黃瑞 伍業(yè)旭 李嘯

（安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌 443000）

響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

黃瑞 伍業(yè)旭 李嘯

（安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌 443000）

文章運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化了金針菇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出影響生物量的3個(gè)主要因素：玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面分析法確定主要因子之間的交互作用及最佳條件。

金針菇 響應(yīng)面法 酵母浸粉

食用菌液態(tài)菌種發(fā)酵技術(shù)是食用菌和工業(yè)發(fā)酵技術(shù)的交叉學(xué)科。液體菌種具有培養(yǎng)時(shí)間短、發(fā)菌快、菌齡整齊、接種方便等優(yōu)點(diǎn),利于食用菌規(guī)?；⒐S化生產(chǎn),越來越受到食用菌生產(chǎn)企業(yè)的青睞。

安琪酵母浸粉是純培養(yǎng)的面包酵母經(jīng)自溶、分離、高溫噴霧干燥而成的有機(jī)氮源,富含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素及生長(zhǎng)因子等。在食用菌的液體制種階段能為菌體提供豐富的營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)菌體迅速增殖,有效縮短菌體生長(zhǎng)周期,降低成本。本文以金針菇為例。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

金針菇：安琪酵母股份有限公司提供；酵母浸粉由安琪酵母股份有限公司提供；XFLS-50MA型滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；ZHWY-1102型恒溫培養(yǎng)振蕩器；上海智城分析儀器制造有限公司SW-CT-1D型凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；AR2140型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配置

1.2.1 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖2%、酵母浸粉0.2%、KH2PO4 0. 15%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB150mg/L。

1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉3%、葡萄糖2%、黃豆粉4%、酵母浸粉0.2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB1 0.005%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 在超凈臺(tái)上將菌種接種到已滅菌的斜面培養(yǎng)基上,從斜面取0.5cm2菌塊,在恒溫23℃條件下培養(yǎng)直到菌絲鋪滿整個(gè)斜面。挑選菌絲潔白、長(zhǎng)勢(shì)好、粗壯、無污染的試管,作為下一步供試菌種。

1.3.2 種子制備 將l00mL液體菌種培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶, 121℃下滅菌30nin,待冷卻至室溫后在無菌環(huán)境下接入2塊約0.5cm2的上述供試菌塊,先靜置培養(yǎng)24h,然后在25℃,250r/min條件下培養(yǎng)7d。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1 玉米粉和葡萄糖的交互作用對(duì)生物量影響的響應(yīng)面圖（酵母浸粉 0.25%）

圖2 玉米粉和酵母浸粉的交互作用對(duì)生物量影響的響應(yīng)面圖（葡萄糖2.27%）

圖3 葡萄糖和酵母浸粉的交互作用對(duì)生物量影響的響應(yīng)面圖（玉米粉4.76%）

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)各因素與水平

1.4.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選影響生物量的顯著性影響因素 PB法是一種近飽和的2水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,可以從眾多影響因素中快速有效地篩選出最重要的幾個(gè)因素。本文選用N=7的Plackett-Burman設(shè)計(jì)表對(duì)進(jìn)行研究,以3組零點(diǎn)值估計(jì)誤差。

1.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng),能快速逼近最佳值區(qū)域。根據(jù)實(shí)驗(yàn)1.4. 1的結(jié)果,做最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 Box-Behnken設(shè)計(jì) 以爬坡設(shè)計(jì)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì),用軟件Design expert 7.0對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析并求得最優(yōu)值,得出響應(yīng)面分析結(jié)果,進(jìn)而確定最佳培養(yǎng)條件,最后依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面立體分析圖。

1.4.4 驗(yàn)證 用所得到的結(jié)果進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn),取平均值以驗(yàn)證模型的可靠性。

表2 Plackett- Burman設(shè)計(jì)回歸分析

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)回歸分析

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

此模型R2為0.9227,說明 92.27%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋。模型P值為0.0057＜0.05,即模型極顯著,可在0.01水平上擬合數(shù)據(jù)。失擬項(xiàng)P值為0.0673＞0.05,表明失擬項(xiàng)不顯著,模型沒有出現(xiàn)失擬的現(xiàn)象。從表中各影響因素的P值可以看出,對(duì)金針菇生物量影響最顯著的3個(gè)因素依次為：A＞B＞D,即玉米粉＞葡萄糖＞酵母浸粉。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表2中A、B、D 3個(gè)因子估計(jì)系數(shù)的正負(fù),依次增大或減小,玉米粉和酵母浸粉是正效應(yīng),應(yīng)依次增大；葡萄糖是負(fù)效應(yīng),應(yīng)依次減小；其他非顯著性因素根據(jù)表4中的估計(jì)系數(shù)的正負(fù)分別取Plackett-Burman設(shè)計(jì)中的最大值或最小值。爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

結(jié)果表明,隨著三個(gè)組分的變化,生物量呈現(xiàn)先增大后減小的變化。當(dāng)玉米粉為4%,葡萄糖為2%,酵母浸粉為0.3%時(shí),金針菇生物量最大。因此,后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)號(hào)2各因素水平為中心值來進(jìn)一步設(shè)計(jì)優(yōu)化。

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

模型相關(guān)性系數(shù)R2為0.9317,說明93.17%的變異能由該模型解釋；模型P值為 0.0191表明模型是極顯著的,失擬項(xiàng)P值為0.1775表明模型沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。A（玉米粉）,B（葡萄糖）對(duì)金針菇生物量的影響是極顯著的,D（酵母浸粉）其次；AB的交互影響是顯著的,AD, BD的交互影響不顯著。

通過二次模型回歸系數(shù)的計(jì)算,得到如下方程以表征3個(gè)因素對(duì)生物量的影響：

R=-914.19125+291.40167A+588.21083B+3247.81250D+91. 40500AB -299.82500AD-2.90000BD-44.47833A2-224.88333B2-3592.08333D2。

式中,R代表金針菇生物量（mg/100mL）,A、B、D分別代表玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉的實(shí)際質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。利用Design expert7.0解得得最優(yōu)值點(diǎn)為A=4.76,B=2.27,D=0.25,即質(zhì)量濃度分別為乳糖4.76%,玉米漿2.27%,酵母浸粉0.25%,預(yù)測(cè)最大生物量為858. 231mg/100mL。根據(jù)上述擬合回歸方程作響應(yīng)面分析圖。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用上述步驟得出的最佳培養(yǎng)基配方：玉米粉4.76%,葡萄糖2. 27%,酵母浸粉0.25%,黃豆粉 3%,KH2PO40.25%,MgSO4·7H2O 0.07%,VB1 0.003%,做5組平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)值（849.528± 4.390）U/mL與預(yù)測(cè)值接近,表明模型合理,數(shù)據(jù)可由此模型解釋。

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化篩選出3個(gè)顯著性影響因素：玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉,確定了最佳培養(yǎng)基組合：玉米粉4.76%,葡萄糖2.27%,酵母浸粉0.25%,黃豆粉 3%,KH2PO40.25%,MgSO4·7H2O 0.07%,VB10.003%。在該最佳培養(yǎng)基組合下,金針菇實(shí)際生物量達(dá)到849. 528mg/100ml,與理論預(yù)測(cè)最大生物量接近,說明響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基是合理的。生物量相比優(yōu)化前提高了17.43%。

［1］柴新義，向玉勇，萬美娟，等. 金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)工藝的優(yōu)化研究［J］.文山學(xué)院學(xué)報(bào).2012（03）： 12-15.

［2］陳力力，吳新芬.金針菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選［J］.生物技術(shù). 2007（01）：73-75.

［3］黃仁術(shù).金針菇液體培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件研究［J］.食品工業(yè)科技. 2006（12）： 89-91.

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TS2

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