夏金成 闕彤彤 張文君 趙聰 楊秦

（邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 湖南邵陽(yáng) 422000）

不同營(yíng)養(yǎng)條件下維羅納氣單胞菌菌毛表達(dá)與生物膜形成能力的比較

夏金成 闕彤彤 張文君 趙聰 楊秦*

（邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 湖南邵陽(yáng) 422000）

目的：檢測(cè)不同培養(yǎng)基條件下（即不同營(yíng)養(yǎng)條件下）維羅納氣單胞菌菌毛動(dòng)力和生物膜生成能力（即致病能力）。方法：半固體培養(yǎng)基穿刺陽(yáng)培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)菌動(dòng)力，喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生物膜形成能力，最后統(tǒng)計(jì)分析差異性。結(jié)果：BHIB培養(yǎng)基比LBA培養(yǎng)基中，野生型都比菌毛缺失的MSHB突變維羅納氣單胞菌有更高的動(dòng)力和生物膜形成能力，但之間都無(wú)顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論：不同培養(yǎng)基基條件對(duì)菌毛動(dòng)力有影響，而菌毛表達(dá)對(duì)生物膜致病性有一定關(guān)系。

維羅納氣單胞 菌毛 半固體穿刺 粘附

生物膜多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成是一個(gè)復(fù)雜且高度規(guī)律的動(dòng)態(tài)過(guò)程,包括細(xì)菌起始黏附、生物膜黏附期、生長(zhǎng)期、成熟和播散期等階段［1］。首先, 游動(dòng)細(xì)胞接受環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)信號(hào), 通過(guò)鞭毛或菌毛等附著結(jié)構(gòu)黏附于表面； 附著于表面后的細(xì)菌不斷繁殖并吸引其他細(xì)菌繼續(xù)附著, 使該附著位點(diǎn)細(xì)菌呈高密度狀態(tài)從而產(chǎn)生抗生素抵抗性［2］。鞭毛、菌毛介導(dǎo)的動(dòng)力性和黏附性在細(xì)菌致病性中發(fā)揮重要作用, 其與細(xì)菌的生物膜形成、耐藥性和慢性感染中的相關(guān)性日益受到醫(yī)學(xué)界的重視［3］。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同培養(yǎng)基條件下（即高低營(yíng)養(yǎng)差別條件下）維羅納菌菌毛對(duì)動(dòng)力和有機(jī)體細(xì)胞粘附的作用,探討細(xì)菌菌毛對(duì)生物膜形成的起始黏附、生物膜黏附期的意義。為抗菌,制藥做出基礎(chǔ)貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 菌種

本次采用的是兩種維羅納氣單胞菌：MSHB+（野生型有菌毛）和MSHB-（基因突變型無(wú)菌毛）。這兩種細(xì)菌均來(lái)源以前研究工作的保種。它們有鞭毛表達(dá),只在菌毛表達(dá)上有差異。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件

BHIB和LBA培養(yǎng)基分別是相對(duì)高和相對(duì)低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基。維羅納氣單胞菌被分別放在不同培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng),等到細(xì)菌長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,用于接下來(lái)的半固體培養(yǎng)基穿刺和生物膜形成能力實(shí)驗(yàn)。

1.2 免疫印跡

1.2.1 細(xì)菌菌毛蛋白的收集

首先將兩種培養(yǎng)細(xì)菌用PBS洗滌三次,再將每種細(xì)菌懸浮在1mlPBS溶液中。把此PBS溶液吸入皮下注射器,并對(duì)著eppendorf管壁反復(fù)擠出和吸入。最后在13200轉(zhuǎn)/分鐘,室溫條件下離心25分鐘,以分離細(xì)菌和菌毛蛋白。緊接著加入緩沖溶液,煮沸變性。最后再離心一分鐘,把上層溶液用于跑膠。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

按照普通的8%的膠的方法配制凝膠,跑膠。

1.3 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 半固體培養(yǎng)基配制

瓊脂4g/l,牛肉膏粉末3 g/l,蛋白胨5g/l,氯化鈉5 g/l,調(diào)節(jié)pH=7.4。混勻溶解后,以3厘米為高度分裝于玻璃試管中。將分裝后的玻璃試管用錫箔紙包住封口。高溫高壓滅菌,放涼。

1.3.2 細(xì)菌接種

在超凈工作臺(tái)中,用接種針將不同的細(xì)菌分別接種在滅菌后的半固體培養(yǎng)基中。穿刺深度以試管中瓊脂高度的1/2-3/4為宜。穿刺軌跡你應(yīng)循原路退出,刺入及拔出時(shí)要接種針不向穿刺線外擺動(dòng)。穿刺后封口,37℃培養(yǎng),72小時(shí)觀察結(jié)果。如有細(xì)菌沿著穿刺線擴(kuò)散,那么細(xì)菌就有動(dòng)力。每種菌株重復(fù)50次。

1.4 喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)（生物膜形成能力檢測(cè)）

將兩種不同細(xì)菌接種在兩種不同培養(yǎng)基中。喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)的方法與之前報(bào)道的方法一致［4］。

1.5 SPSS統(tǒng)計(jì)分析。

使用SPSS19.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

結(jié)果表明野生型（MSHB+）有菌毛而突變型（MSHB-）沒(méi)有。βactin是內(nèi)參。

表1 半固體培養(yǎng)基穿刺實(shí)驗(yàn)

圖1 菌毛蛋白表達(dá)的免疫印跡

圖2 喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明野生型（MSHB+）比突變型（MSHB-）維羅納氣單胞菌有更強(qiáng)動(dòng)力,但之間并無(wú)顯著區(qū)別（p＜0.05）。

結(jié)果表明在兩種不同培養(yǎng)基中（相對(duì)高營(yíng)養(yǎng)的BHIB和相對(duì)低營(yíng)養(yǎng)的LBA）,野生型（MSHB+）比突變型（MSHB-）維羅納氣單胞菌都具有更強(qiáng)粘附能力,但無(wú)論哪一種之間并無(wú)顯著區(qū)別（p＜0.05）。

3 討論

生物膜是細(xì)菌在表面生活時(shí)采取的一種生長(zhǎng)方式, 它是細(xì)菌的一種本能, 尤其適合細(xì)菌在不利環(huán)境中生存,對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生保護(hù)作用； 生物膜最重要的特性是對(duì)抗生素的高度耐藥性［5］,它能夠有效地阻擋藥物作用于膜內(nèi)的細(xì)菌。生物膜與臨床中、西藥耐藥性是目前研究的熱點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）證明,有菌毛表達(dá)的維羅納氣單胞菌有更強(qiáng)的動(dòng)力,而更強(qiáng)動(dòng)力的細(xì)菌更能粘附宿主細(xì)胞（圖2）。基于菌毛、粘附和生物膜形成之間的關(guān)系。通過(guò)本次研究,我們揭示了維羅納菌菌毛部分的致病能力,為藥物開(kāi)發(fā)等研究奠定一定基礎(chǔ)。

［1］Butler M T，Wang Q，Harshey R M.Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.J Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（8）：3776-81.

［2］Merino S，Shaw J G，Tomas J M.Bacterial lateral flagella： an inducible flagella system.J FEMS Microbiol Lett， 2006， 263（2）：127-35.

［3］ Giron J A，Levine M M，Kaper J B.Longus： a long pilus ultrastructure produced by human enterotoxigenic Escherichia coli.J Mol Microbiol，1994，12（1）：71-82.

［4］Thornley，J.P.，Shaw，J.G.，Gryllos，I.A.& Eley，A. （1997）Virulence properties of clinically significant Aeromonas species：evidence for pathogenicity.Review in Medical Microbiology，8，61-72.

［5］Van Houdt R，Michiels C W.Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation.J Res Microbiol，2005，156（5-6）：626-33.

Q2

A

1674-2060（2016）03-0005-01

課題來(lái)源： 2015年度湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（653）；2015年度湖南省教育廳科研項(xiàng)目（15C1255）。

夏金成， 闕彤彤， 張文君， 趙聰，邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校2014級(jí)檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)學(xué)生。

楊秦（1981—），男，講師，主要研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。