王可可， 鄧雅妍，　賴建鴻，　張幫艷，　黃　琛，　申志華，　姜漢國(guó), 2，　揭　偉,2△

(1廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 湛江 524023； 2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心，廣東 湛江 524001；3廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 湛江 524023； 4肇慶市第一人民醫(yī)院兒科，廣東 肇慶 526021)

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落新婦苷對(duì)高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α表達(dá)的影響*

王可可1,2▲， 鄧雅妍1,4▲，賴建鴻1，張幫艷1，黃琛1，申志華3，姜漢國(guó)1, 2，揭偉1,2△

(1廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 湛江 524023；2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心，廣東 湛江 524001；3廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 湛江 524023；4肇慶市第一人民醫(yī)院兒科，廣東 肇慶 526021)

目的： 分析落新婦苷對(duì)高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α)表達(dá)的影響。方法: SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素后誘導(dǎo)成急性糖尿病模型，采用硫代巴比妥酸法測(cè)量血漿丙二醛(MDA)濃度，采用紫外分光光度法檢測(cè)血漿H2O2濃度，采用免疫熒光檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)經(jīng)高糖刺激后，用real-time PCR、ELISA和免疫熒光檢測(cè)SDF-1α的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期分布情況，免疫熒光檢測(cè)p65的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果: 糖尿病大鼠血漿MDA和H2O2水平均高于正常對(duì)照組，其胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α的表達(dá)較正常組減弱；落新婦苷能降低糖尿病大鼠血漿MDA及H2O2的水平并增加胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α的表達(dá)。體外高糖刺激呈濃度和時(shí)間依賴性減少HUVECs中SDF-1α表達(dá)，落新婦苷能一定程度地恢復(fù)SDF-1α表達(dá)。高糖刺激增加HUVECs S期比例，而落新婦苷減少其S期分布。高糖刺激HUVECs中p65蛋白核轉(zhuǎn)位，落新婦苷抑制高糖誘導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)位。結(jié)論: 落新婦苷能增加高糖刺激下內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1α，減少高糖狀態(tài)下的氧化應(yīng)激和NF-κB的活化。

高糖； 落新婦苷； 間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

糖尿病是危害人群健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。廣東省是中國(guó)的高發(fā)區(qū)之一，發(fā)病率超過(guò)全國(guó)平均水平，且年輕化趨勢(shì)明顯[1-2]。糖尿病的一個(gè)主要特征就是高血糖癥。在長(zhǎng)期的高糖刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞容易受到損傷。而血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有關(guān)信號(hào)的活化，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)分泌細(xì)胞因子功能紊亂是糖尿病血管并發(fā)癥最早期的變化之一。

間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)主要是由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等分泌的一種小分子蛋白質(zhì)。作為一種配體，在具有CXCR4或CCR7受體的細(xì)胞遷移及歸巢中發(fā)揮重要的作用[3]。研究表明，循環(huán)SDF-1α表達(dá)的減少是糖尿病的重要分子事件[4]。SDF-1α表達(dá)減少，將不能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抗損傷因子，因而內(nèi)皮細(xì)胞易出現(xiàn)凋亡；同時(shí)低水平的SDF-1α對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化作用減弱，不能及時(shí)修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞。因此，如能改善糖尿病時(shí)SDF-1α水平，理論上對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥將起到延緩作用。

高糖刺激容易在體液中形成大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)重要炎癥信號(hào)通路如p38 MAPK和NF-κB的激活。落新婦苷(astilbin,Ast)是從土茯苓中分離得到的二氫黃酮醇，具有利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑制免疫排斥、減輕缺血再灌注損傷及抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展等方面的作用，口服效果好且無(wú)明顯毒副作用[5-7]。在糖尿病腎病及缺血再灌注肝損傷中起到明顯的治療作用[8-10]。目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有關(guān)Ast對(duì)SDF-1α表達(dá)影響的報(bào)道。本項(xiàng)目旨在分析Ast對(duì)高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α表達(dá)的影響，為臨床糖尿病血管病并發(fā)癥的防治提供新的科學(xué)依據(jù)。

材　料　和　方　法

1主要抗體及試劑

羊抗鼠SDF-1α及p65的Ⅰ抗(Santa Cruz)；熒光標(biāo)記Ⅱ抗(武漢三鷹)；落新婦苷(成都曼斯特公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自Sigma；SDF-1α ELISA試劑盒(R&D)；RNA抽提試劑盒、RT試劑盒及定量PCR試劑盒(TOYOBO)；PCR引物由上海生工公司合成；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自HyClone；青霉素及鏈霉素雙抗(北京博奧森)；H2O2及丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司)；D-葡萄糖及D-甘露醇(mannitol)為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠22只，體重180～210 g。由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(粵)2008-0007。

3主要方法

3.1急性糖尿病大鼠模型復(fù)制及處理大鼠分組如下：(1)正常血糖(normoglycemia，NG)組：腹腔一次性注射檸檬酸鹽水后正常飲食飲水(n=7)；(2)高糖血癥(hyperglycemia，HG)組：腹腔一次性注射STZ(pH 4.5，0.1%枸櫞酸緩沖液新鮮配制，50 mg/kg)后正常飲食飲水，2周后腹腔注射生理鹽水(n=10)；(3) Ast干預(yù)組：55 mg/kg腹腔一次性注射STZ，2周后再每天腹腔給予Ast(20 mg·kg-1·d-1，生理鹽水溶解)，正常飲食飲水(n=5)。各組大鼠在給予STZ 72 h后采用斷尾取血測(cè)血糖值，連續(xù)測(cè)3 d，以血糖水平≥16.7為糖尿病建模成功。4周時(shí)處死大鼠，抽取心室血，分離血漿，分別用硫代巴比妥酸法測(cè)量MDA和紫外分光光度法檢測(cè)H2O2濃度， 具體參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。胸主動(dòng)脈冰凍切片后用于免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。HUVECs以DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)免疫組化檢測(cè)細(xì)胞CD31表達(dá)以鑒定，細(xì)胞匯合后經(jīng)0.25%胰酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。分組：正常糖濃度(normal glucose，NG)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，5.5 mmol/L D-葡萄糖；高糖(high glucose，HG)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，12.5、25或50 mmol/L D-葡萄糖；滲透壓對(duì)照(Mtol)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，25 mmol/L D-甘露醇；高糖+落新婦苷(HG+Ast)組，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液含10% FBS，25 mmol/L D-葡萄糖及25 μmol/L落新婦苷。HUVECs以0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h同步化后再進(jìn)行上述分組處理，于預(yù)訂時(shí)點(diǎn)分別收獲細(xì)胞與上清用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.3Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞SDF-1α的mRNA表達(dá)TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR檢測(cè)SDF-1α的mRNA表達(dá)。PCR引物序列如下：SDF-1α正義鏈為5’-GAT TCT TCG AAA GCC ATG TTG-3’，SDF-1反義鏈為5’-CAC TTT AGC TTC GGG TCA ATG-3’；β-actin正義鏈為5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，β-actin反義鏈為5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。采用LightCycler 480 循環(huán)儀(Roche)進(jìn)行PCR循環(huán)，總反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL SYBR Green I PCR Master Mix, 0.4 μL 正義鏈引物 (10 μmol/L), 0.4 μL 反義鏈引物 (10 μmol/L), 2 μL cDNA 和 7.2 μL dH2O。PCR 擴(kuò)增條件為95 °C 5 min;95 °C 15 s,60 °C 60 s,共45個(gè)循環(huán)。目標(biāo)基因的表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

3.4ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SDF-1α蛋白的表達(dá)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清經(jīng)4 ℃離心后棄去沉渣，取上清用于ELISA測(cè)定，具體過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各組測(cè)定A值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到濃度值，根據(jù)各樣本收集的細(xì)胞數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果以μg/L(每104細(xì)胞)表示。每組重復(fù)3孔。

3.5免疫熒光檢測(cè)SDF-1α及p65的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位間接免疫熒光法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈冰凍切片內(nèi) SDF-1α蛋白的表達(dá)，檢測(cè)HUVECs中SDF-1α及p65蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。細(xì)胞爬片及主動(dòng)脈冰凍切片經(jīng)0.5% BSA-PBS 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，滴加相應(yīng) I 抗，4 ℃冰箱過(guò)夜孵育，PBS洗滌，滴加熒光Ⅱ抗后37 ℃避光孵育30 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS洗滌后甘油明膠封片，激光共聚焦顯微鏡(Leica)下觀察并拍照。計(jì)數(shù)6個(gè)典型中倍視野，統(tǒng)計(jì)p65核表達(dá)細(xì)胞的百分率。

3.6細(xì)胞周期分析上述各組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，PBS洗滌，75%冷乙醇過(guò)夜固定，PBS洗滌后重懸，加入PI和 RNaseA，37 ℃ 溫浴30 min，流式細(xì)胞儀(BD)測(cè)定細(xì)胞周期分布。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，用GraphPad Prism 5軟件行單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1Ast降低糖尿病大鼠氧化應(yīng)激并增加血管內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)

用STZ誘導(dǎo)的急性糖尿病大鼠血漿中H2O2和MAD均高于正常對(duì)照組，而Ast治療組中H2O2和MAD濃度較糖尿病組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示糖尿病組其胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α表達(dá)的熒光信號(hào)較正常對(duì)照組弱，而Ast治療組熒光信號(hào)得到增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Astilbin (Ast) decreased plasma H2O2and MDA levels and increased SDF-1α expression in diabetic rats. NG: normoglycemia; HG: hyperglycemia. Mean±SEM.n=5～10.**P<0.01vsNG;##P<0.01vsHG.

圖1落新婦苷降低糖尿病大鼠血漿ROS,增加主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α表達(dá)

2高糖刺激呈時(shí)間及濃度依賴方式下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α mRNA水平

體外用25 mmol/L HG刺激HUEVCs 48 h后其SDF-1α的mRNA水平明顯較正常組顯著下降，而滲透性對(duì)照組中SDF-1α的mRNA水平相對(duì)NG組亦有一定程度下降，初步提示HG刺激下調(diào)SDF-1α的mRNA不僅與高滲透壓有關(guān)，又與高糖刺激有關(guān)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這種下降呈現(xiàn)葡萄糖濃度依賴和刺激時(shí)間依賴的方式,見(jiàn)圖2。

3Ast逆轉(zhuǎn)高糖刺激抑制的HUEVCs中SDF-1α的表達(dá)

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ast能上調(diào)HG導(dǎo)致的SDF-1α mRNA水平的抑制，見(jiàn)圖2；其次，ELISA結(jié)果顯示，Ast能升高HG組細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的SDF-1α蛋白；最后，免疫熒光結(jié)果證實(shí)Ast增加HG組內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中SDF-1α蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The changes of SDF-1α mRNA levels in HUVECs assessed by real-time RT-PCR. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

圖2Real-time PCR檢測(cè)HUVECs中SDF-1α的mRNA水平

4Ast對(duì)高糖條件下HUVECs細(xì)胞周期的影響

與NG組比較，HG刺激顯著下調(diào)HUVECs細(xì)胞周期中G1期比值(P<0.01)和上調(diào)S期比值(P<0.01)，而Ast刺激減少了HG組的S期分布(P<0.05)，而G2/M期在NG、HG及Ast組之間差異不明顯。與NG組比較，Mtol刺激輕度增加了G1期并輕度減少了S期分布，見(jiàn)圖4。

5Ast抑制HUVECs中高糖介導(dǎo)的NF-κB活化

在NG條件下，HUVECs胞質(zhì)中有少量p65蛋白表達(dá)，未見(jiàn)明顯p65核定位；單純高滲透壓刺激僅見(jiàn)少許細(xì)胞存在p65核定位信號(hào)，而高糖刺激48 h后p65核定位信號(hào)顯著增加；在應(yīng)用Ast后減少了高糖誘導(dǎo)的p65核定位，見(jiàn)圖5、6。

討　　論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是糖尿病血管并發(fā)癥的早期分子事件，而引起血管內(nèi)皮功能紊亂與高糖條件下產(chǎn)生的ROS有關(guān)。ROS是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性。高血糖時(shí)ROS的大量生成導(dǎo)致血液中的氧化應(yīng)激反應(yīng)的概率急劇上升，進(jìn)而使各類型的功能蛋白質(zhì)變性，形成大量的晚期糖基化終末產(chǎn)物。同時(shí)ROS是細(xì)胞炎癥基因如p38、NF-κB等激活的重要誘因。因此，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮的功能障礙能有效降低患糖尿病心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。本研究表明，體內(nèi)給予落新婦苷能緩解糖尿病大鼠氧化應(yīng)激因子如H2O2和MDA的產(chǎn)生，同時(shí)落新婦苷還可以促進(jìn)高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞重要細(xì)胞因子SDF-1α的產(chǎn)生，研究結(jié)果初步提示落新婦苷在糖尿病血管內(nèi)皮功能紊亂的修復(fù)中具有一定的作用。

Figure 3.SDF-1α protein in HUVECs and their supernatants. NG: normal glucose; HG: high glucose; Mtol: mannitol (osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05vsHG.

圖3HUVECs及其培養(yǎng)液上清中SDF-1α蛋白的表達(dá)情況

Figure 4.The cell cycle distribution in HUVECs. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin (25 μmol/L). Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

圖4HUVECs細(xì)胞周期的變化

Figure 5.The expression and cellular location of p65 in HUVECs. Arrows indicate nuclear location. NG: normal glucose (5.5 mmol/L); HG: high glucose (25 mmol/L); Mtol: mannitol (25 mmol/L; osmotic control); Ast: astilbin (25 μmol/L).

圖5免疫熒光檢測(cè)HUVECs中p65蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位

Figure 6.The percentage of nuclear localization of p65 in HUVECs. NG: normal glucose; HG: high glucose; Mtol: mannitol (osmotic control); Ast: astilbin. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsNG and Mtol;#P<0.05vsHG.

圖6HUVECs中p65蛋白核定位細(xì)胞百分比

SDF-1α是一種強(qiáng)烈的趨化因子，循環(huán)血液中SDF-1α水平與內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[4]。糖尿病患者SDF-1α與HbA1c、低密度脂蛋白負(fù)相關(guān)，提示改善血糖、血脂狀況可能升高外周血中SDF-1α水平，進(jìn)而改善內(nèi)皮功能。動(dòng)脈粥樣化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)是因?yàn)橹T多危險(xiǎn)因素造成動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，而這些環(huán)節(jié)受趨化因子和黏附因子的調(diào)控。糖尿病早期，由于內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，血液中SDF-1α水平下降，對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化能力不足因而不能及時(shí)修復(fù)受損的內(nèi)皮。因此，早期提高血液中SDF-1α水平對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥的防治具有積極意義。當(dāng)糖尿病發(fā)展至合并動(dòng)脈粥樣硬化的時(shí)期，外周血中SDF-1α水平下降，血管壁上的SDF-1α的濃度表達(dá)卻增加，這勢(shì)必提高了血管壁與血中SDF-1α的濃度梯度，很可能因此而提高了SDF-1α趨化單核細(xì)胞侵入內(nèi)皮下和誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的遷移，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[11]。因此，糖尿病晚期應(yīng)恢復(fù)血管壁與血液中SDF-1α水平的正常比值。本研究發(fā)現(xiàn)，急性糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α較正常對(duì)照組下降，但我們未進(jìn)一步分析胸主動(dòng)脈壁與循環(huán)血液中SDF-1α水平比值的改變。SDF-1α在糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中到底是起保護(hù)還是加速作用，在不同時(shí)期所扮演的角色與作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

落新婦苷是一種二氫黃酮醇。黃酮類藥物能通過(guò)誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，以達(dá)到影響細(xì)胞生物學(xué)功能，抑制或殺滅細(xì)菌菌株，抑制重要的病毒酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶等[12]。落新婦苷可通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1 和 COX-2等炎癥因子而發(fā)揮抗炎作用[13-14]。另有研究顯示，落新婦苷可通過(guò)抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性而調(diào)節(jié)葡萄糖的合成[15]。我們?cè)缙诘难芯匡@示落新婦苷具有抗平滑肌細(xì)胞增殖的作用[16]。此外，落新婦苷通過(guò)抗氧化應(yīng)激在糖尿病腎病及缺血再灌注肝損傷中起到明顯的恢復(fù)作用[8-10]。在本實(shí)驗(yàn)顯示落新婦苷能明顯降低高血糖條件下的血漿中的自由基數(shù)量，顯示了很好的抗氧化作用，與Petacci等[17]的報(bào)道相一致。此外，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)落新婦苷可拮抗糖尿病高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α因子的損傷。

NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥損傷、氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷等反應(yīng)中具有關(guān)鍵性作用。p65作為其活性亞基，其核定位的增加是判斷NF-κB信號(hào)活化的重要證據(jù)。本研究顯示，與正常對(duì)照相比，高糖刺激顯著活化了HUVECs中NF-κB信號(hào)，表現(xiàn)為p65蛋白核定位信號(hào)的顯著增加，而落新婦苷明顯減低了高糖刺激導(dǎo)致的p65蛋白的核定位，提示落新婦苷具有抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)活化作用。這與我們?cè)缙谘芯堪l(fā)現(xiàn)落新婦苷能抑制血管緊張素Ⅱ活化平滑肌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)結(jié)果相似[16]，也一定程度上支持了Diao等[18]發(fā)現(xiàn)落新婦苷能通過(guò)阻斷高遷移率族蛋白B1而抑制糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB磷酸化的結(jié)果的報(bào)道。

NF-κB信號(hào)的活化可以通過(guò)經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。糖尿病或高糖可通過(guò)產(chǎn)生ROS而活化NF-κB信號(hào)[19]，但NF-κB信號(hào)與SDF-1α的關(guān)系較為復(fù)雜。一方面外源性SDF-1α可以活化NF-κB信號(hào)[20]，提示SDF-1α是NF-κB信號(hào)的上游；另一方面，非經(jīng)典途徑活化的NF-κB信號(hào)可以調(diào)節(jié)包括SDF-1α基因在內(nèi)的少部分靶基因的表達(dá)[21-22]，提示SDF-1α是NF-κB下游靶基因。非常有趣的是，經(jīng)典途徑活化的NF-κB信號(hào)可以抑制非經(jīng)典途徑活化NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的SDF-1α的表達(dá)[23]。因此，很可能糖尿病時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在高糖→ROS→非經(jīng)典NF-κB信號(hào)→SDF-1α→經(jīng)典NF-κB信號(hào)→抑制非經(jīng)典NF-κB的信號(hào)反饋環(huán)路，而落新婦苷可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激減弱糖尿病時(shí)經(jīng)典NF-κB信號(hào)的活化而弱化了對(duì)非經(jīng)典NF-κB信號(hào)活化介導(dǎo)的SDF-1α表達(dá)的負(fù)性調(diào)控，因而最終表現(xiàn)為SDF-1α表達(dá)的增加，但這一假設(shè)仍需要進(jìn)一步的探討。

總之，本研究結(jié)果顯示在高糖應(yīng)激的條件下，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的ROS并抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1α的表達(dá)，落新婦苷可以增加高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1α，減少ROS釋放和抑制NF-κB信號(hào)活化。落新婦苷在糖尿病血管并發(fā)癥防治上的確切的藥用價(jià)值及其作用機(jī)制仍需更多的深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of astilbin on expression of SDF-1α in high glucose-treated vascular endothelial cells

WANG Ke-ke1, 2, DENG Ya-yan1, 4, LAI Jian-hong1, ZHANG Bang-yan1, HUANG Chen1, SHEN Zhi-hua3, JIANG Han-guo1, 2, JIE Wei1, 2

(1DepartmentofPathology,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;2PathologicalDiagnosisandResearchCentre,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China;3DepartmentofPathophy-siology,SchoolofBasicMedicalScience,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;4DepartmentofPediatrics,FirstPeople’sHospitalofZhaoqingCity,Zhaoqing526021,China.E-mail:wei.jie@gdmc.edu.cn)

AIM: To explore the effects of astilbin on high glucose-induced stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α) expression in vascular endothelial cells.METHODS: The acute diabetic SD rats were established by intraperitoneally injection of streptozotocin. The plasma malondialdehyde (MDA) and H2O2levels were measured by thiobarbituric acid method and UV spectrophotometry, respectively. The SDF-1α expression in the endothelial cells of thoracic aorta was assessed by immunofluorescent staining. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were treated with high glucose. The expression of SDF-1α in HUVECs was detected by real-time PCR, ELISA and immunofluorescence. Flow cytometry was adopted to analyze the cell cycle distribution. The expression and intracellular localization of p65 was assessed by immunofluorescent staining.RESULTS: The plasma levels of MDA and H2O2in diabetic rats were higher than those in the normal controls. The expression of SDF-1α in the aortic endothelial cells of diabetic rats was decreased as compared with the normal controls. Astilbin alleviated plasma MDA and H2O2levels in the diabetic rats and increased SDF-1α in the thoracic aorta endothelial cells.Invitrostimulation with high glucose significantly reduced the expression of SDF-1α in the HUVECs, which was restored by astilbin. High glucose stimulation increased the proportion of S phase in the HUVECs, and astilbin reduced S phase proportion. High glucose increased p65 nuclear translocation in the HUVECs, which was attenuated by astilbin treatment. CONCLUSION: Astilbin increases the expression of SDF-1α and reduces oxidative stress and NF-κB activation in high glucose-stimulated vascular endothelial cells.

High glucose; Astilbin; Stromal cell-derived factor-1α; Human umbilical vein endothelial cells

1000- 4718(2016)04- 0610- 08

2015- 10- 13

2015- 12- 14

廣東省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No. 1057112014);廣東醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(No. 2011ZZZF002);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81170121)

Tel: 0759-2388584; E-mail: wei.jie@gdmc.edu.cn

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.006

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