陳思，賈楠，丁明珠，元英進(jìn)

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山梨酮脫氫酶模塊與酮古龍酸桿菌底盤細(xì)胞的適配分析

陳思1,2，賈楠1,2，丁明珠1,2，元英進(jìn)1,2

1 天津大學(xué)化工學(xué)院系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072 2 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072

酮古龍酸桿菌是維生素C二步混菌發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)酸菌。山梨酮脫氫酶 (L-sorbosone dehydrogenase，縮寫為SNDH) 作為維生素C直接前體2-酮基-L-古龍酸 (2-KGA) 合成的關(guān)鍵酶，其作用機(jī)制并不十分清楚。借助全基因組測(cè)序抽提2個(gè)山梨酮脫氫酶基因，分別位于基因組 (縮寫為) 和質(zhì)粒 (縮寫為) 上。通過(guò)工程化改造技術(shù)在工業(yè)產(chǎn)酸菌中構(gòu)建山梨酮脫氫酶功能模塊，比較其對(duì)2-KGA產(chǎn)量的影響。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)對(duì)菌株產(chǎn)酸影響不明顯，過(guò)表達(dá)使菌株明顯產(chǎn)生副產(chǎn)物。將和分別配合輔因子PQQ合成基因，分別構(gòu)建和模塊，得到的工程菌株產(chǎn)酸情況與之前的結(jié)果大致相同。將4株工程菌株分別與內(nèi)生芽孢桿菌混合培養(yǎng)傳代50 d后，分離菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵，其2-KGA的轉(zhuǎn)化率分別提高了15.4%、179%、0.65%和125%。表明混菌適應(yīng)性進(jìn)化策略是一種增加功能模塊與底盤細(xì)胞適配性，進(jìn)而快速獲得優(yōu)良性狀菌種的有效方法。

酮古龍酸桿菌，山梨酮脫氫酶，適配性，適應(yīng)性進(jìn)化，混菌體系

維生素C是維生素類藥中發(fā)展最快、產(chǎn)量最大、用途最廣的品種[1]。我國(guó)VC二步發(fā)酵法由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和北京制藥廠于20世紀(jì)70年代初發(fā)明。第一步由氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇氧化為L(zhǎng)-山梨糖。第二步由酮古龍酸桿菌及伴生菌混合培養(yǎng)將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為VC的前體2-酮基-L-古龍酸 (2-KGA)[2]。作為功能菌完成L-山梨糖到2-KGA的轉(zhuǎn)化，單獨(dú)生長(zhǎng)時(shí)十分緩慢且產(chǎn)酸量很低[3]，伴生菌負(fù)責(zé)輔助產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸。其中，山梨糖/山梨酮脫氫酶能將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨酮，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-KGA。PQQ作為醌酶類輔因子，參與氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)微生物呼吸鏈電子傳遞[4]，同時(shí)PQQ還作為L(zhǎng)-山梨糖/山梨酮脫氫酶的輔因子發(fā)揮重要作用。

作為非模式微生物，其遺傳背景尚不清晰，基因操作的相關(guān)研究有限，糖酸轉(zhuǎn)化的代謝路徑不清晰且相關(guān)酶系的蛋白結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)機(jī)理不明確，限制了對(duì)菌株的工程改造。Cai等[5]利用來(lái)源于乳酸菌的葉酸合成基因簇，彌補(bǔ)了體內(nèi)葉酸代謝路徑的缺乏，提高了細(xì)胞密度和產(chǎn)酸能力。杜瑾等通過(guò)在體內(nèi)組合表達(dá)山梨糖/山梨酮脫氫酶和輔因子PQQ合成路徑的模塊[6]，使混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸水平提高了20%。但由于基因組信息的缺乏，對(duì)關(guān)鍵酶的研究較為局限，該研究中只選用了1個(gè)山梨糖脫氫酶基因和1個(gè)山梨酮脫氫酶基因。江南大學(xué)陳堅(jiān)課題組通過(guò)在氧化葡萄糖酸桿菌內(nèi)過(guò)表達(dá)山梨糖脫氫酶和山梨酮脫氫酶，在該菌中實(shí)現(xiàn)了由山梨糖到2-KGA的轉(zhuǎn)化過(guò)程[7]，發(fā)酵168 h獲得2-KGA 32.4 g/L。此外，本實(shí)驗(yàn)室曾借助系統(tǒng)生物學(xué)方法對(duì)混菌體系進(jìn)行代謝組學(xué)與蛋白組學(xué)偶聯(lián)的解析[8-9]，深入挖掘了兩菌間相互作用機(jī)制。同時(shí)，利用混菌培養(yǎng)傳代150 d的方式加強(qiáng)混菌的相互作用[10]，糖酸轉(zhuǎn)化率提高16%，并借助代謝組[11]與蛋白組[12]成功挖掘了兩菌相互強(qiáng)化的分子機(jī)制。

本研究中，針對(duì)前人較少研究的山梨酮脫氫酶 (L-sorbosone dehydrogenase，縮寫為SNDH) 進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)山梨酮脫氫酶基因，分別位于基因組 (縮寫為) 和質(zhì)粒 (縮寫為) 上。和序列差異很大，同源性只有30.39%。通過(guò)在工業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)酸菌HKv604中構(gòu)建兩種山梨酮脫氫酶功能模塊，比較其對(duì)2-KGA產(chǎn)量的影響，同時(shí)，結(jié)合混菌長(zhǎng)期傳代加強(qiáng)兩菌相互作用的適應(yīng)性進(jìn)化策略，讓改造后的工程菌株與伴生菌互為進(jìn)化壓力，研究適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)對(duì)2-KGA產(chǎn)量及模塊作用的影響。旨在解析兩種模塊在中的作用機(jī)制的同時(shí)，增加山梨酮脫氫酶模塊與底盤細(xì)胞之間的適配，尋找強(qiáng)化產(chǎn)酸路徑及削弱缺陷路徑的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所使用的維生素C二步發(fā)酵菌株為工業(yè)應(yīng)用菌種酮古龍酸桿菌HKv604與伴生菌內(nèi)生芽孢桿菌[13]。構(gòu)建工程菌株所用的質(zhì)粒為廣宿主低拷貝的pBBR1MCS2[14]，由軍事科學(xué)院微生物研究所張惟材教授惠贈(zèng)。脫氧核糖核苷酸 (dATP、dTTP、dGTP和dCTP) 和DNA聚合酶購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶和連接反應(yīng)試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品，質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、基因組提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 工程菌株構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室先前對(duì)菌株Hbe602進(jìn)行了全基因組測(cè)序，包含染色體和兩個(gè)質(zhì)粒，結(jié)果遞交于NCBI庫(kù)中 (CP012908、CP012909、CP012910)。編碼2個(gè)山梨酮脫氫酶L-sorbosone dehydrogenase，分別位于染色體DNA (簡(jiǎn)稱) 和質(zhì)粒2 (簡(jiǎn)稱) 上，GI號(hào)分別為939480045和939479492，Blast結(jié)果顯示兩個(gè)基因間的同源性只有30.39 %。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物 (表1)，擴(kuò)增菌株基因組上兩個(gè)山梨酮脫氫酶基因及PQQ合成基因，構(gòu)建組合模塊 (圖1)。通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將含有目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入HKv604中，在含卡那霉素的抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。獲得了過(guò)表達(dá)和的4株工程菌株，分別命名為SyBE_Kv0001116021、SyBE_Kv0001116022、SyBE_Kv00011160210和SyBE_Kv00011160220。

表1 引物序列

圖1 工業(yè)K. vulgare中L-山梨酮脫氫酶模塊 (A)及其與輔因子合成基因pqqA組合的功能模塊 (B)的構(gòu)建

1.2.2 培養(yǎng)基配制

種子培養(yǎng)基 (1 L培養(yǎng)基)：玉米漿3 g，牛肉膏3 g，酵母膏3 g，尿素1 g，蛋白胨10 g，KH2PO41 g，MgSO40.2 g，CaCO31 g，定容至0.8 L。配制固體培養(yǎng)基還需添加瓊脂20 g。調(diào)節(jié)pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。另稱取20 g/L-山梨糖定容至0.2 L單獨(dú)滅菌，接菌前添加至種子培養(yǎng)基中。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (1 L培養(yǎng)基)：玉米漿15 g，尿素12 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，CaCO32 g，定容至0.8 L，調(diào)節(jié)pH 6.8?7.0，121 ℃滅菌20 min。另稱取80 g山梨糖定容至0.2 L單獨(dú)滅菌，接菌前添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.3 酮古龍酸桿菌單菌發(fā)酵

將活化的菌株用無(wú)菌水從平板上吹洗下來(lái)，加入50 mL新鮮培養(yǎng)基 (含50 μg/mL卡那霉素) 內(nèi)，在30 ℃、250 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)24 h，獲得種子液。測(cè)定種子液的細(xì)胞濃度，計(jì)算初始接菌濃度為600=0.3所需的種子液體積，加入新鮮培養(yǎng)基中發(fā)酵。

1.2.4 底物與產(chǎn)物的檢測(cè)

本研究中底物與產(chǎn)物的測(cè)定選用高效液相色譜法 (HPLC)。取菌液1 mL，12 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至離心管中，用0.5 mol/L硫酸溶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，水系濾膜過(guò)濾后，通過(guò)HPLC進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱選用Bio-Rad HPX-87H，流動(dòng)相為0.5 mol/L H2SO4，流動(dòng)相流速為0.6 mL/min，柱溫設(shè)定為65 ℃，示差檢測(cè)器檢測(cè)樣品。

1.2.5 混菌傳代馴化與發(fā)酵

改造后的和通過(guò)平板活化和種子液培養(yǎng)獲得活性較好的菌種。按初始600比為3∶1進(jìn)行種子液混合，接入有50 mL新鮮種子培養(yǎng)液的250 mL搖瓶中進(jìn)行混菌培養(yǎng)，30 ℃、250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h。取2 mL混菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50 mL 新鮮種子培養(yǎng)基中在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)傳代50 d取轉(zhuǎn)接后剩余的混菌培養(yǎng)液1 mL，12 000 r/min離心5 min，將上清移至離心管中用于2-KGA的HPLC測(cè)定，菌體經(jīng)1 mL 0.5 mol/L HCl處理用于混菌600的測(cè)定。對(duì)第50天的混菌分純，將50代與伴生菌配合混菌發(fā)酵，測(cè)定產(chǎn)酸量和600值。

2 結(jié)果與討論

2.1 山梨酮脫氫酶功能模塊對(duì)的影響

利用傳統(tǒng)的分析手段和基因工程手段，研究者們解析了中將山梨糖轉(zhuǎn)化為古龍酸的反應(yīng)途徑及相關(guān)酶學(xué)特性[15-16]，認(rèn)為山梨酮脫氫酶對(duì)參與山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA的過(guò)程中起到重要作用。本文的研究工作通過(guò)對(duì)比兩個(gè)山梨酮脫氫酶模塊的效果，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其功能。將工程菌SyBE_Kv0001116021和SyBE_Kv0001116022進(jìn)行單菌發(fā)酵，底物L(fēng)-山梨糖的濃度為20 g/L。底物消耗和產(chǎn)物2-KGA濃度隨時(shí)間的變化如圖2所示。在48 h發(fā)酵過(guò)程中菌株的耗糖速率基本相同，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率也沒有太大差別。發(fā)酵到36 h后，不再消耗L-山梨糖，2-KGA的產(chǎn)量也趨于穩(wěn)定。過(guò)表達(dá)山梨酮脫氫酶基因的菌株產(chǎn)酸量都低于對(duì)照菌株，過(guò)表達(dá)的菌株生產(chǎn)2-KGA的能力最弱。通過(guò)上述數(shù)據(jù)可知，過(guò)表達(dá)s并不影響細(xì)胞對(duì)底物山梨糖的吸收利用和轉(zhuǎn)化，但是山梨糖流向副產(chǎn)物途徑的通量較大，導(dǎo)致2-KGA產(chǎn)量明顯降低。圖3是24 h測(cè)得改造菌株單菌發(fā)酵菌液的HPLC結(jié)果，底物L(fēng)-山梨糖的出峰時(shí)間為9.50 min，產(chǎn)物峰為7.87 min。觀察可知過(guò)表達(dá)對(duì)L-山梨糖代謝路徑?jīng)]有太大影響。過(guò)表達(dá)的菌株發(fā)酵液在7.40 min出現(xiàn)了副產(chǎn)物峰，耗糖量并沒有降低。本文采用的高效液相色譜87H柱子上離得近的兩種物質(zhì)一般結(jié)構(gòu)比較接近，從圖3可以肯定該副產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物2-KGA的性質(zhì)較為接近，這與本研究確定的山梨酮脫氫酶的特異性較差的結(jié)論較為一致，而之前的文獻(xiàn)報(bào)道有提到一種副產(chǎn)物L(fēng)-艾杜糖酸[17]，本研究得到的也有可能是類似物質(zhì)。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)編碼的蛋白酶能很好地利用底物L(fēng)-山梨糖，但底物有相當(dāng)一部分被轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物，進(jìn)一步說(shuō)明編碼的山梨酮脫氫酶對(duì)L-山梨糖轉(zhuǎn)化2-KGA反應(yīng)專一性較差。

圖2 山梨酮脫氫酶模塊對(duì)K. vulgare耗糖 (A) 與產(chǎn)酸(B)的影響

圖3 改造K. vulgare發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)

2.2 山梨酮脫氫酶與輔因子PQQ組合對(duì)及混菌發(fā)酵的影響

醌酶與其輔因子PQQ的合成是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。大腸桿菌中不含合成PQQ的基因，但有編碼PQQ依賴型葡萄糖脫氫酶的基因[18]。耐輻射球菌中具有合成PQQ相關(guān)基因而不含醌酶合成基因[19]。而中同時(shí)具有醌酶和PQQ合成基因，考慮到山梨酮脫氫酶屬于醌酶家族，在參與氧化還原反應(yīng)的過(guò)程中需要配合輔因子PQQ進(jìn)行物質(zhì)的氧化，單獨(dú)過(guò)表達(dá)山梨酮脫氫酶可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體內(nèi)輔因子不平衡，從而使氧化還原反應(yīng)受阻。在大腸桿菌、釀酒酵母等模式生物中，針對(duì)NADH、NADPH等輔因子的代謝調(diào)控已取得顯著效果[20-21]。為此，本研究進(jìn)行了功能模塊與輔因子配合表達(dá)。

過(guò)表達(dá)的菌株SyBE_Kv0001116021，發(fā)酵48 h消耗底物0.402 g，2-KGA的產(chǎn)量為9.83 g/L；過(guò)表達(dá)模塊的菌株SyBE_ Kv00011160210消耗底物0.365 g，2-KGA的產(chǎn)量為9.68 g/L。可能是輔因子配合帶來(lái)的積極影響與輔因子過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成的負(fù)擔(dān)相互抵消，導(dǎo)致總體無(wú)影響?；炀l(fā)酵120 h，原始菌株SyBE_Kv000111601與伴生菌混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為70.5 g/L，含空載體的菌株SyBE_Kv0001116010與伴生菌混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為69.1 g/L，過(guò)表達(dá)基因菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為66.3 g/L，過(guò)表達(dá)-的菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為67.6 g/L (圖4)。改造菌株的混菌發(fā)酵產(chǎn)酸量較對(duì)照菌株低，可能由于代謝負(fù)擔(dān)造成。

圖4 山梨酮脫氫酶模塊及其與輔酶合成模塊組合對(duì)混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA的影響

配合輔因子合成基因獲得的菌株SyBE_Kv00011160220的耗糖速率有了較大提高。過(guò)表達(dá)的菌株SyBE_Kv0001116022發(fā)酵48 h后消耗底物0.367 g，2-KGA產(chǎn)量為5.75 g/L；過(guò)表達(dá)-的菌株SyBE_Kv00011160220底物消耗為0.477 g，2-KGA的產(chǎn)量為6.55 g/L，提升了13.9%。說(shuō)明輔因子的加入對(duì)編碼的山梨酮脫氫酶參與的氧化還原反應(yīng)有積極作用?；炀l(fā)酵結(jié)果，原始菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為70.5 g/L，含有空載體的菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為69.1 g/L，過(guò)表達(dá)菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為7.41 g/L，過(guò)表達(dá)-的菌株混菌發(fā)酵的產(chǎn)酸量為7.42 g/L。輔因子合成功能模塊對(duì)編碼的山梨酮脫氫酶催化反應(yīng)無(wú)明顯作用。

2.3 混菌配合適應(yīng)性進(jìn)化對(duì)混菌發(fā)酵的影響

適應(yīng)性進(jìn)化與理性設(shè)計(jì)改造策略不同，能在大量不同基因出現(xiàn)突變，有效提高功能模塊與底盤細(xì)胞間的適配性[22]。運(yùn)用合成生物技術(shù)構(gòu)建工程菌株生產(chǎn)生物燃料、生物化學(xué)品等工作中，結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化能顯著提高菌株適應(yīng)性、底物利用效率和生產(chǎn)速率[23-24]。為此，將改造后的與伴生菌配合進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，圖5為進(jìn)化50 d過(guò)程中4個(gè)工程菌混菌體系2-KGA的變化情況。圖中曲線的斷點(diǎn)是因?yàn)樵趥鞔^(guò)程中發(fā)生了染菌情況，通過(guò)對(duì)其中的兩菌進(jìn)行了分離純化后重新混合傳代所致。曲線均存在一定的波動(dòng)，但總體上趨于穩(wěn)定。適應(yīng)性進(jìn)化的機(jī)制是生物體隨外界環(huán)境條件的改變而改變了自身的特性或生活方式，適應(yīng)于新環(huán)境的基因型會(huì)留下更多的子代，從而不斷進(jìn)化。以前研究表明，二步混菌生產(chǎn)維生素C的發(fā)酵體系中，與其伴生菌內(nèi)生芽孢桿菌既存在著代謝物質(zhì)上的交流，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間上的競(jìng)爭(zhēng)[9]。伴生菌在生長(zhǎng)和產(chǎn)芽孢過(guò)程中釋放促進(jìn)產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸[25]，能夠降解培養(yǎng)基中的蛋白為伴生菌提供大量氨基酸，通過(guò)促進(jìn)伴生菌快速生長(zhǎng)并進(jìn)入衰亡期產(chǎn)生芽孢[26]。借助產(chǎn)酸菌與伴生菌的相互作用，通過(guò)傳代的方式，互為環(huán)境壓力，使得兩菌配合更為默契，從而得到更優(yōu)化的發(fā)酵體系。分離菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵，經(jīng)過(guò)傳代進(jìn)化實(shí)驗(yàn)菌株SyBE_Kv0001116021的2-KGA的產(chǎn)量提高了15.4%，菌株SyBE_Kv0001116022的2-KGA產(chǎn)量提升179%。菌株SyBE_Kv00011160210在進(jìn)化前后2-KGA的產(chǎn)量并未發(fā)生明顯改變，菌株SyBE_Kv00011160220進(jìn)化后2-KGA產(chǎn)量提高了125% (圖6)。由上述結(jié)果可看出適應(yīng)性進(jìn)化對(duì)菌株的作用效果明顯，能很好地削弱副產(chǎn)物路徑的作用，提高混菌產(chǎn)酸效率。

圖5 混菌傳代50 d過(guò)程中2-KGA產(chǎn)量

圖6 傳代菌株混菌發(fā)酵產(chǎn)酸圖

3 結(jié)論

本文在工業(yè)中構(gòu)建L-山梨酮脫氫酶基因及其與輔因子組合的-和-模塊，期望通過(guò)產(chǎn)酸功能模塊與輔因子合成模塊的適配性研究，比較其作用差異。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，配合輔因子模塊組合-與功能模塊單獨(dú)表達(dá)對(duì)比無(wú)明顯區(qū)別，而混菌發(fā)酵時(shí)-過(guò)表達(dá)使得產(chǎn)酸量獲得了少量的提升。-工程菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸量較提升13.9%，然而混菌發(fā)酵無(wú)明顯效果。結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化策略，將上述改造的工程菌株與伴生菌混合傳代培養(yǎng)，兩菌間互為動(dòng)態(tài)進(jìn)化壓力?；炀到y(tǒng)在50 d傳代完成后，2-KGA的轉(zhuǎn)化率得到了一定的提升，2-KGA的產(chǎn)量分別提高15.4%、179%、0.65%和125%。從另一角度說(shuō)明該混菌體系中兩菌的共同進(jìn)化作用，使該模塊產(chǎn)生副產(chǎn)物的作用削弱。由此可見，混菌適應(yīng)性進(jìn)化策略是一種增加功能模塊與底盤細(xì)胞適配性，進(jìn)而快速獲得優(yōu)良性狀菌種的有效方法。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Fitness analysis between the L-sorbosone dehydrogenase modules andchassis

Si Chen1,2, Nan Jia1,2, Mingzhu Ding1,2, and Yingjin Yuan1,2

1 Key Laboratory of Systems Bio-engineering (Ministry of Education), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), Tianjin 300072, China

is an acid-producing strain in the process of two-step vitamin C fermentation. L-sorbosone dehydrogenase (SNDH) is one of the key enzymes during the biosynthesis of 2-keto-L-gulonic acid (2-KGA), the precursor of vitamin C. However, the catalytic mechanism of SNDH is unclear. According to the whole genome sequencing of, two genes encoding sorbosone dehydrogenases, one derived from the chromosome (named as) and one from plasmid (named as), were introduced into an industrial strainThe overexpression of genehad hardly effect on 2-KGA production, and the overexpression of geneproduced an obvious byproduct in the fermentation broth. Combinational expression ofwith(obtainingandmodules) inresulted in the similar fermentation phenotype to two previous strains. After serial sub-cultivation of co-culturedwith each engineeredfor 50 d, the conversion rate of 2-KGA increased by 15.4%, 179%, 0.65% and 125% compared with that of the parentalwith. This study shows that adaptive evolution of microbial consortium is an effective strategy to increase the fitness between functional modules and chassis, thus quickly getting better strains for production of 2-KGA.

, L-sorbosone dehydrogenase, fitness, adaptive evolution, mixed culture system

December 10, 2015; Accepted: January 15, 2016

Mingzhu Ding. Tel: +86-22-60973987; E-mail: mzding@tju.edu.cn

Supported by:National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2014CB745100), National Natural Science Foundation of China (No. 21390203), the Ph.D Programs Foundation of Ministry of Education of China (No. 20120032120013).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2014CB745100)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21390203)，教育部博士點(diǎn)基金新教師類課題 (No. 20120032120013) 資助。

陳思, 賈楠, 丁明珠, 等. 山梨酮脫氫酶模塊與酮古龍酸桿菌底盤細(xì)胞的適配分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(9): 1224–1232.

Chen S, Jia N, Ding MZ, et al. Fitness analysis between the L-sorbosone dehydrogenase modules andchassis. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1224–1232.