賈祥磊　李超紅　蔡瑞艷　馮　杰　姜淑嫻　劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院　河南省神經(jīng)病學研究所，河南　衛(wèi)輝　453100)

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大鼠頸動脈體免疫組化實驗方法

賈祥磊李超紅蔡瑞艷馮杰姜淑嫻劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院河南省神經(jīng)病學研究所，河南衛(wèi)輝453100)

目的運用石蠟切片免疫組化試驗方法檢驗大鼠頸動脈體。方法通過對頸動脈體的固定，石蠟包埋，切片。分析切片的質(zhì)量及其原因，運用免疫組化方法標記大鼠頸動脈體標記物——酪氨酸羥化酶。結果大鼠頸動脈體在100%的酒精和二甲苯的脫水時間18 min為宜。將頸動脈體水平放置包埋和修剪之后更好進行石蠟切片操作。結論應用免疫組化方法研究頸動脈體的過程需要小心操作，反復練習，及時總結，才能熟能生巧，最終掌握適用于頸動脈體的研究方法。

頸動脈體；石蠟切片；免疫組化

頸動脈體外周化學感受器通過感受外周血氧分壓的變化介導睡眠呼吸暫停綜合征、高血壓及慢性心力衰竭等病理狀況下的交感神經(jīng)活性增強。大鼠模型常被用來研究頸動脈體在上述疾病狀況下功能變化的機制。為檢測信號分子水平的變化，免疫組化為最常用研究方法之一，但是由于頸動脈體體積微小且難與周圍組織區(qū)分，在做免疫組化的過程中，往往會出現(xiàn)頸動脈體丟失或誤認等問題，最終導致實驗失敗〔1～6〕。本文擬探討大鼠頸動脈體石蠟切片和免疫組化染色過程的各個環(huán)節(jié)，為頸動脈體研究提供方法學保障。

1　材料和方法

1.1動物雄性SD大鼠，由河南省實驗動物中心提供(No.41003100001855)，每5只一籠飼養(yǎng)，體重220～280 g。光照條件：每天明暗12 h交替。攝食飲水自由，墊料更換1次/w。

1.2試劑兔抗酪氨酸羥化酶(Abcam)、二抗試劑盒(中山金橋，PV-9001)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(萬類生物，WLA022)、蘇木素(上海標本模型廠)、伊紅(上海試劑三廠)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水碳酸鈉、甘油、硫酸鎂(天津致遠化學試劑有限公司)、醋酸(天津市北辰方正試劑廠)、無水乙醇(天津市恒興化學試劑制造有限公司)、二甲苯(天津市永大化學試劑有限公司)、硫酸鋁鉀(天津基準化學試劑有限公司)、碘酸鈉(天津市化學試劑三廠)、甲醛(煙臺市雙雙化工有限公司)、中性樹膠(中國上海懿洋儀器有限公司)、載玻片。

1.3器材石蠟切片機(Thermo，F(xiàn)inesse 325)、烤片機(Leica，HI1220)、顯微鏡(Nikon)、微波爐(格蘭仕)、烘箱(上海精宏實驗設備有限公司)、蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司，BT00-300T)、pH儀(Sartorius，PB-10)，冷凝臺(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司，BM-IX)、體視顯微鏡(XYH-4A)。

1.4方法

1.4.1組織固定用10%的水合氯醛麻醉大鼠(腹腔注射，3.4 ml/kg)，把大鼠固定在灌流架上，開胸。灌流針頭從心尖穿入左心室，一直穿入到主動脈弓。剪開右心耳，快速灌流生理鹽水。灌流生理鹽水速度為120 ml/min，灌流量為500 ml。然后，用4%中性甲醛進行固定。灌流速度為10 ml/min，灌流量為200 ml。灌流結束后，從頸部分離出頸動脈分叉，為了不損傷頸動脈體，頸內(nèi)動脈和頸外動脈盡量留長一些。將分離的頸動脈分叉室溫放置于4%中性甲醛溶液中，不低于2 h。然后取出頸動脈分叉置于生理鹽水中。在體視鏡下分離與頸內(nèi)動脈伴行的迷走神經(jīng)。在頸外動脈上，離頸總動脈分叉很近的部位有一根細小的血管，為枕動脈，將其從頸內(nèi)動脈的根部修剪下來。在頸動脈分叉的腹面，有一個橄欖型膠質(zhì)狀的組織，為頸上神經(jīng)節(jié)。將頸上神經(jīng)節(jié)分離。此時，在頸總動脈分叉靠近頸內(nèi)動脈一側觀察到有一團半透明的組織，為頸動脈體；把頸動脈體周邊的結締組織分離干凈，只留下頸動脈體和分叉。

1.4.2組織包埋把頸動脈分叉置于包埋盒中，開始脫水。逐一浸在60%酒精、80%酒精、95%酒精1、95%酒精2、各1 h。依次在100%酒精1、100%酒精2、二甲苯1、二甲苯2，每個液體中浸18 min。脫水完成后，開始浸蠟，浸蠟時間不低于7 h(68℃)。然后在組織包埋機上進行包埋。包埋時盡量讓頸動脈分叉和蠟盒的平面保持平行，這樣有利于在切片機上切出較理想的頸動脈體切片。將包埋盒放在冷凝臺上，室溫下冷凝10 min。冷凝后修蠟塊，去除周圍多余的蠟。置于4℃冰箱中過夜。次日，將蠟塊置于-20℃冰箱冷卻保存。

1.4.3石蠟切片和脫蠟蠟塊從-20℃冰箱中取出固定到石蠟切片機上修片，修到血管處，放回-20℃冰箱進行降溫。降溫5 min后，取出蠟塊，切片厚度調(diào)整為5 μm，開始切片。每切3～5片，將最后1片貼在載玻片上，放在顯微鏡下觀察。觀察到頸動脈體的片子后，收取以后的石蠟切片。將片子放在自來水中展開，自來水中滴加幾滴酒精有利于展片，用載玻片從自來水中取出切片，置于45℃水中進一步展片，石蠟切片完全展開后，貼到載玻片上。將載玻片置于室溫晾干。晾干后也可放在盒子中室溫保存。做蘇木素-伊紅染色(HE)或者免疫組化實驗時，把載玻片放到65℃烤片機上烤片90 min。然后進行梯度脫蠟，先置于二甲苯1、二甲苯2內(nèi)各5 min，依次置于無水酒精、95%酒精、80%酒精各1 min。自來水洗1 min。整個脫蠟過程不要讓組織干。脫蠟完成后，直接做HE染色或者免疫組化實驗的抗原修復步驟。

1.4.4HE染色和免疫組化HE染色：浸在蘇木素6 min，去離子水浸泡1 min；分化液3 s，去離子水浸泡10 min；促藍液1 min，去離子水浸泡1 min；染伊紅10 s，去離子水浸泡1 min。室溫下晾干，用中性樹膠封片。HE染色完成。

免疫組化實驗：脫蠟后用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，玻片置于500 ml的檸檬酸鈉緩沖液中(0.01 mol/L，pH6.0)，微波爐加熱沸騰10 min，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min 。3%H2O2室溫孵育15 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，暗盒避光。然后PBS洗滌3次，每次5 min。加0.2%的Triton-X100(Triton-X100溶解在0.01 mol/L的PBS)通透10 min。滴加10%山羊血清(用0.01 mol/L的PBS配制)封閉，室溫孵育20 min。然后滴加酪氨酸羥化酶(TH)抗體(稀釋比例1∶500)，陰性對照滴加PBS，4℃過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。滴加中衫金橋PV-9001二抗試劑，室溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。按照試劑盒說明配制DAB顯色液，顯色時需鏡下觀察確定，發(fā)現(xiàn)目的蛋白顯色發(fā)生變化，立即浸泡在去離子水中，終止反應。然后進行核染。蘇木素溶液中染色4 min，去離子水浸泡1 min。放到顯微鏡下觀察核的顏色，若染色過深在分化液中浸3 s，去離子水洗滌5 min。促藍1 s，去離子水浸泡1 min。再放到鏡下觀察核的顏色；如果核的顏色過淺，可再用蘇木素復染，直到染出理想的顏色。核染以后，在室溫晾干片子，浸二甲苯透明，中性樹膠封片。將玻片晾干，在顯微鏡下拍片。

2　結　果

2.1HE染色頸動脈體呈不規(guī)則的橢圓形，借結締組織連于血管壁上(圖1A)，主要由成簇聚集的細胞，豐富血管網(wǎng)以及疏松的結締組織構成(圖1B)；細胞核較大，結構致密(圖1C)。

2.2免疫組化染色表達TH的Ⅰ型細胞成團聚集。對照組未加TH抗體，TH未被抗體標記，只呈現(xiàn)核染色(圖2)。

胞質(zhì)為伊紅染色，胞核為蘇木素染色圖1　頸動脈體HE染色

圖2　頸動脈體免疫組織化學染色

3　討　論

由于頸動脈體體積微小，應用免疫組化方法對其研究的過程中，許多初學者耗費大量的時間和精力學習和總結頸動脈體石蠟切片制作的技巧性操作，否則將會導致實驗失敗。經(jīng)驗表明，理想的切片是成功的關鍵。首先，灌注完成后，在體視鏡下要把頸動脈體周圍的組織修除干凈，因大鼠頸動脈體較小，對于初學者來說，在做免疫組化石蠟切片時，往往因為誤判出現(xiàn)切不到頸動脈體的現(xiàn)象。為了提高制備頸動脈體切片的成功性，組織固定后盡量把組織分離的只剩下頸動脈體和血管。其次，頸動脈體在無水酒精和二甲苯中的脫水時間各保持18 min為宜(圖3A)。如果脫水時間過短，則會導致脫水不足，蠟不易浸透組織；時間過長(20 min)，會出現(xiàn)組織過硬，切片易碎且有刀痕(圖3B)。刀痕過重就會出現(xiàn)頸動脈體受損，做不出理想的片子。石蠟包埋的時間不低于7 h，避免由于浸蠟時間不足而造成組織塊過硬。包埋時，盡量把頸動脈分叉水平放置于包埋盒底部，使所獲蠟塊中的頸動脈分叉結構與蠟塊表面呈平行關系。

A為理想的頸動脈體切片；B為脫水20 min頸動脈體切片圖3　頸動脈體石蠟切片

切片前，準備好所需全部物品，避免由于準備不足導致切片過程延長，因為在操作過程中，最初在冰箱中變硬的蠟塊在室溫下會慢慢變軟，從而導致切下來的組織切片卷在一起，難以切出完整的片子。切片時，刀片盡量與石蠟包塊中的頸動脈分叉結構保持平行關系，以便切片過程中根據(jù)頸動脈分叉處的結構關系定位出頸動脈體，減少切片時由于誤判導致的頸動脈體遺失。切片速度不宜過快，始終保持手腕力度均勻，以保證所得石蠟切片的完整及厚度均一。切的過程中及時在顯微鏡下觀察切片是否已經(jīng)含有頸動脈體，因為其體積微小，稍有疏忽即可造成部分或整個頸動脈體組織已經(jīng)切掉還沒有發(fā)現(xiàn)的情況。在切片過程中由于蠟塊溫度高而切不成片時，需將蠟塊取下，放回-20℃冰箱，再次降溫后重新開始。在水中展片時，可用柔軟小毛刷將切片小心移至載玻片上，在貼片過程中防止石蠟切片碎裂，一張載玻片上可以貼3張切片。一般情況下，從一個SD大鼠頸動脈體可以獲得5 μm厚度含頸動脈體石蠟切片27張。

做HE染色時，及時過濾染料，避免因為染料中出現(xiàn)的沉淀導致后續(xù)染色結果不均一，最終影響圖像的質(zhì)量。做免疫組化染色時，避免切片干燥，要動作柔和，小心操作，防止因操作不當引起的切片損傷或切片脫落造成的實驗失敗。用DAB發(fā)色時，需及時在顯微鏡下觀察色素的變化，根據(jù)所檢測蛋白的特性決定何時終止反應。用蘇木素復染時，應在顯微鏡下觀察核的著色是否達到理想效果，避免核染色過深影響到檢測蛋白的著色表現(xiàn)。如果顏色偏深，可重復去分化后促藍步驟。如果核顏色較淺，可以用蘇木素重新染色。

綜上所述，應用免疫組化方法研究頸動脈體的過程需要小心操作，反復練習，及時總結，才能熟能生巧，最終掌握適用于頸動脈體的研究方法。

1Kumar P，Prabhakar NR.Peripheral chemoreceptors：function and plasticity of the carotid body〔J〕.Compr Physiol，2012；2(1)：141-219.

2Prabhakar NR.Sensing hypoxia：physiology，genetics and epigenetics〔J〕.J Physiol，2013；591(9)：2245-57.

3Pardal R，Ortega-Saenz P，Duran R，etal.Glia-like stem cells sustain physiologic neurogenesis in the adult mammalian carotid body〔J〕.Cell，2007，131(2)：364-77.

4Bairam A，Neji H，De-Grandpre P，etal.Autoreceptor mechanism regulating carotid body dopamine release from adult and 10-day-old rabbits〔J〕.Respir Physiol，2000；120(1)：27-34.

5Kim DK，Prabhakar NR，Kumar GK.Acetylcholine release from the carotid body by hypoxia：evidence for the involvement of autoinhibitory receptors〔J〕.J Appl Physiol，2004；96(1)：376-83.

6Bisgard GE.Carotid body mechanisms in acclimatization to hypoxia〔J〕.Respir Physiol，2000；121(2-3)：237-46.

〔2016-02-17修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學基金(81470271)

劉玉珍(1964-)，女，博士，教授，主要從事阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征研究。

賈祥磊(1985-)，男，碩士，主要從事神經(jīng)電生理研究。

Q34；Q5-33；Q593+.2

A

1005-9202(2016)15-3621-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.005