徐志彬，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

?

食管癌前病變組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞的形態(tài)變化及生物學(xué)特征

徐志彬，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

目的 觀察食管癌前病變組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞(AFs)的形態(tài)變化及生物學(xué)特征。方法 取食管癌組織、食管癌前病變組織、正常食管組織，采用膠原酶消化法制備食管癌組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞(CAFs)、AFs、正常食管組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NFs)，傳代培養(yǎng)。觀察3種細(xì)胞的表面形態(tài)，免疫組化染色后觀察其免疫表型[角蛋白(CK)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)]，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果 AFs的表面形態(tài)介于NFs和CAFs。3種細(xì)胞的CK表達(dá)均為陰性，Vimentin表達(dá)均為陽性。NFs α-SMA表達(dá)陰性，AFs、CAFs α-SMA表達(dá)均為陽性。AFs的增殖能力及細(xì)胞周期各期細(xì)胞所占比例亦介于NFs和CAFs。結(jié)論 AFs可能是NFs向CAFs轉(zhuǎn)化的中間過渡階段，其表面結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性不同于NFs，與CAFs極其相似。

食管癌前病變；間質(zhì)成纖維細(xì)胞；細(xì)胞形態(tài)；生物學(xué)特征

以往對(duì)食管癌的研究主要以癌細(xì)胞為基礎(chǔ)，而對(duì)癌細(xì)胞所處的間質(zhì)微環(huán)境未引起足夠重視。食管癌組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞(CAFs)不僅參與食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲[1～6]，在食管癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中亦扮演重要角色[7]。食管正常鱗狀上皮向鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)變的過程中有一個(gè)中間過渡階段——鱗狀上皮不典型增生階段，而在正常食管組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NFs)向CAFs轉(zhuǎn)變的過程中是否也存在不典型增生階段鮮見報(bào)道。本研究觀察食管癌前病變組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞(AFs)的形態(tài)變化及生物學(xué)特征。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2015～2016年我院手術(shù)切除的食管癌組織、食管癌前病變組織、正常食管組織各10例份。10例食管癌患者術(shù)前均未行放化療，術(shù)后組織病理檢查證實(shí)為低分化鱗狀細(xì)胞癌。食管癌前病變組織取自行內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)或黏膜剝離術(shù)患者，組織病理檢查證實(shí)為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；正常食管組織取自賁門癌患者癌旁正常鱗狀上皮組織。FBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；膠原酶Ⅱ購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜、四氮唑藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鼠抗人角蛋白(CK)單克隆抗體、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體、鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體購(gòu)自北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 ①膠原酶Ⅱ消化：將剪好的組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入適量0.1%的膠原酶Ⅱ，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中消化，直至在顯微鏡下觀察到細(xì)胞團(tuán)或獨(dú)立的細(xì)胞后終止消化。收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。吸取部分細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶中，加入適量新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3天換液一次，直到細(xì)胞基本爬滿瓶底。②細(xì)胞傳代：待細(xì)胞基本爬滿瓶底，向培養(yǎng)瓶中加入適量胰蛋白酶-EDTA混合液消化1 min，于倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間縫隙增大，終止消化，用吸管反復(fù)吹打瓶底，收集細(xì)胞。③胰蛋白酶純化：取部分細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。吸取部分細(xì)胞懸液接種于新鮮培養(yǎng)瓶中，加入適量0.25%的胰蛋白酶，顯微鏡下觀察1～2 min，至成纖維細(xì)胞變圓、部分脫壁終止消化，用吸管輕輕吹打成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域，收集吹打下來的細(xì)胞，常規(guī)傳代培養(yǎng)。④細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行消化，并收集于離心管中，取新鮮配制的細(xì)胞凍存液，逐滴加入離心管中，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞均勻，細(xì)胞密度為(3～4)×106個(gè)/mL。將細(xì)胞分裝于塑料凍存管。將凍存管置于4 ℃冰箱2 h，轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱4 h，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)前取出凍存管，迅速放入37 ℃水浴鍋中，1 min內(nèi)使其完全融化，取出細(xì)胞，離心棄上清，加入新的培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，置于溫箱中培養(yǎng)，次日換液。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 將純化后的貼壁細(xì)胞直接置于倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞大體形態(tài)。取純化后的第3代細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，孵育1～2天。鏡下觀察細(xì)胞基本爬滿后，常規(guī)清洗，95%乙醇固定20 min，晾干，4 ℃保存?zhèn)溆?。將制作好的?xì)胞爬片固定于載玻片上，向細(xì)胞爬片滴加1 mL瑞氏-吉姆薩染液，2 min后觀察到有細(xì)胞著色，棄去染液，用D-Hanks液清洗干凈，光鏡下觀察細(xì)胞著色情況。收集純化后的第4代細(xì)胞，取細(xì)胞(1～2)×107個(gè)，常規(guī)消化洗滌后，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，1 500 r/min離心8 min，用吸管輕輕吸取上清液，沿離心管側(cè)壁輕輕加入2.5%戊二醛固定液1 mL，置于4 ℃冰箱固定4 h，磷酸鹽緩沖液清洗15 min×3次，1%四氧化鋨1～2 h，4 ℃冰箱保存。磷酸鹽緩沖液清洗15 min×3次，梯度丙酮脫水，100%丙酮∶包埋液=1∶3 37 ℃過夜，用包埋劑將樣品包埋在膠囊或包埋板里，置入烤箱，37 ℃ 24 h，然后用超薄切片機(jī)將樣品切成厚約50 nm的切片，醋酸雙氧鈾染色30～45 min，檸檬酸鉛染色5～30 min，透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 細(xì)胞免疫表型鑒定 如上制作細(xì)胞爬片，并將其固定于載玻片上，3% H2O2室溫孵育10 min，PBS液漂洗5 min×3次，用含10%牛血清封閉液封閉30 min，棄去封閉液，加入一抗(CK或Vimentin或α-SMA)，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，滴加二抗，濕盒中孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色，室溫反應(yīng)10 min，蒸餾水漂洗1 min×2次，蘇木素復(fù)染1 min，自來水洗10 min，95%乙醇脫水1～2 s，中性樹膠封片，光鏡下觀察CK、Vimentin、α-SMA表達(dá)。

1.5 細(xì)胞生物學(xué)特征檢測(cè)

1.5.1 細(xì)胞生長(zhǎng)情況 采用四氮唑藍(lán)比色法(MTT法)。取NFs、AFs、CAFs各4×103個(gè)，分別接種于96孔板中，每孔200 μL。每隔24 h向其中3孔加入MTT液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h終止培養(yǎng)，其余各孔繼續(xù)培養(yǎng)，每日測(cè)3孔，連續(xù)測(cè)7天。設(shè)立與實(shí)驗(yàn)孔條件平行的空白孔，以空白孔調(diào)零，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度(A)值。

1.5.2 細(xì)胞周期 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFs、AFs、CAFs，接種于6孔板中，細(xì)胞密度為4×105個(gè)/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入DNA染液(PI 50 μg/mL，RNA 酶10 μg/mL及1% Triton-X100 1 mL)，4 ℃冰箱中染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 三種細(xì)胞形態(tài)變化 大體形態(tài)可見，NFs、AFs、CAFs培養(yǎng)2～3天即可見細(xì)胞貼壁，7天左右細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，20天左右即可爬滿瓶底。首次傳代與純化后細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，7天左右才能爬滿瓶底，細(xì)胞大部分為成纖維細(xì)胞，呈反射狀或柵欄狀生長(zhǎng)，期間亦有上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)。以后每次傳代與純化后，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，2～3天即可爬滿瓶底，混雜的上皮樣細(xì)胞越來越少，第4代的成纖維細(xì)胞純度即可達(dá)95%。凍存的成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后存活率高，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)無變化。NFs：細(xì)胞間差異小，大小、形狀基本一致，呈扁平長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間界限清楚，單層生長(zhǎng)，存在密度抑制和接觸抑制。AFs：大小、形狀基本一致，排列不整，局部出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)的現(xiàn)象。CAFs：大小、形狀不一，突起多少不定，生長(zhǎng)密集雜亂，重疊生長(zhǎng)，密度抑制和接觸抑制消失。

光鏡下可見，細(xì)胞核呈深紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡粉色。NFs：形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)染色均勻，橢圓形，位于胞質(zhì)中央。AFs：形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)均勻，核大，部分胞核形狀不規(guī)則。CAFs：形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)染色淡，胞核大，圓形，核仁明顯。見插頁Ⅱ圖6。

透射電鏡下可見，NFs：胞核形態(tài)規(guī)則，核大，居中，可見核糖體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞質(zhì)內(nèi)可見散在微絲。AFs：胞核大而明顯，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，微絲呈片狀分布，出現(xiàn)附著斑。CAFs：核大，形態(tài)不規(guī)則，切跡明顯，核仁明顯，胞質(zhì)伸展，突起較多，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器發(fā)達(dá)，可見豐富的核糖體、高爾基體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，微絲密布，局部形成微絲束，成團(tuán)形成附著斑，可見大量微絲和致密斑。見插頁Ⅱ圖7。

2.2 細(xì)胞免疫表型 NFs、AFs、CAFs CK表達(dá)均陰性，Vimentin表達(dá)均陽性。NFs α-SMA表達(dá)陰性，AFs、CAFs α-SMA表達(dá)均陽性。

2.3 細(xì)胞生物學(xué)特征 NFs、AFs和CAFs均呈“S”形生長(zhǎng)曲線，3～5天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，AFs的增殖能力介于NFs和CAFs。見表1。CAFs S期、G0/G1細(xì)胞比例分別為(33.41±1.65)%、(37.96±2.02)%，AFs分別為(32.83±1.47)%、(45.43±2.91)%，NFs分別為(23.74±1.03)%、(51.46±3.74)%。AFs細(xì)胞周期各期細(xì)胞所占比例亦介于NFs和CAFs(P均<0.05)。

表1 三種細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞增殖情況±s)

3 討論

從正常組織到癌前病變，再進(jìn)展至癌組織是一個(gè)漫長(zhǎng)的病理過程，期間不僅瘤體內(nèi)部的變化非常復(fù)雜，癌細(xì)胞所處的間質(zhì)微環(huán)境在癌團(tuán)的刺激下亦在變化，以適應(yīng)癌團(tuán)的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。成纖維細(xì)胞是間質(zhì)微環(huán)境的主要成分，可分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，其功能的活躍狀態(tài)取決于其是否發(fā)生活化[8]。從NFs發(fā)展到活化的CAFs是否存在過渡階段——AFs，AFs是否已先于CAFs發(fā)生活化，以及是否進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為CAFs，目前鮮見報(bào)道。

曾偉偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌前病變組織中不僅上皮組織發(fā)生了異常，相應(yīng)間質(zhì)組織中也出現(xiàn)了活化的間質(zhì)成纖維細(xì)胞，這些表型活化的成纖維細(xì)胞在蛋白分泌功能上也存在差別。本研究結(jié)果顯示，NFs、AFs、CAFs在細(xì)胞表面形態(tài)上無明顯差別及特異性表現(xiàn)，但在內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察中發(fā)現(xiàn)：AFs與CAFs形態(tài)不規(guī)則，胞突多，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體處于活躍狀態(tài)，同時(shí)表現(xiàn)了一些特性，如出現(xiàn)大量附著斑及排列紊亂的微絲。NFs生長(zhǎng)到一定密度后存在接觸抑制現(xiàn)象，但AFs與CAFs不存在密度抑制和接觸抑制現(xiàn)象，可重疊生長(zhǎng)，這一點(diǎn)與NFs明顯不同。CAFs是一組含有平滑肌肌動(dòng)蛋白的成纖維細(xì)胞，在形態(tài)及生物學(xué)行為上同時(shí)具有平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的雙重特性。α-SMA是由肌上皮細(xì)胞表達(dá)的一種細(xì)胞骨架蛋白，是肌成纖維細(xì)胞收縮表型的典型標(biāo)志。本研究CAFs CK陰性、Vimentin陽性、α-SMA陽性，屬VA型，與劉伯新等[10]研究結(jié)果一致；而AFs的免疫表型與CAFs的免疫表型相同，亦屬VA型。關(guān)于AFs培養(yǎng)鑒定的報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)僅見孫艷等[11]對(duì)乳腺癌前病變成纖維細(xì)胞進(jìn)行過鑒定。本研究中，NFs、AFs和CAFs CK表達(dá)均陰性，Vimentin表達(dá)均陽性，而AFs和CAFs α-SMA均陽性，說明AFs和CAFs均保留了成纖維細(xì)胞的特征，同時(shí)兼具平滑肌細(xì)胞的特征。

有研究認(rèn)為，CAFs可與癌細(xì)胞相互作用[12～14]，CAFs通過分泌EGF、TGF-β、IGF等細(xì)胞因子到細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖；反之，癌細(xì)胞分泌TGF-β1和HGF等因子可刺激癌相關(guān)纖維母細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，NFs增殖緩慢，細(xì)胞多停留在G1期；NFs、AFs和CAFs的S期所占百分比依次增高，CAFs在惡性上皮細(xì)胞刺激下，增殖明顯加快，S期細(xì)胞所占比例最高；AFs增殖能力介于NFs和CAFs，這一結(jié)果預(yù)示正常食管鱗狀上皮細(xì)胞、不典型增生上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞對(duì)其鄰近的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的作用是有差別的。

綜上所述，AFs可能是NFs向CAFs轉(zhuǎn)化的中間過渡階段，其免疫表型和生物學(xué)特征更接近于CAFs。

[1] 林靖雯，陳謙明，李勝富,等.口腔癌相關(guān)成纖維細(xì)胞對(duì)舌癌細(xì)胞株增殖活性的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2018，39(2)：184-187.

[2] 單麗輝，張思，翟麗麗，等.癌相關(guān)纖維母細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲活性的影響[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2012，26(2)：97-101.

[3] 李薯霞,于世鳳.口腔黏膜成纖維細(xì)胞對(duì)口腔癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究[J].中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2009，2(3)：150-152.

[4] Taddei ML, Giannoni E, Comito G, et al. Microenvironment and tumor cell plasticity: an easy way out[J]. Cancer Lett, 2013,341(1):80-96.

[5] Ren J, Guo H, Wu H, et al. GPER in CAFs regulates hypoxia-driven breast cancer invasion in a CTGF-dependent manner[J]. Oncol Rep, 2015,33(4):1923-1937.

[6] Gonzalez-Zubeldia I, Dotor J, Redrado M, et al. Co-migration of colon cancer cells and CAFs induced by TGF-β1enhances liver metastasis[J]. Cell Tissue Res, 2015,359(3):829-839.

[7] Catalano V, Turdo A, Di Franco S, et al. Tumor and its microenvironment: a synergistic interplay[J]. Semin Cancer Biol, 2013,23(6 Pt B):522-532.

[8] 王瑞芬,黃坊,孫和國(guó),等.α-SMA和MMP-9在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].診斷病理學(xué)雜志，2013，20(2)：91-93.

[9] 曾偉偉,吳明利,徐志彬,等.食管鱗狀上皮癌變過程中間質(zhì)纖維母細(xì)胞的平滑肌肌動(dòng)蛋白α和CD34表達(dá)及意義[J].臨床薈萃,2011,26(22)：1955-1957.

[10] 劉伯新,張羽捷.食管鱗癌TGF-β1和平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)及臨床意義[J].延邊醫(yī)學(xué)，2014，16(5)：30-32.

[11] 孫艷,彭瓊樂,王黎陽,等.乳腺癌前病變組織原代成纖維細(xì)胞生物學(xué)特征初步研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(1)：16-19.

[12] Ostman A, Augsten M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth-bystanders turning into key players[J]. Curr Opin Genet Dev, 2009,19(1):67-73.

[13] Grugan KD, Miller CG, Yao Y, et al. Fibroblast-secreted hepatocyte growth factor plays a functio nal role in esophageal aquamous cell carcinoma invasion[J]. Proc Nati Acad Sci U S A, 2010,107(24):11026-11031.

[14] 臧茹琨，宋軼鵬，胡立寬，等.食管鱗狀細(xì)胞癌中HGF表達(dá)與腫瘤血管形成的關(guān)系[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27(11)：1189-1193.

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20160656)。

吳明利(E-mail： xzblxh@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.009

R735.1

A

1002-266X(2016)40-0032-03

2015-10-23)