性表達率明顯低于對照組，移行段和擴張段S-100蛋白陽性表達率明顯低于對照組(P均<0.05)。對照組神經(jīng)纖維、神經(jīng)膠質細胞可見S-100蛋白陽性表達，而神經(jīng)節(jié)細胞未見S-100蛋白陽性表達；神經(jīng)節(jié)細胞可見CAD陽性表達，細胞形態(tài)規(guī)則，核仁明顯；另有少量細胞形態(tài)不規(guī)則，缺乏核仁。HD組各段肌間神經(jīng)叢、成熟神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)明顯低于對照組(P均<0.05)。結論 CAD、S-100蛋白表達降低可促進HD的發(fā)生、發(fā)展；其機制可能與病變腸段神經(jīng)節(jié)及間質神經(jīng)纖維數(shù)量減少有關。

先天性巨結腸；組織蛋白酶D；S-100蛋白

先天性巨結腸(HD)是由于結腸黏膜及黏膜下括約肌神經(jīng)叢缺乏神經(jīng)節(jié)細胞或神經(jīng)節(jié)細胞功能減退，導致腸管持續(xù)痙攣，糞便淤滯于近端結腸，繼而近端結腸肥厚、擴張，是小兒常見的先天性腸道疾病之一[1，2]。其病因及發(fā)病機制目前尚未完全清楚[3]。一般認為，細胞外基質異常表達及神經(jīng)節(jié)脊細胞的無功能遷移可能是導致HD的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶D(CAD)和S-100蛋白可誘導細胞外基質的分化不良，導致神經(jīng)節(jié)細胞的功能異常[4]。本研究探討CAD和S-100蛋白在HD發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2007年2月～2015年5月我院收治的HD患兒41例(HD組)，男28例、女13例，年齡5個月～4歲、平均1.52歲，體質量4.5～18.7 kg、平均11.8 kg，身高51.4～120.6 cm、平均71.3 cm，均為足月兒。均經(jīng)X線鋇灌腸、直腸黏膜活檢等檢查明確診斷。排除合并其他消化道畸形。41例患兒均行巨結腸根治術。術中每例患兒切除腸管17～31 cm、平均25.0 cm，其中狹窄段平均10.24 cm、移行段平均5.01 cm、擴張段平均7.82 cm。對照組為10例同期因腸穿孔或腸梗阻行結腸造瘺術患兒，男7例、女3例，年齡5個月～4歲、平均1.47歲，體質量4.7～17.9 kg、平均11.6 kg，身高51.3～118.6 cm、平均73.1 cm，均為足月兒。術中取其病變結腸組織。兩組性別、年齡、體質量、身高等具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患兒家屬均知情同意。

1.2 相關指標觀察

1.2.1 病變結腸組織CAD、S-100蛋白表達 采用免疫組化染色法。取兩組手術切除的結腸組織標本(HD組分別取狹窄段、移行段、擴張段腸組織)，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖新，PBS浸泡5 min，3% H2O2室溫孵育5 min，去離子水沖洗3 min×3次；10%牛奶蛋白(1 g蛋白+100 mL純水)封閉，室溫孵育5 min，滴加CAD或S-100蛋白抗體(鼠來源)，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次；滴加HRP標記的二抗(兔來源)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加NBT/BCIP顯色劑顯色5 min，復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下拍照觀察。結果判定：CAD陽性染色定位于神經(jīng)節(jié)細胞胞質，呈棕黃色顆粒。S-100蛋白陽性染色定位于神經(jīng)纖維細胞，呈棕黃色顆粒。隨機取一張切片，低倍鏡(×100)下計數(shù)陽性染色細胞及細胞總數(shù)，陽性細胞所占比例<25%為陰性，≥25%～<50%為弱陽性，≥50%～<75%為陽性，≥75%為強陽性。陽性細胞所占比例≥25%即為陽性表達。

1.2.2 腸壁肌間神經(jīng)叢及成熟神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量 每張S-100蛋白染色切片于低倍鏡(×100)下隨機選取10個視野，觀察肌間神經(jīng)叢數(shù)。每張CAD染色切片于高倍鏡(×400)下隨機選取20個肌間神經(jīng)叢，觀察叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)，區(qū)分成熟和未成熟神經(jīng)節(jié)細胞(細胞形態(tài)規(guī)則、有明顯核仁即可判斷為成熟神經(jīng)節(jié)細胞)。

2 結果

2.1 兩組結腸組織CAD、S-100蛋白陽性表達比較 見表1。對照組神經(jīng)纖維、神經(jīng)膠質細胞S-100蛋白陽性表達，而神經(jīng)節(jié)細胞未見S-100蛋白陽性表達，黏膜下、肌間可有大量深染的神經(jīng)叢，尤以肌間最多，叢內(nèi)有典型的細胞狀“空白”區(qū)。神經(jīng)節(jié)細胞CAD陽性表達，細胞形態(tài)規(guī)則，核仁明顯，胞質內(nèi)見棕黃色顆粒，另有少量陽性細胞形態(tài)不規(guī)則，核仁不明顯。HD組狹窄段神經(jīng)纖維、神經(jīng)膠質細胞S-100蛋白陽性表達，鏡下可見神經(jīng)纖維細胞肥大，染色呈深褐色，神經(jīng)叢內(nèi)缺乏典型的細胞狀“空白”區(qū)；HD組移行段神經(jīng)纖維細胞增粗，染色相對較淺，偶可見神經(jīng)叢內(nèi)細胞狀“空白”區(qū)，但多不典型；HD組擴張段神經(jīng)纖維細胞形態(tài)逐漸恢復正常，染色淺，鏡下可見典型的細胞狀“空白”區(qū)。HD組狹窄段肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞缺失，未見CAD陽性表達細胞；HD組移行段可見少量CAD陽性表達細胞，多位于黏膜下神經(jīng)叢內(nèi)，多數(shù)細胞形態(tài)偏小、無核仁；HD組擴張段鏡下可見正常腸壁結構，神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞胞質呈陽性反應，CAD陽性細胞形態(tài)規(guī)則、核仁明顯。

表1 兩組CAD、S-100蛋白陽性表達比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組腸壁肌間神經(jīng)叢及成熟神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量比較 見表2。

表2 兩組腸壁肌間神經(jīng)叢及成熟神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

HD為一組良性增生性疾病，可導致患兒出現(xiàn)頑固性腹脹、便秘以及腸道營養(yǎng)吸收障礙引起的營養(yǎng)不良性發(fā)育遲緩，部分患兒可因腸液大量聚集、腸道正常菌群失調以及部分微生物分泌的細胞外毒素侵襲腸壁，可伴發(fā)小腸結腸炎[4]。Swenson或Soave手術為HD的常用術式且療效較好。但楊小進等[5]研究發(fā)現(xiàn)，約25%的患兒術后仍然出現(xiàn)明顯的便秘或腹瀉癥狀。尚卿等[6]研究認為，部分HD病灶的殘留及其對周邊正常腸道黏膜下神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)的慢性侵襲性影響可能是導致其臨床癥狀復發(fā)的原因。

CAD主要表達于腦、脊髓等部分神經(jīng)元細胞，其在神經(jīng)節(jié)細胞核周邊及胞質內(nèi)的聚集程度可影響神經(jīng)節(jié)細胞的分化成熟程度[7]。S-100蛋白的天冬氨酸殘基末端磷酸化可影響腸道自主神經(jīng)節(jié)的電沖動傳遞。二者可能參與HD的發(fā)生、發(fā)展，同時其異常表達可為HD診斷提供一定參考。此外，S-100蛋白還可誘導腸道黏膜皺襞中神經(jīng)節(jié)細胞的缺失。有研究證實，在炎癥、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等組織中CAD、S-100異常表達，并與患者遠期預后有一定關系[8]。但二者在HD中的研究目前相對較少，且相關研究的樣本量較少、臨床資料偏移較為嚴重。

本研究結果顯示，HD組狹窄段和移行段CAD陽性表達率明顯低于對照組，表明CAD低表達可促進HD的發(fā)生、發(fā)展；原因可能為CAD表達降低失去了對神經(jīng)節(jié)鞘膜細胞在分化、成熟中保護作用。HD組移行段和擴張段S-100蛋白陽性表達率明顯低于對照組，提示S-100蛋白低表達在促進HD發(fā)生過程中可能具有一定作用。但本研究并未發(fā)現(xiàn)HD組狹窄段S-100蛋白陽性表達與對照組的差異，可能與樣本量不足、臨床資料納入及檢測方法不統(tǒng)一等有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，對照組S-100蛋白陽性表達于神經(jīng)纖維、神經(jīng)膠質細胞，黏膜下、肌間可有大量深染的神經(jīng)叢，尤以肌間最多，叢內(nèi)有典型的細胞狀“空白”區(qū)；而神經(jīng)節(jié)細胞可見CAD陽性表達，呈棕黃色顆粒，二者陽性表達定位不同可用于區(qū)分神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)纖維細胞[9，10]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，HD組病變腸段神經(jīng)纖維細胞肥大，染色呈深褐色，神經(jīng)叢內(nèi)缺乏典型的細胞狀“空白”區(qū)，提示神經(jīng)節(jié)細胞缺乏的同時往往伴隨明顯的神經(jīng)纖維增粗等代償性改變。HD組各段肌間神經(jīng)叢、成熟神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)明顯低于對照組，表明成熟神經(jīng)節(jié)或神經(jīng)叢的數(shù)目異?？赡苁菍е翲D發(fā)生的核心因素，但仍需進一步研究證實。提示臨床手術過程中擴大HD病變腸段切除范圍能減少術后便秘或腹瀉的發(fā)生[11～16]。

綜上所述，CAD、S-100蛋白表達降低可促進HD的發(fā)生、發(fā)展；其機制可能與病變腸段神經(jīng)節(jié)及間質神經(jīng)纖維數(shù)量減少有關。

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