高利芬，劉鵬程，夏志輝，趙紀(jì)瑩，史佳楠，江光懷，劉國振，翟文學(xué)

?

水稻轉(zhuǎn)基因系CX8621中的整合和表達(dá)

高利芬1,2*，劉鵬程1*，夏志輝1，趙紀(jì)瑩1，史佳楠3，江光懷1，劉國振3，翟文學(xué)1

1 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101 2 江漢大學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究院，湖北武漢 430056 3 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中已被廣泛應(yīng)用，而目的基因能否發(fā)揮功能受到多種因素的影響。前期，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制了無選擇標(biāo)記、無載體骨架殘留的水稻轉(zhuǎn)基因系CX8621。截止目前，CX8621已穩(wěn)定遺傳16代，依然保持著對水稻白葉枯病的優(yōu)良抗性。在此基礎(chǔ)上，本研究對外源基因在CX8621中的整合和表達(dá)情況進(jìn)行了分析。首先，通過在轉(zhuǎn)化載體pBXa21的左右邊界與基因序列設(shè)計(jì)嵌套引物，確定被完整地整合到CX8621中。隨后，利用改良的Tail-PCR方法體外克隆了整合位點(diǎn)的邊界序列，明確了被整合在CX8621的2號(hào)染色體上。然后，通過RT-PCR分析了在CX8621中不同時(shí)期和不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果表明在CX8621中能穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)量的變化與之前報(bào)道的抗病性反應(yīng)吻合。此外，還制備了天然XA21蛋白的抗體，對CX8621不同時(shí)期、不同組織中XA21蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在種子中檢測不到XA21蛋白。由此，通過對外源基因的整合和表達(dá)分析，為CX8621的轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)提供了部分科學(xué)依據(jù)。

轉(zhuǎn)基因水稻，，抗白葉枯病，T-DNA整合，表達(dá)分析

水稻白葉枯病是導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)的主要病害之一，利用來源于水稻自身的抗病基因可以經(jīng)濟(jì)有效地控制病害的發(fā)生[1]。其中，水稻中克隆的第一個(gè)廣譜顯性抗病基因，是十分理想的抗源之一[2]。目前，在我國生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的主要栽培品種中，基本上都不含有該基因。因此，利用培育抗白葉枯病新品種具有重要的生產(chǎn)意義[3]。

鑒于的優(yōu)良抗性，自克隆以來，已被廣泛用于改良水稻對白葉枯病的抗性。育種家先后將其轉(zhuǎn)育明恢63[4]、矮培64[5]、9311[6]、中恢218[7]、蜀恢527[8]、R8006[9]等重要恢復(fù)系，并培育出諸如國稻1號(hào)、中優(yōu)218等抗病新品種。此外，國內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室用農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍轉(zhuǎn)化等方法先后將轉(zhuǎn)入到多個(gè)水稻品種中，這些轉(zhuǎn)基因植株都顯示出對白葉枯病的廣譜抗性[10-14]。然而按照我國《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》的規(guī)定，對獲得的這些轉(zhuǎn)基因材料中外源基因的遺傳分析卻鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室以明恢86 (MH86) 為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得了轉(zhuǎn)純合的轉(zhuǎn)基因系CX8621。此前，我們確定了所獲得的CX8621為無選擇標(biāo)記、無載體骨架殘留的單拷貝抗性株系[15]。目前，CX8621已經(jīng)穩(wěn)定遺傳了16代，依然保持著對白葉枯病的優(yōu)良抗性。按照我國農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》的規(guī)定，先后通過了中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)，目前正在申請國家轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書。按照我國《轉(zhuǎn)基因植物安全評價(jià)指南》的要求，本文對在CX8621中整合的完整性、在染色體上的整合位點(diǎn)以及在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，以期為CX8621的轉(zhuǎn)基因生物安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

供試水稻明恢86 (MH86) 為秈稻恢復(fù)系，CX8621是以MH86為受體，pBXa21[16]為轉(zhuǎn)化載體獲得的轉(zhuǎn)純合株系，實(shí)驗(yàn)室前期遺傳分析已證實(shí)為無選擇標(biāo)記、無載體骨架殘留的單拷貝植株[15]。IRBB21為國際水稻所轉(zhuǎn)育的含有的分子標(biāo)記輔助育種材料。MH86-Xa21是以MH86為受體，IRBB21為供體，通過分子標(biāo)記輔助回交轉(zhuǎn)育的含抗性材料。4021[17]是通過轉(zhuǎn)基因途徑獲得的過表達(dá)水稻材料，由佛羅里達(dá)大學(xué)宋文源博士提供。

1.2 T-DNA側(cè)翼序列擴(kuò)增與染色體定位

參照劉耀光教授Tail-PCR的原理[18]，按照Takara LA-PCR體外克隆試劑盒的操作方法，對CX8621中左右邊界的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增片段電泳回收后，連接到Transgene公司的pT-easy載體上進(jìn)行測序。測序結(jié)果去除測序載體序列后，與NCBI和RGAP 數(shù)據(jù)庫中的水稻基因組序列進(jìn)行比對，根據(jù)獲得的側(cè)翼序列與水稻基因組序列之間的相似性，確定在CX8621的整合位點(diǎn)。

1.3 目的基因在RNA水平的表達(dá)分析

Trizol法提取CX8621和IRBB21萌芽期、三葉期、分蘗盛期和灌漿期的葉片總RNA，以及根、莖、葉、葉鞘、穗和種子部位的RNA，用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成cDNA后，以水稻基因?yàn)閮?nèi)參，利用RT-PCR方法對在CX8621的不同時(shí)期、不同組織的表達(dá)情況進(jìn)行分析。的RT-PCR分析所用的引物是Xa21-RTF/R，文中所用引物見表1。

表1 PCR所用引物

1.4 目的基因在蛋白水平的表達(dá)分析

SDS-PAGE分離水稻總蛋白質(zhì)，電泳前將提取的水稻總蛋白加入上樣緩沖液，100 ℃處理 5 min，上樣量為20 μL。用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，用制備的XA21蛋白質(zhì)的抗體室溫孵育3 h，TTBS (2 mmol/L Tris·HCl, ph 7.6, 13.6 mmol/L NaCl, 0.1% Tween-20) 洗膜3次，每次5 min。然后加入二抗室溫孵育1 h，TTBS洗膜3次，每次5 min，加ECL-Plus檢測液，暗室曝光后X光片檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1在CX8621中的實(shí)際整合序列分析

為了分析在CX8621中的整合是否完整，在T-DNA的左、右邊界內(nèi)側(cè)和基因內(nèi)部設(shè)計(jì)嵌套引物進(jìn)行配對擴(kuò)增。在左邊界內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)LBR1、LBR2、LBR3、LBR4四條引物分別和LBR配對(圖1A)，以MH86、CX8621以及轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pBXa21為模板進(jìn)行擴(kuò)增。以pBXa21為模板時(shí)，能獲得目標(biāo)條帶，而在對照MH86中未能進(jìn)行擴(kuò)增，這說明了引物的有效性 (圖1B)。LBR1、LBR2和LBR3分別與LBR配對，在轉(zhuǎn)基因系CX8621中都能擴(kuò)增出特異的目標(biāo)條帶，而LBR4與LBR配對時(shí)在轉(zhuǎn)基因系CX8621中沒有擴(kuò)增 (圖1B)，表明的3′端被完整地整合在CX8621的染色體上，并且T-DNA的左邊界內(nèi)側(cè)序列可能有一定程度的丟失。同樣，在右邊界內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)引物RBR1、RBR2與RBF配對 (圖1A)，同樣以MH86、CX8621和轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pBXa21為模板進(jìn)行擴(kuò)增，兩對引物在對照MH86中未能有效擴(kuò)增，在CX8621和轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pBXa21中都能擴(kuò)增出大小一致的目標(biāo)條帶(圖1C)，表明的5′端同樣被完整的整合到CX8621的基因組。根據(jù)以上結(jié)果，結(jié)合前期Southern雜交實(shí)驗(yàn)[15]；可以確定在CX8621中有完整的整合。

圖1 Xa21在CX8621中的整合完整性分析

2.2在CX8621整合位點(diǎn)分析

借助Takara 的體外克隆試劑盒，對CX8621進(jìn)行邊界序列的擴(kuò)增。獲得候選條帶后，連到T載體上進(jìn)行測序。除去測序結(jié)果中的載體序列后，獲得了298 bp的左邊界側(cè)翼序列和460 bp的右邊界側(cè)翼序列。右邊界側(cè)翼序列填充了大量重復(fù)的水稻基因組DNA，未能有效地定位插入片段的位置。對左邊界側(cè)翼序列的分析顯示 (圖2A)，1–24 bp (斜體) 和載體左邊界序列完全一致。25–48 bp (小寫) 與水稻基因組多位點(diǎn)同源，但與之后的片段不連鎖。49–298 bp (下劃線)與2號(hào)染色體上的序列完全匹配，插入片段被整合到Os02g0541000與Os02g0541300之間。

圖2 Xa21在CX8621整合位點(diǎn)的定位與驗(yàn)證

為了驗(yàn)證整合位點(diǎn)的正確性，在2號(hào)染色體上設(shè)計(jì)引物109F4、109R1和109R2，與左邊界特異引物L(fēng)BF1、LBF2進(jìn)行配對擴(kuò)增 (圖2B)。 109R2+LBF1、109R1+LBF2兩對引物都在轉(zhuǎn)基因材料CX8621中特異的擴(kuò)增，在對照材料MH86中無擴(kuò)增 (圖2C, D)，此結(jié)果印證了整合位置的正確性；109R2+LBF1、109R1+LBF2可以作為CX8621轉(zhuǎn)基因材料特異的分子標(biāo)記。109F4+109R1配對在對照MH86中擴(kuò)增到和預(yù)計(jì)大小一致的520 bp片段；在轉(zhuǎn)基因系CX8621中，由于插入了1個(gè)9.9 kb的基因，在較短的擴(kuò)增時(shí)間內(nèi)沒有擴(kuò)增片段(圖2E)。

2.3在CX8621中的表達(dá)分析

通過Trizol法提取了轉(zhuǎn)基因系CX8621不同組織的RNA，采用RT-PCR的方法，檢測了在CX8621不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，和在IRBB21中的表達(dá)模式類似，在轉(zhuǎn)基因系CX8621的葉、葉鞘和莖內(nèi)都能檢測到的表達(dá)，而在穗、根和種子中檢測不到表達(dá) (圖3A)。由于介導(dǎo)的抗性受發(fā)育階段的調(diào)控，導(dǎo)入的受體植株，生長到分蘗期才能表現(xiàn)出完全的抗性[19]。于是，我們對不同時(shí)期CX8621中的表達(dá)進(jìn)行分析，與IRBB21表達(dá)模式一樣，在三葉期開始檢測到表達(dá)，分蘗盛期達(dá)到最高，此后略有下降 (圖3B)。這與之前報(bào)道的CX8621的抗性結(jié)果吻合，在三葉期表現(xiàn)為部分抗性，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，分蘗盛期抗性達(dá)到最佳[15]。

圖3 Xa21在CX8621中的表達(dá)分析

2.4 XA21蛋白在CX8621中的表達(dá)分析

編碼受體類蛋白激酶，全長1 025個(gè)氨基酸，包含LRR區(qū)、跨膜區(qū)和絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)3個(gè)結(jié)構(gòu)域[2]。XA21蛋白能進(jìn)行自我磷酸化，與XA21結(jié)合的多個(gè)蛋白都能影響XA21的表達(dá)，進(jìn)而影響對白葉枯病的抗性[20-21]。作為抗病反應(yīng)的啟動(dòng)基因，其自身的蛋白表達(dá)量非常低。目前，國際上還未能成功通過免疫印跡法 (Western blotting) 在植物中檢測到天然XA21蛋白的表達(dá)。對XA21蛋白表達(dá)的分析均是在外加標(biāo)簽的基礎(chǔ)上，針對特異的標(biāo)簽進(jìn)行檢測。外加標(biāo)簽的方法可以用于常規(guī)的分子生物學(xué)研究中，然而對于以生產(chǎn)應(yīng)用為目的轉(zhuǎn)基因育種，在目標(biāo)基因中引入外加標(biāo)簽等同于新添加了一個(gè)潛在的不安全因素。因此，在轉(zhuǎn)基因育種中不能采用這種設(shè)計(jì)來進(jìn)行蛋白含量的檢測。對于CX8621中XA21蛋白表達(dá)量的檢測，必須制備出天然XA21蛋白的單克隆抗體。為此，我們與國內(nèi)外的合作者不斷進(jìn)行研究，并在最近，與北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心合作，制備出了XA21蛋白特異的單克隆抗體。

在得到XA21特異的單克隆抗體后，我們對MH86、高表達(dá)材料4021，以MH86為背景的回交育種材料MH86-Xa21和CX8621進(jìn)行了根、莖、葉和種子內(nèi)XA21蛋白質(zhì)含量的檢測。結(jié)果顯示在高表達(dá)材料4021的葉子中檢測到了XA21，在CX8621和MH86-Xa21的根、莖、葉和種子中均沒有檢測到XA21蛋白的表達(dá) (圖4)。在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，所制備抗體的檢測下限為0.5–1.0 ng，綜合RT-PCR的結(jié)果，認(rèn)為XA21蛋白在CX8621的種子中沒有表達(dá)。

圖4 XA21蛋白在CX8621中的表達(dá)分析

3 討論

外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的穩(wěn)定遺傳與高效表達(dá)是其具有利用價(jià)值的先決條件，而轉(zhuǎn)基因植物目標(biāo)基因的穩(wěn)定遺傳與表達(dá)主要取決于受體基因組的遺傳背景 (背景效應(yīng))、目的基因的拷貝數(shù) (劑量效應(yīng))、以及整合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) (位置效應(yīng))[22]。實(shí)驗(yàn)室前期工作中，將轉(zhuǎn)入不同的水稻材料，通過Tail-PCR擴(kuò)增出攜帶有T-DNA-的側(cè)翼序列，并以此為探針，通過RFLP分析，將T-DNA-定位在水稻的染色體上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-DNA-在受體整合的自主性強(qiáng)，不依賴于受體中同源序列的染色體位置；并且在相同背景材料、不同插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因系中顯示出幾乎相同的抗性水平，說明轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)不明顯。此外，對同一材料不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻的抗性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，抗性水平不會(huì)隨著拷貝數(shù)的增加而增加，表明劑量效應(yīng)不是影響抗性水平的主要因素。然而，不同遺傳背景的轉(zhuǎn)水稻材料，雖然都保持了對白葉枯病的高抗水平，但不同材料之間仍顯示出了明顯的差異，表明轉(zhuǎn)基因的水稻其抗性有比較明顯的遺傳背景效應(yīng)[23-24]。

T-DNA整合進(jìn)入植物基因組，往往伴隨著T-DNA自身或受體基因組的缺失、重復(fù)和倒置等現(xiàn)象[25]。本文在分析CX8621的側(cè)翼序列時(shí)也發(fā)現(xiàn)，左邊界內(nèi)側(cè)的部分序列發(fā)生了缺失而填充了24 bp水稻基因組片段。Buck等在對T-DNA整合的轉(zhuǎn)基因水稻研究中發(fā)現(xiàn)，在插入位點(diǎn)也存在類似邊界序列的缺失和填充現(xiàn)象，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)缺失的序列和大小不存在規(guī)律性，而填充序列與宿主植物或T-DNA的左右邊界存在一定的同源性[26-27]。Kumar等在完善T-DNA的整合模型時(shí)認(rèn)為，這些同源序列是在T-DNA整合過程中，植物靶DNA雙鏈斷裂，游離出的植物基因組3'端找到與其同源的小段DNA后開始修復(fù)合成，新合成的DNA序列與植物基因組另一端游離的一小段序列直接連接到平末端，通過單鏈退火使余下的單鏈缺口修復(fù)形成的[28]。

在CX8621的表達(dá)呈現(xiàn)出受發(fā)育階段性的調(diào)控，這與我們前期研究CX8621對白葉枯病的抗性表現(xiàn)一致，即隨著水稻植株的發(fā)育成熟，含有的水稻植株對白葉枯病的抗性逐漸提高[15]。Park等通過在水稻中過表達(dá)，使其在苗期就表現(xiàn)出了對白葉枯病較強(qiáng)的抗性，同樣說明了的抗性水平與其表達(dá)量存在相關(guān)性[29]。此外，Park還通過外加標(biāo)簽的方法在過表達(dá)水稻材料的葉片中檢測到了XA21蛋白的表達(dá)，然而對于以生產(chǎn)應(yīng)用為目的的轉(zhuǎn)基因育種來說，這種方法引入了新的安全隱患，難以被采用。于是，我們通過制備天然的抗體檢測CX8621中XA21的表達(dá)，結(jié)果在過表達(dá)材料4021中檢測到了XA21，在CX8621及其相同遺傳背景的MH86-Xa21中均未能檢測到表達(dá)。這可能是由于作為抗病的啟動(dòng)基因，其蛋白表達(dá)量很少，低于實(shí)驗(yàn)所能檢測的下限所致，我們會(huì)繼續(xù)改善檢測的靈敏度，希望能對其表達(dá)量進(jìn)行更加精確的定量。

此外，基因在CX8621中的表達(dá)模式和在分子標(biāo)記輔助選育的IRBB21材料中保持一致，說明轉(zhuǎn)基因操作并沒有改變目標(biāo)基因的表達(dá)模式。我們前期從整體轉(zhuǎn)錄組水平的研究也表明，轉(zhuǎn)基因材料和分子標(biāo)記輔助選育材料可以同等對待[30]。此外，在人類食用的種子部分，基因和XA21蛋白在CX8621中均沒有檢測到表達(dá)。以上這些結(jié)果為CX8621的轉(zhuǎn)基因安全性評價(jià)提供了部分科學(xué)證據(jù)。

致謝：感謝佛羅里達(dá)大學(xué)宋文源博士提供Xa21過表達(dá)水稻材料4021，感謝北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心制備了XA21蛋白的單克隆抗體。

REFERENCES

[1] Ogawa T. Methods and strategy for monitoring race distribution and identi?cation of resistance genes to bacterial leaf blight (pv.in rice. Jpn Agr Res Q1993, 27(2): 71–80.

[2] Song WY, Wang GL, Chen LL, et al. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene,. Science, 1995, 270(5243): 1804–1806.

[3] Zhai WX, Zhu LH. Research on bacteria blight resistance and molecular breeding in rice. Prog Biotech, 1999, 19(6): 9–15(in Chinese).翟文學(xué), 朱立煌. 水稻白葉枯病抗性基因的研究與分子育種. 生物工程進(jìn)展, 1999, 19(6): 9–15.

[4] Xue QZ, Zhang NY, Xion ZF, et al. Application of molecular marker-assisted selection to cultivate bacterial blight resistance restorer line in rice. J Zhejiang Agric Univ, 1998, 24(6): 581–582 (in Chinese).薛慶中, 張能義, 熊兆飛, 等. 應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇培育抗白葉枯病水稻恢復(fù)系. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 24(6): 581–582.

[5] Chen XR. Identifying on photo-thermo sensitive genic male sterile lines in rice and study ontransgenic progeny Peiai64S [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2002 (in Chinese).陳小榮. 水稻光溫敏核不育系鑒定及培矮64S轉(zhuǎn)后代分析[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2002.

[6] Zhou YF, Qi HX, Wan BL, et al. Studies on increasing resistance of 9311 to bacterial blight by molecular marker assisted selection. Mol Plant Breeding, 2004, 1(5): 835–836 (in Chinese).周元飛, 戚華雄, 萬丙良, 等. 運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良 9311 白葉枯病抗性的研究. 分子植物育種, 2004, 1(5): 835–836.

[7] Peng YC, Li WH, Fang YP. Breeding and application of indica hybrid rice Zhongyou218 by molecular marker-assisted selection. Hybrid Rice, 2004, 19(3): 13–16 (in Chinese).彭應(yīng)財(cái), 李文宏, 方又平, 等. 采用分子標(biāo)記技術(shù)育成優(yōu)質(zhì)抗病雜交稻新組合中優(yōu)218. 雜交水稻, 2004, 19(3): 13–16.

[8] Huang TY. Improvement of bacteria blight resistance of Shuhui527 by molecular maker-assisted selection and mapping the genes involved in fertility of Pingxiang genic male sterile rice [D]. Ya’an: Sichuan Agriculture University, 2004 (in Chinese).黃廷友. 分子標(biāo)記輔助選擇改良蜀恢 527 對白葉枯病的抗性和萍鄉(xiāng)核不育水稻育性相關(guān)基因的定位分析[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[9] Cao LY, Zhan XD, Zhuang JY, et al. Breeding of indica hybrid rice Guodao1 with good quality, high yield and resistance to bacterial leaf blight by marker-assisted selection technique. Hybrid Rice, 2005, 20(3): 16–18 (in Chinese).曹立勇, 占小登, 莊杰云, 等. 利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)育成優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗病雜交稻國稻1號(hào). 雜交水稻, 2005, 20(3): 16–18.

[10] Zhao B, Wang WM, Zheng XW, et al. Utilization of-mediated system inducingto photo-thermo sensitive genic male sterile line Peiai64S. J Yunnan Univ: Nat Sci Ed, 1999, 21(3): 197 (in Chinese).趙彬, 王文明, 鄭先武, 等. 應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將白葉枯病抗性基因?qū)胨竟饷舨挥蹬喟?4S.云南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1999, 21(3): 197.

[11] Li XB, Yi CD. A genetically modified japonica restorer line, C418-Xa21, and its hybrid rice with bacterial blight resistance. Chin J Biotech, 2001, 17(4): 380–384 (in Chinese). 李曉兵, 裔傳燈. 經(jīng)基因工程改良的抗白葉枯病水稻粳型恢復(fù)系“C418-Xa21”及其雜交稻. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17(4): 380–384.

[12] Zhou YL, Zhang Q, Wang CL. Resistance oftransgenic hybrid rice Shanyou63 and Shanyou559 to bacterial blight. Chin J Rice Sci, 2002, 16(1): 93–95 (in Chinese).周永力, 章琦, 王春連. 轉(zhuǎn)基因雜交稻組合汕優(yōu)63和汕優(yōu)559對白葉枯病的抗性. 中國水稻科學(xué), 2002, 16(1): 93–95.

[13] Zhang SP, Song WY, Chen LL, et al. Transgenic elite indica rice varieties, resistant topv.. Mol Breeding, 1998, 4(6): 551–558.

[14] Gao LF, Xia ZH, Jiang GH, et al. Generation of marker-free, bacterial blight resistant transgenic sterile line and hybrid rice with. Plant Breeding, 2011, 130(4): 438–443.

[15] Xia ZH, Liu PC, Gao LF, et al. Generation and genetic analysis oftransgenic rice line CX8621 without selectable markers. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 10–16 (in Chinese).夏志輝, 劉鵬程, 高利芬, 等. 水稻無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系CX8621的獲得與遺傳分析. 中國水稻科學(xué), 2016, 30(1): 10–16.

[16] Xia ZH, Li XB, Chen CY, et al. Generation of selectable, marker-free and vector backbone sequence-freetransgenic rice. Chin J Biotech, 2006, 22(2): 204–210 (in Chinese).夏志輝, 李曉兵, 陳彩艷, 等. 無選擇標(biāo)記和載體骨干序列的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得. 生物工程學(xué)報(bào), 2006, 22(2): 204–210.

[17] Wang YS, Pi LY, Chen XH, et al. Rice XA21 binding protein 3 is a ubiquitin ligase required for full-mediated disease resistance. Plant Cell, 2006, 18(12): 3635–3646.

[18] Liu YG, Chen YL, Zhang QY. Amplification of genomic sequences flanking T-DNA insertions by thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction// Transgenic Plants: Methods and Protocols. New York: Humana Press, 2004: 341–348.

[19] Century KS, Lagman RA, Adkisson M, et al. Developmental control of-mediated disease resistance in rice. Plant J, 1999, 20(2): 231–236.

[20] Xu WH, Wang YS, Liu GZ, et al. The auto-phosphorylated Ser686, Thr688, and Ser689 residues in the intracellular juxtamembrane domain of XA21 are implicated in stability control of rice receptor-like kinase. Plant J, 2006, 45(5): 740–751.

[21] Liu GZ, Pi LY, Walker JC, et al. Biochemical characterization of the kinase domain of the rice disease resistance receptor-like kinase XA21. J Biol Chem, 2002, 277(23): 20264–20269.

[22] Gambino G, Chitarra W, Maghuly F, et al. Characterization of T-DNA insertions in transgenic grapevines obtained by-mediated transformation. Mol Breeding, 2009, 24(3): 305–320.

[23] Zhu XF, Chen XW. Genetic mapping of T-DNA integration sites intransgenic rice. Acta Genet Sin, 2002, 29(10): 880–886 (in Chinese).朱雪峰, 陳學(xué)偉. 轉(zhuǎn)水稻中T-DNA整合的遺傳定位. 遺傳學(xué)報(bào), 2002, 29(10): 880–886.

[24] Zhai WX, Chen CY, Zhu XF, et al. Analysis of T-DNA-Xa21 loci and bacterial blight resistance effects of the transgenein transgenic rice. Theor Appl Genet, 2004, 109(3): 534–542.

[25] Forsbach A, Schubert D, Lechtenberg B, et al. A comprehensive characterization of single-copy T-DNA insertions in the Arabidopsis thaliana genome. Plant Mol Biol, 2003, 52(1): 161–176.

[26] Zhang J, Guo D, Chang Y, et al. Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13 804 T-DNA flanking sequences from an enhancer trap mutant library. Plant J, 2007, 49(5): 947–959.

[27] DeBuck S, Podevin N, Nolf J, et al. The T-DNA integration pattern in Arabidopsis transformants is highly determined by the transformed target cell. Plant J, 2009, 60(1): 134–145.

[28] Kumar S, Fladung M. Transgene integration in aspen: structures of integration sites and mechanism of T-DNA integration. Plant J, 2002, 31(4): 543–551.

[29] Park CJ, Lee SW, Chen M, et al. Ectopic expression of riceovercomes developmentally controlled resistance topv.. Plant Sci, 2010, 179(5): 466–471.

[30] Gao LF, Cao YH, Xia ZH, et al. Do transgenesis and marker-assisted backcross breeding produce substantially equivalent plants? –a comparative study of transgenic and backcross rice carrying bacterial blight resistant gene. BMC genomics, 2013, 14(1): 738–749.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Integration and expression ofin transgenic rice CX8621

Lifen Gao1,2*, Pengcheng Liu1*, Zhihui Xia1, Jiying Zhao1, Jianan Shi3, Guanghuai Jiang1, Guozhen Liu3, and Wenxue Zhai1

1 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 Institute for System Biology, Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei, China 3 College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China

-mediated transformation system has been widely applied. However, the function of target gene is affected by multiple factors. With this system, we obtained a transgenic rice line CX8621 carrying the bacterial blight resistance gene. In previous work, we have confirmed that it was selectable maker-free and vector backbone-free. And after 16 generations of breeding, it still maintained perfect resistance to bacterial blight disease. On this basis, we analyzed the integration and expression ofin CX8621 at the present study. First, based on the border sequences of plasmid pBXa21 and, we designed nested primers and assured the integrity ofin CX8621. Second, we cloned the flanking sequences and locatedon chromosome 2 using improved Tail-PCR. Then we analyzed the expression pattern ofin several tissues and at different developmental stages by RT-PCR. The results show thatcan be stably expressed in CX8621, agreeing well with the disease resistance response as reported previously. In addition, we detected the protein levels of XA21 in CX8621 with antibody of natural XA21 protein. Surprisingly, no XA21 protein was detected in the seeds of CX8621. Thus, the integration and expression analysis ofin CX8621 provided a part of scientific evidences for the safety assessment of genetically modified rice.

transgenic rice,, bacteria blight resistance, T-DNA integration, expression analysis

December 24, 2015; Accepted:January 28, 2016

Wenxue Zhai. Tel: +86-10-64807633; E-mail: wxzhai@genetics.ac.cn*These authors contributed equally to this study.

Supported by:National Transgenic Major Program of China (No. 2014ZX08001-002), National Natural Science Foundation of China (No. 31300999), Internal Grant of Jianhan University (No. 3003-06000043).

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (No. 2014ZX08001-002)，國家自然科學(xué)基金 (No. 31300999)，江漢大學(xué)科研啟動(dòng)項(xiàng)目 (No. 3003-06000043) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160301.1118.001.html

高利芬, 劉鵬程, 夏志輝, 等. 水稻轉(zhuǎn)基因系CX8621中的整合和表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(9): 1255–1263.

Gao LF, Liu PC, Xia ZH, et al. Integration and expression ofin transgenic rice CX8621. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1255–1263.