劉中敢　于霞　李靜

摘要：維生素C生產中的重要一步是L-山梨糖發(fā)酵。該發(fā)酵采用細菌將D-山梨醇氧化為L-山梨糖，分批發(fā)酵時，存在明顯的底物抑制作用，因此很難獲得高產率的山梨糖，而通過補料方式可消除底物抑制作用，改善山梨糖產率。本文在山梨糖發(fā)酵分批時采用了兩種不同的補料方法：以0.6lh-1的恒定速率補入山梨醇含量為600gl-1的營養(yǎng)物，山梨糖的產率為12.64 gl-1h-1；以0.5-0.04lh-1的線性降低速率補入山梨醇含量為600gl-1的營養(yǎng)物，山梨糖的產率為17.01gl-1h-1。在產率方面后一種補料方式具有明顯的優(yōu)勢，可以提高山梨糖產率，是較好的底物補料方法。

關鍵詞：弱氧化醋酸桿菌 山梨醇 山梨糖 補料方法

中圖分類號：TQ924 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）02-0083-01

1 材料和方法

1.1 材料

70%山梨醇溶液，酵母粉，磷酸二氫胺，硫酸鎂。

1.2 菌種及種子培養(yǎng)

菌種：NRRLB-72。

種子培養(yǎng)：培養(yǎng)48小時后的成熟斜面接種于試管，試管培養(yǎng)基裝量為10ml，30℃靜止培養(yǎng)72小時，接種于1L搖瓶，搖瓶培養(yǎng)基裝量為100ml，控制溫度在30℃，搖床轉速250rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.1 發(fā)酵條件

發(fā)酵采用7.0L攪拌發(fā)酵罐，培養(yǎng)基配方如上，通氣量2.2vvm，轉速700rpm，培養(yǎng)溫度30℃，pH通過加入3N HCl自動控制在6.0。

1.3.2 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1衡速補料分批發(fā)酵

發(fā)酵初始，體積為2.5L，山梨醇濃度為100gl-1 ，當生物量達4.2gl-1 時（對數生長期，約發(fā)酵8小時）開始以0.6lh-1衡速補入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培養(yǎng)基，為了排除其他影響，培養(yǎng)基中其余成分按山梨醇比例相應增加。補料結束后繼續(xù)發(fā)酵至山梨醇完全耗盡。

1.3.3 補料速率線性降低分批發(fā)酵

發(fā)酵中補料速率線性降低：F=500.00-62.64×t（F單位是ml h-1，t單位是h）。發(fā)酵初始，體積為2.5L，山梨醇濃度為100gl-1 ，當生物量達3.8gl-1 時（約發(fā)酵6小時）開始補入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培養(yǎng)基，為了排除其他影響，培養(yǎng)基中其余成分按山梨醇比例相應增加，補料速率線性降低（0.5-0.04lh-1）。補料結束后繼續(xù)發(fā)酵至終點。

1.4 山梨糖總產率的計算

山梨糖總產率計算如下：產生的山梨糖（gl-1）/發(fā)酵周期（h）。

2 結果與討論

2.1 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1恒速補料分批發(fā)酵

0.6lh-1恒速補料對發(fā)酵的影響。此條件下發(fā)酵周期、生物量、山梨糖濃度分別為25小時、9.85、316.00gl-1 ，山梨糖總產率為12.16 gl-1 h-1。由于補料較快，導致發(fā)酵11.5小時時反應液中山梨醇濃度由10gl-1 突然增至210gl-1，不利于菌體的生長，這也可能是山梨糖產率降低的原因，此時后山梨糖產率一直較低16.5 gl-1 h-1 。因此，為了在高山梨糖濃度時依然獲得高產率，需要改變補料速率使山梨醇濃度低于抑制水平。

2.2 補料速率線性降低的分批發(fā)酵

由于補料過快，使山梨醇濃度由10gl-1 突然累積到210gl-1，產生底物抑制作用，這樣補料結束后，仍需要發(fā)酵一段時間。為了消除這一不利影響采取將補料速率線性降低（起始0.5lh-1）的方法。理論上，發(fā)酵與補料同時結束，有利于縮短發(fā)酵周期，提高山梨糖產率。

補料速率線性降低時的微生物生長和山梨醇、山梨糖濃度，發(fā)酵周期、生物量、山梨糖濃度分別為16小時、12.41、272.37gl-1，山梨糖總產率為17.01 gl-1 h-1 。

此補料方法與衡速補料相比，可以降低培養(yǎng)過程中山梨醇濃度（50-120 gl-1 ，6-13h；10-210 gl-1 ，8-11.5h）減弱對菌體生長的抑制作用（生物量12.41，9.85），補料結束后 再發(fā)酵時間也由13.5h降低到3h。實驗結果表明補料速率線性降低是個好方法，可以提高山梨糖產率。

在分批發(fā)酵的補料策略方面，也有許多其他方面的報道，Bosjnak et等嘗試采用梯度補料，山梨糖產率為11.62gl-1 h-1；Mori 等采用純氧通氣，提高山梨糖產率到44.85 gl-1 h-1，但不經濟；Srivastava和Lasrado的補料發(fā)酵研究山梨糖產率為12.6gl-1 h-1。與這些研究結果相比，補料速率線性降低優(yōu)勢明顯。

3 結語

在山梨糖補分批發(fā)酵中，山梨醇濃度為600 gl-1的培養(yǎng)基以0.6 l h-1衡速補料時，發(fā)酵周期25h，山梨糖產率及產量分別為12.64 gl-1 h-1和316.00gl-1；然而，以線性降低速率補料時，發(fā)酵周期16h，山梨糖產率及產量分別為17.01 gl-1 h-1和272.37gl-1。前者由于補料速度過快，使發(fā)酵液中山梨醇濃度處于抑制水平，延長了發(fā)酵周期，形成所謂“二次分批發(fā)酵”；而后者補料量呈線性遞減，發(fā)酵液中山梨醇始終處于較適宜濃度，隨著發(fā)酵進入惡化階段，補入的山梨醇量也逐漸減少，這樣使發(fā)酵達到最優(yōu)化。

參考文獻

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