王可可， 鄧雅妍，　賴建鴻，　張幫艷，　黃　琛，　申志華，　姜漢國, 2，　揭　偉,2△

(1廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 湛江 524023； 2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心，廣東 湛江 524001；3廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 湛江 524023； 4肇慶市第一人民醫(yī)院兒科，廣東 肇慶 526021)

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落新婦苷對高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α表達(dá)的影響*

王可可1,2▲， 鄧雅妍1,4▲，賴建鴻1，張幫艷1，黃琛1，申志華3，姜漢國1, 2，揭偉1,2△

(1廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 湛江 524023；2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心，廣東 湛江 524001；3廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 湛江 524023；4肇慶市第一人民醫(yī)院兒科，廣東 肇慶 526021)

目的： 分析落新婦苷對高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α)表達(dá)的影響。方法: SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素后誘導(dǎo)成急性糖尿病模型，采用硫代巴比妥酸法測量血漿丙二醛(MDA)濃度，采用紫外分光光度法檢測血漿H2O2濃度，采用免疫熒光檢測大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)經(jīng)高糖刺激后，用real-time PCR、ELISA和免疫熒光檢測SDF-1α的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期分布情況，免疫熒光檢測p65的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果: 糖尿病大鼠血漿MDA和H2O2水平均高于正常對照組，其胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α的表達(dá)較正常組減弱；落新婦苷能降低糖尿病大鼠血漿MDA及H2O2的水平并增加胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α的表達(dá)。體外高糖刺激呈濃度和時間依賴性減少HUVECs中SDF-1α表達(dá)，落新婦苷能一定程度地恢復(fù)SDF-1α表達(dá)。高糖刺激增加HUVECs S期比例，而落新婦苷減少其S期分布。高糖刺激HUVECs中p65蛋白核轉(zhuǎn)位，落新婦苷抑制高糖誘導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)位。結(jié)論: 落新婦苷能增加高糖刺激下內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1α，減少高糖狀態(tài)下的氧化應(yīng)激和NF-κB的活化。

高糖； 落新婦苷； 間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

糖尿病是危害人群健康的常見病、多發(fā)病。廣東省是中國的高發(fā)區(qū)之一，發(fā)病率超過全國平均水平，且年輕化趨勢明顯[1-2]。糖尿病的一個主要特征就是高血糖癥。在長期的高糖刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞容易受到損傷。而血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有關(guān)信號的活化，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)分泌細(xì)胞因子功能紊亂是糖尿病血管并發(fā)癥最早期的變化之一。

間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)主要是由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等分泌的一種小分子蛋白質(zhì)。作為一種配體，在具有CXCR4或CCR7受體的細(xì)胞遷移及歸巢中發(fā)揮重要的作用[3]。研究表明，循環(huán)SDF-1α表達(dá)的減少是糖尿病的重要分子事件[4]。SDF-1α表達(dá)減少，將不能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抗損傷因子，因而內(nèi)皮細(xì)胞易出現(xiàn)凋亡；同時低水平的SDF-1α對循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化作用減弱，不能及時修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞。因此，如能改善糖尿病時SDF-1α水平，理論上對糖尿病血管并發(fā)癥將起到延緩作用。

高糖刺激容易在體液中形成大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)重要炎癥信號通路如p38 MAPK和NF-κB的激活。落新婦苷(astilbin,Ast)是從土茯苓中分離得到的二氫黃酮醇，具有利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑制免疫排斥、減輕缺血再灌注損傷及抑制動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展等方面的作用，口服效果好且無明顯毒副作用[5-7]。在糖尿病腎病及缺血再灌注肝損傷中起到明顯的治療作用[8-10]。目前國內(nèi)外均未見有關(guān)Ast對SDF-1α表達(dá)影響的報道。本項目旨在分析Ast對高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α表達(dá)的影響，為臨床糖尿病血管病并發(fā)癥的防治提供新的科學(xué)依據(jù)。

材　料　和　方　法

1主要抗體及試劑

羊抗鼠SDF-1α及p65的Ⅰ抗(Santa Cruz)；熒光標(biāo)記Ⅱ抗(武漢三鷹)；落新婦苷(成都曼斯特公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma；SDF-1α ELISA試劑盒(R&D)；RNA抽提試劑盒、RT試劑盒及定量PCR試劑盒(TOYOBO)；PCR引物由上海生工公司合成；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone；青霉素及鏈霉素雙抗(北京博奧森)；H2O2及丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物公司)；D-葡萄糖及D-甘露醇(mannitol)為國產(chǎn)分析純試劑。

2實驗動物

雄性SD大鼠22只，體重180～210 g。由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物使用許可證號為SYXK(粵)2008-0007。

3主要方法

3.1急性糖尿病大鼠模型復(fù)制及處理大鼠分組如下：(1)正常血糖(normoglycemia，NG)組：腹腔一次性注射檸檬酸鹽水后正常飲食飲水(n=7)；(2)高糖血癥(hyperglycemia，HG)組：腹腔一次性注射STZ(pH 4.5，0.1%枸櫞酸緩沖液新鮮配制，50 mg/kg)后正常飲食飲水，2周后腹腔注射生理鹽水(n=10)；(3) Ast干預(yù)組：55 mg/kg腹腔一次性注射STZ，2周后再每天腹腔給予Ast(20 mg·kg-1·d-1，生理鹽水溶解)，正常飲食飲水(n=5)。各組大鼠在給予STZ 72 h后采用斷尾取血測血糖值，連續(xù)測3 d，以血糖水平≥16.7為糖尿病建模成功。4周時處死大鼠，抽取心室血，分離血漿，分別用硫代巴比妥酸法測量MDA和紫外分光光度法檢測H2O2濃度， 具體參考試劑盒說明書進(jìn)行。胸主動脈冰凍切片后用于免疫熒光檢測內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自中科院上海細(xì)胞所。HUVECs以DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)免疫組化檢測細(xì)胞CD31表達(dá)以鑒定，細(xì)胞匯合后經(jīng)0.25%胰酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于相關(guān)實驗。分組：正常糖濃度(normal glucose，NG)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，5.5 mmol/L D-葡萄糖；高糖(high glucose，HG)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，12.5、25或50 mmol/L D-葡萄糖；滲透壓對照(Mtol)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，25 mmol/L D-甘露醇；高糖+落新婦苷(HG+Ast)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，25 mmol/L D-葡萄糖及25 μmol/L落新婦苷。HUVECs以0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h同步化后再進(jìn)行上述分組處理，于預(yù)訂時點分別收獲細(xì)胞與上清用于相關(guān)實驗。

3.3Real-time PCR檢測細(xì)胞SDF-1α的mRNA表達(dá)TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR檢測SDF-1α的mRNA表達(dá)。PCR引物序列如下：SDF-1α正義鏈為5’-GAT TCT TCG AAA GCC ATG TTG-3’，SDF-1反義鏈為5’-CAC TTT AGC TTC GGG TCA ATG-3’；β-actin正義鏈為5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，β-actin反義鏈為5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。采用LightCycler 480 循環(huán)儀(Roche)進(jìn)行PCR循環(huán)，總反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL SYBR Green I PCR Master Mix, 0.4 μL 正義鏈引物 (10 μmol/L), 0.4 μL 反義鏈引物 (10 μmol/L), 2 μL cDNA 和 7.2 μL dH2O。PCR 擴(kuò)增條件為95 °C 5 min;95 °C 15 s,60 °C 60 s,共45個循環(huán)。目標(biāo)基因的表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算。

3.4ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SDF-1α蛋白的表達(dá)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清經(jīng)4 ℃離心后棄去沉渣，取上清用于ELISA測定，具體過程參照試劑盒說明書進(jìn)行。各組測定A值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到濃度值，根據(jù)各樣本收集的細(xì)胞數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果以μg/L(每104細(xì)胞)表示。每組重復(fù)3孔。

3.5免疫熒光檢測SDF-1α及p65的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位間接免疫熒光法檢測大鼠主動脈冰凍切片內(nèi) SDF-1α蛋白的表達(dá)，檢測HUVECs中SDF-1α及p65蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。細(xì)胞爬片及主動脈冰凍切片經(jīng)0.5% BSA-PBS 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，滴加相應(yīng) I 抗，4 ℃冰箱過夜孵育，PBS洗滌，滴加熒光Ⅱ抗后37 ℃避光孵育30 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS洗滌后甘油明膠封片，激光共聚焦顯微鏡(Leica)下觀察并拍照。計數(shù)6個典型中倍視野，統(tǒng)計p65核表達(dá)細(xì)胞的百分率。

3.6細(xì)胞周期分析上述各組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，PBS洗滌，75%冷乙醇過夜固定，PBS洗滌后重懸，加入PI和 RNaseA，37 ℃ 溫浴30 min，流式細(xì)胞儀(BD)測定細(xì)胞周期分布。

4統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，用GraphPad Prism 5軟件行單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1Ast降低糖尿病大鼠氧化應(yīng)激并增加血管內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)

用STZ誘導(dǎo)的急性糖尿病大鼠血漿中H2O2和MAD均高于正常對照組，而Ast治療組中H2O2和MAD濃度較糖尿病組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。同時，免疫熒光結(jié)果顯示糖尿病組其胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α表達(dá)的熒光信號較正常對照組弱，而Ast治療組熒光信號得到增強，見圖1。

Figure 1.Astilbin (Ast) decreased plasma H2O2and MDA levels and increased SDF-1α expression in diabetic rats. NG: normoglycemia; HG: hyperglycemia. Mean±SEM.n=5～10.**P<0.01vsNG;##P<0.01vsHG.

圖1落新婦苷降低糖尿病大鼠血漿ROS,增加主動脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α表達(dá)

2高糖刺激呈時間及濃度依賴方式下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α mRNA水平

體外用25 mmol/L HG刺激HUEVCs 48 h后其SDF-1α的mRNA水平明顯較正常組顯著下降，而滲透性對照組中SDF-1α的mRNA水平相對NG組亦有一定程度下降，初步提示HG刺激下調(diào)SDF-1α的mRNA不僅與高滲透壓有關(guān)，又與高糖刺激有關(guān)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這種下降呈現(xiàn)葡萄糖濃度依賴和刺激時間依賴的方式,見圖2。

3Ast逆轉(zhuǎn)高糖刺激抑制的HUEVCs中SDF-1α的表達(dá)

體外實驗證實，Ast能上調(diào)HG導(dǎo)致的SDF-1α mRNA水平的抑制，見圖2；其次，ELISA結(jié)果顯示，Ast能升高HG組細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的SDF-1α蛋白；最后，免疫熒光結(jié)果證實Ast增加HG組內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中SDF-1α蛋白的熒光信號強度，見圖3。

Figure 2.The changes of SDF-1α mRNA levels in HUVECs assessed by real-time RT-PCR. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

圖2Real-time PCR檢測HUVECs中SDF-1α的mRNA水平

4Ast對高糖條件下HUVECs細(xì)胞周期的影響

與NG組比較，HG刺激顯著下調(diào)HUVECs細(xì)胞周期中G1期比值(P<0.01)和上調(diào)S期比值(P<0.01)，而Ast刺激減少了HG組的S期分布(P<0.05)，而G2/M期在NG、HG及Ast組之間差異不明顯。與NG組比較，Mtol刺激輕度增加了G1期并輕度減少了S期分布，見圖4。

5Ast抑制HUVECs中高糖介導(dǎo)的NF-κB活化

在NG條件下，HUVECs胞質(zhì)中有少量p65蛋白表達(dá)，未見明顯p65核定位；單純高滲透壓刺激僅見少許細(xì)胞存在p65核定位信號，而高糖刺激48 h后p65核定位信號顯著增加；在應(yīng)用Ast后減少了高糖誘導(dǎo)的p65核定位，見圖5、6。

討　　論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是糖尿病血管并發(fā)癥的早期分子事件，而引起血管內(nèi)皮功能紊亂與高糖條件下產(chǎn)生的ROS有關(guān)。ROS是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性。高血糖時ROS的大量生成導(dǎo)致血液中的氧化應(yīng)激反應(yīng)的概率急劇上升，進(jìn)而使各類型的功能蛋白質(zhì)變性，形成大量的晚期糖基化終末產(chǎn)物。同時ROS是細(xì)胞炎癥基因如p38、NF-κB等激活的重要誘因。因此，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮的功能障礙能有效降低患糖尿病心血管并發(fā)癥的風(fēng)險。本研究表明，體內(nèi)給予落新婦苷能緩解糖尿病大鼠氧化應(yīng)激因子如H2O2和MDA的產(chǎn)生，同時落新婦苷還可以促進(jìn)高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞重要細(xì)胞因子SDF-1α的產(chǎn)生，研究結(jié)果初步提示落新婦苷在糖尿病血管內(nèi)皮功能紊亂的修復(fù)中具有一定的作用。

Figure 3.SDF-1α protein in HUVECs and their supernatants. NG: normal glucose; HG: high glucose; Mtol: mannitol (osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05vsHG.

圖3HUVECs及其培養(yǎng)液上清中SDF-1α蛋白的表達(dá)情況

Figure 4.The cell cycle distribution in HUVECs. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin (25 μmol/L). Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

圖4HUVECs細(xì)胞周期的變化

Figure 5.The expression and cellular location of p65 in HUVECs. Arrows indicate nuclear location. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin (25 μmol/L).

圖5免疫熒光檢測HUVECs中p65蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位

Figure 6.The percentage of nuclear localization of p65 in HUVECs. NG: normal glucose; HG: high glucose; Mtol: mannitol (osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05vsHG.

圖6HUVECs中p65蛋白核定位細(xì)胞百分比

SDF-1α是一種強烈的趨化因子，循環(huán)血液中SDF-1α水平與內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[4]。糖尿病患者SDF-1α與HbA1c、低密度脂蛋白負(fù)相關(guān)，提示改善血糖、血脂狀況可能升高外周血中SDF-1α水平，進(jìn)而改善內(nèi)皮功能。動脈粥樣化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)是因為諸多危險因素造成動脈內(nèi)皮損傷，而這些環(huán)節(jié)受趨化因子和黏附因子的調(diào)控。糖尿病早期，由于內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，血液中SDF-1α水平下降，對內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化能力不足因而不能及時修復(fù)受損的內(nèi)皮。因此，早期提高血液中SDF-1α水平對糖尿病血管并發(fā)癥的防治具有積極意義。當(dāng)糖尿病發(fā)展至合并動脈粥樣硬化的時期，外周血中SDF-1α水平下降，血管壁上的SDF-1α的濃度表達(dá)卻增加，這勢必提高了血管壁與血中SDF-1α的濃度梯度，很可能因此而提高了SDF-1α趨化單核細(xì)胞侵入內(nèi)皮下和誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的遷移，從而加速動脈粥樣硬化進(jìn)展[11]。因此，糖尿病晚期應(yīng)恢復(fù)血管壁與血液中SDF-1α水平的正常比值。本研究發(fā)現(xiàn)，急性糖尿病大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α較正常對照組下降，但我們未進(jìn)一步分析胸主動脈壁與循環(huán)血液中SDF-1α水平比值的改變。SDF-1α在糖尿病性動脈粥樣硬化并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中到底是起保護(hù)還是加速作用，在不同時期所扮演的角色與作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

落新婦苷是一種二氫黃酮醇。黃酮類藥物能通過誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，以達(dá)到影響細(xì)胞生物學(xué)功能，抑制或殺滅細(xì)菌菌株，抑制重要的病毒酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶等[12]。落新婦苷可通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1 和 COX-2等炎癥因子而發(fā)揮抗炎作用[13-14]。另有研究顯示，落新婦苷可通過抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性而調(diào)節(jié)葡萄糖的合成[15]。我們早期的研究顯示落新婦苷具有抗平滑肌細(xì)胞增殖的作用[16]。此外，落新婦苷通過抗氧化應(yīng)激在糖尿病腎病及缺血再灌注肝損傷中起到明顯的恢復(fù)作用[8-10]。在本實驗顯示落新婦苷能明顯降低高血糖條件下的血漿中的自由基數(shù)量，顯示了很好的抗氧化作用，與Petacci等[17]的報道相一致。此外，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)落新婦苷可拮抗糖尿病高糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α因子的損傷。

NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥損傷、氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷等反應(yīng)中具有關(guān)鍵性作用。p65作為其活性亞基，其核定位的增加是判斷NF-κB信號活化的重要證據(jù)。本研究顯示，與正常對照相比，高糖刺激顯著活化了HUVECs中NF-κB信號，表現(xiàn)為p65蛋白核定位信號的顯著增加，而落新婦苷明顯減低了高糖刺激導(dǎo)致的p65蛋白的核定位，提示落新婦苷具有抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號活化作用。這與我們早期研究發(fā)現(xiàn)落新婦苷能抑制血管緊張素Ⅱ活化平滑肌細(xì)胞中NF-κB信號結(jié)果相似[16]，也一定程度上支持了Diao等[18]發(fā)現(xiàn)落新婦苷能通過阻斷高遷移率族蛋白B1而抑制糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB磷酸化的結(jié)果的報道。

NF-κB信號的活化可以通過經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑來實現(xiàn)。糖尿病或高糖可通過產(chǎn)生ROS而活化NF-κB信號[19]，但NF-κB信號與SDF-1α的關(guān)系較為復(fù)雜。一方面外源性SDF-1α可以活化NF-κB信號[20]，提示SDF-1α是NF-κB信號的上游；另一方面，非經(jīng)典途徑活化的NF-κB信號可以調(diào)節(jié)包括SDF-1α基因在內(nèi)的少部分靶基因的表達(dá)[21-22]，提示SDF-1α是NF-κB下游靶基因。非常有趣的是，經(jīng)典途徑活化的NF-κB信號可以抑制非經(jīng)典途徑活化NF-κB信號介導(dǎo)的SDF-1α的表達(dá)[23]。因此，很可能糖尿病時血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在高糖→ROS→非經(jīng)典NF-κB信號→SDF-1α→經(jīng)典NF-κB信號→抑制非經(jīng)典NF-κB的信號反饋環(huán)路，而落新婦苷可能通過抗氧化應(yīng)激減弱糖尿病時經(jīng)典NF-κB信號的活化而弱化了對非經(jīng)典NF-κB信號活化介導(dǎo)的SDF-1α表達(dá)的負(fù)性調(diào)控，因而最終表現(xiàn)為SDF-1α表達(dá)的增加，但這一假設(shè)仍需要進(jìn)一步的探討。

總之，本研究結(jié)果顯示在高糖應(yīng)激的條件下，機(jī)體會產(chǎn)生大量的ROS并抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)，落新婦苷可以增加高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1α，減少ROS釋放和抑制NF-κB信號活化。落新婦苷在糖尿病血管并發(fā)癥防治上的確切的藥用價值及其作用機(jī)制仍需更多的深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of astilbin on expression of SDF-1α in high glucose-treated vascular endothelial cells

WANG Ke-ke1, 2, DENG Ya-yan1, 4, LAI Jian-hong1, ZHANG Bang-yan1, HUANG Chen1, SHEN Zhi-hua3, JIANG Han-guo1, 2, JIE Wei1, 2

(1DepartmentofPathology,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;2PathologicalDiagnosisandResearchCentre,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China;3DepartmentofPathophy-siology,SchoolofBasicMedicalScience,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;4DepartmentofPediatrics,FirstPeople’sHospitalofZhaoqingCity,Zhaoqing526021,China.E-mail:wei.jie@gdmc.edu.cn)

AIM: To explore the effects of astilbin on high glucose-induced stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α) expression in vascular endothelial cells.METHODS: The acute diabetic SD rats were established by intraperitoneally injection of streptozotocin. The plasma malondialdehyde (MDA) and H2O2levels were measured by thiobarbituric acid method and UV spectrophotometry, respectively. The SDF-1α expression in the endothelial cells of thoracic aorta was assessed by immunofluorescent staining. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were treated with high glucose. The expression of SDF-1α in HUVECs was detected by real-time PCR, ELISA and immunofluorescence. Flow cytometry was adopted to analyze the cell cycle distribution. The expression and intracellular localization of p65 was assessed by immunofluorescent staining.RESULTS: The plasma levels of MDA and H2O2in diabetic rats were higher than those in the normal controls. The expression of SDF-1α in the aortic endothelial cells of diabetic rats was decreased as compared with the normal controls. Astilbin alleviated plasma MDA and H2O2levels in the diabetic rats and increased SDF-1α in the thoracic aorta endothelial cells.Invitrostimulation with high glucose significantly reduced the expression of SDF-1α in the HUVECs, which was restored by astilbin. High glucose stimulation increased the proportion of S phase in the HUVECs, and astilbin reduced S phase proportion. High glucose increased p65 nuclear translocation in the HUVECs, which was attenuated by astilbin treatment. CONCLUSION: Astilbin increases the expression of SDF-1α and reduces oxidative stress and NF-κB activation in high glucose-stimulated vascular endothelial cells.

High glucose; Astilbin; Stromal cell-derived factor-1α; Human umbilical vein endothelial cells

1000- 4718(2016)04- 0610- 08

2015- 10- 13

2015- 12- 14

廣東省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(No. 1057112014);廣東醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目(No. 2011ZZZF002);國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81170121)

Tel: 0759-2388584; E-mail: wei.jie@gdmc.edu.cn

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.006

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