張育，杜乃東，劉巖

(天津市北辰醫(yī)院，天津300400)

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Hsp70對糖氧剝奪誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活、凋亡及分泌炎癥因子的影響

張育，杜乃東，劉巖

(天津市北辰醫(yī)院，天津300400)

目的 探討熱激活蛋白70(Hsp70)對糖氧剝奪(OGD)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活、凋亡及分泌炎癥因子的影響。方法 分離培養(yǎng)小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為對照組、OGD組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-Hsp70組。對照組常規(guī)培養(yǎng)；其余三組行OGD處理。OGD處理24 h，pcDNA3.1組加入pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h，pcDNA3.1-Hsp70組加入pcDNA3.1-Hsp70重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。采用MTT法檢測各組星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Western blotting法檢測Hsp70、NF-κB p65蛋白表達(dá)。取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA法檢測MMP-9、IL-1β、TNF-α水平。結(jié)果 與對照組比較，其余三組細(xì)胞存活率明顯降低、細(xì)胞凋亡率明顯升高(P均<0.05)，炎癥因子MMP-9、TNF-α、IL-1β水平亦明顯升高(P均<0.05)，Hsp70、NF-κB p65蛋白表達(dá)亦明顯上調(diào)(P均<0.05)。OGD組與pcDNA3.1組上述各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與OGD組比較，pcDNA3.1-Hsp70組細(xì)胞存活率明顯升高、細(xì)胞凋亡率明顯降低，各炎癥因子水平明顯降低，Hsp70表達(dá)升高，NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)。結(jié)論 Hsp70過表達(dá)能促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與激活NF-κB信號通路、抑制OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

腦缺血；星形膠質(zhì)細(xì)胞；熱激活蛋白70；NF-κB信號通路；炎癥因子；小鼠

熱激活蛋白70(Hsp70)是熱休克蛋白家族成員之一，在腦缺血過程中發(fā)揮分子伴侶功能，具有增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞活性的作用[1,2]。有研究顯示，腦組織過表達(dá)Hsp70可抑制腦缺血及神經(jīng)毒性損害[3,4]，但其具體機(jī)制尚不十分清楚。2014年2月～2015年3月，我們觀察了Hsp70對糖氧剝奪(OGD)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活、凋亡及分泌炎癥因子的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 ICR小鼠12只，雌雄各半，1～3日齡，體質(zhì)量5～7 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2009-0003。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)，酶標(biāo)儀(奧地利Biocell公司)，F(xiàn)ACS Calibur Flow Cytometer型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，SDS-PAGE垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)，96孔培養(yǎng)板(美國Costar公司)。pcDNA3.1質(zhì)粒(美國Invitrogen公司)，pcDNA3.1-Hsp70重組質(zhì)粒(本課題組前期構(gòu)建)。FBS、MEM培養(yǎng)基及HRP-IgG、MTT、DMSO和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，Hsp70抗體、NF-κB抗體、β-actin抗體(英國Abcam公司)，RIPA細(xì)胞蛋白裂解液(上?？浦律锟萍加邢薰?，BCA總蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司)，瓊脂糖(法國BioWest公司)，RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒(德國TIANGEN公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq酶和dNTP(日本TaKaRa公司)，馬血清(美國Hyclone公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 處死ICR小鼠，分離大腦皮質(zhì)，去除中腦、海馬及腦膜等結(jié)構(gòu)，獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞，依據(jù)文獻(xiàn)[5]進(jìn)行純化培養(yǎng)后接種于96孔板，每孔4×104個。隨機(jī)將細(xì)胞分為對照組、OGD組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-Hsp70組。對照組常規(guī)培養(yǎng)；其余三組行OGD處理[6]：37 ℃、無氧、無糖環(huán)境中培養(yǎng)6 h，轉(zhuǎn)移至含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并給予5.5 mmol/L葡萄糖灌注，常規(guī)氧氣供應(yīng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。pcDNA3.1組OGD處理24 h加入pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h；pcDNA3.1-Hsp70組OGD處理24 h加入pcDNA3.1-Hsp70重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 細(xì)胞存活率 采用MTT法。取上述方法處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞，接種于96孔板，每孔4×104個。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，孵育4 h；加入DMSO 200 μL，震蕩20 min，使甲瓚完全溶解。采用酶標(biāo)儀測定570 nm處光密度(OD)值。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD-空白孔OD)/(對照孔OD-空白孔OD)×100%。

1.3.2 細(xì)胞凋亡率 取上述方法處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞，接種于96孔板，每孔1×105個。采用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入結(jié)合液195 μL， Annexin V/FITC 5 μL室溫避光孵育10 min，收集細(xì)胞，加入碘化丙啶染色液，采用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒觀察細(xì)胞凋亡情況。計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液炎癥因子水平 收集上述方法處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清，1 000 r/min離心5 min，去除細(xì)胞碎片。采用ELISA法檢測MMP-9、IL-1β、TNF-α水平。所有操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 NF-κB p65蛋白、Hsp70蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。取上述方法處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。加入兔抗鼠Hsp70多克隆抗體室溫孵育2 h，HRP-IgG室溫孵育2 h，DAB顯色，暗室曝光。采用Quantity One(Bio-Rad)軟件對Western blotting條帶密度進(jìn)行掃描，計(jì)算目的條帶的積分光密度(IOD)值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率及凋亡率比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率及凋亡率比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與OGD組比較，#P<0.05；與pcDNA3.1組比較，△P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-9、TNF-α、IL-1β水平比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-9、TNF-α、IL-1β水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與OGD組比較，#P<0.05；與pcDNA3.1組比較，△P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞NF-κB p65、Hsp70蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組細(xì)胞NF-κB p65、Hsp70蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與OGD組比較，#P<0.05；與pcDNA3.1組比較，△P<0.05。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞指廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)、除神經(jīng)元以外的所有細(xì)胞，具有支持、滋養(yǎng)神經(jīng)元的功能[7，8]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是最大的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，不僅參與腦部正常功能的發(fā)揮，還參與腦部的許多病理性變化，如腦卒中[9]。有研究報(bào)道，在缺血性腦卒中模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞可作為一種炎癥細(xì)胞[10]，分泌膠質(zhì)纖維酸性蛋白、主要組織相容性復(fù)合體、共刺激分子等炎癥因子[11～13]；還能參與Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)。

Hsp70具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能，可抑制腦缺血及神經(jīng)毒性對神經(jīng)細(xì)胞的損害。有研究表明，Hsp70保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能可能通過調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)[14～16]。因此推測，Hsp70可能對缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。

本研究以星形膠質(zhì)細(xì)胞為模型，OGD處理構(gòu)建體外腦缺血模型，采用pcDNA3.1載體過表達(dá)Hsp70，觀察Hsp70對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用以及抗炎作用。結(jié)果表明，pcDNA3.1-Hsp70組細(xì)胞存活率明顯高于OGD組，細(xì)胞凋亡率明顯低于OGD組，證實(shí)Hsp70對缺血性損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用；pcDNA3.1-Hsp70組MMP-9、TNF-α、IL-1β水平顯著低于OGD組，說明Hsp70可顯著抑制OGD誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對缺血性腦卒中具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制MMP-9、IL-1β及TNF-α分泌有關(guān)。NF-κB復(fù)合體包括p65和p50兩個亞基，NF-κB p65在神經(jīng)細(xì)胞的病理生理過程中具有重要作用[17，18]。本研究結(jié)果顯示，OGD組NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著高于對照組，而pcDNA3.1-Hsp70組NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著低于OGD組，表明Hsp70過表達(dá)可抑制OGD誘導(dǎo)的NF-κB信號通路激活。證實(shí)Hsp70在OGD細(xì)胞模型中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)Hsp70可抑制OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，Hsp70過表達(dá)能夠促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，在腦缺血過程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有可能成為腦缺血性疾病診斷和治療的靶標(biāo)。

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